A r t i c l e C i t a t i o n : Z a h i d M a h m o o d , V i j e s h w a r V e r m a , I n s h a d A l i k h a n a n d M o h m m a d A f z a l Z a r g a r I n v i t r o a n d I n v i v o p o t e n t i a t i o n o f a m p o t e r i c i n - B b y f l a v o n o i d a g a i n s t d i f f e r e n t f u n g a l s t r a i n s J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 6 ) 6 ( 4 ) : 2 0 3 4 - 2 0 4 0 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y I n v i t r o a n d i n v i v o p o t e n t i a t i o n o f a m p o t e r i c i n - B b y f l a v o n o i d a g a i n s t d i f f e r e n t f u n g a l s t r a i n s K e y w o r d s : F l a v o n o i d s , m i n i m i u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n , k i l l k i n e t i c s , a m p h o t e r i c i n - B A B S T R A C T : S y n e r g i s t i c e f f e c t s o f 1 8 f l a v o n o i d s ( 1 1 g l y c o s i d e s a n d f l a v o n e s , 0 1 f l a v o n e s d i g l y c o s i d e , 0 4 c h a l c o n e s a n d 0 2 a g l y c o n e s ) i n c o m b i n a t i o n w i t h d i f f e r e n t a n t i - f u n g a l a g e n t s a g a i n s t f u n g a l s t r a i n s w e r e i n v e s t i g a t e d . T h e a g a r d i f f u s i o n a s s a y o f t h e s e f l a v o n o i d s w i t h d i f f e r e n t a n t i - f u n g a l a g e n t s w a s t e s t e d . T h e M i n i m u m I n h i b i t o r y C o n c e n t r a t i o n ( M I C ) v a l u e s o f e a c h o f t h e f l a v o n o i d s w i t h d i f f e r e n t a n t i - f u n g a l a g e n t s w e r e d e t e r m i n e d b y u s i n g c h e c k e r b o a r d b r o t h m i c r o d i l u t i o n a s s a y . F l a v o n e s d i g l y c o s i d e ( 3 , 5 - d i h y d r o x y f l a v o n e s 7 - O - b - D - g l u c u r o n i d e - 4 - O - b - D - g l u c o p y r a n s i d e ) p o t e n t i a t e d t h e i n v i t r o a n d i n v i v o a c t i v i t y a g a i n s t f u n g a l s t r a i n s . T h e f l a v o n e s d i g l y c o s i d e r e d u c e d M I C o f a m p h o t e r i c i n - B t o o n e h a l f a g a i n s t d i f f e r e n t f u n g a l s t r a i n s , C a n d i d a a l b i c a n s , C a n d i d a k r u s e i , C a n d i d a p a r a p s i l o s i s , C a n d i d a t r o p i c a l i s a n d C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s 1 2 0 2 . A l t h o u g h m o d e r a t e c h a n g e b e t w e e n i n v i t r o a n d i n v i v o s t u d i e s h a v e b e e n f o u n d , t h e e l u c i d a t i o n o f t h e m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n f l a v o n o i d a c t i o n w i l l h a v e m a n y h e a l t h b e n e f i t s t o m a n . I n c o n c l u s i o n , t h e s e f i n d i n g s s u g g e s t e d t h a t f l a v o n o i d c o m b i n a t i o n r e g i m e n s m a y b e c o n s i d e r e d a s a n u s e f u l c a n d i d a t e f o r t h e t r e a t m e n t o f f u n g a l i n f e c t i o n . 2 0 3 4 - 2 0 4 0 | J R B | 2 0 1 6 | V o l 6 | N o 4 T h i s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 4 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : Z a h i d M a h m o o d 1 V i j e s h w a r V e r m a 2 I n s h a d A l i k h a n 3 a n d M o h m m a d A f z a l Z a r g a r 1 I n s t i t u t i o n : 1 . D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , U n i v e r s i t y o f K a s h m i r , S r i n a g a r , 1 9 0 0 0 6 , I n d i a . 2 . S h r i M a t a V a i s h n o D e v i U n i v e r s i t y , 1 8 2 3 2 0 , K a t r a . 3 . M i c r o b i o l o g y D i v i s i o n s , I n d i a n I n s t i t u t e o f I n t e g r a t i v e M e d i c i n e , 1 8 0 0 0 1 , J a m m u . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : M o h m m a d A f z a l Z a r g a r W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / d o c u m e n t s / R A 0 5 8 9 . p d f D a t e s : R e c e i v e d : 0 2 F e b 2 0 1 6 A c c e p t e d : 0 4 A p r i l 2 0 1 6 P u b l i s h e d : 1 1 J u n e 2 0 1 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l I S S N N o : P r i n t : 2 2 3 1 – 6 2 8 0 ; O n l i n e : 2 2 3 1 - 6 2 9 9 O r i g i n a l R e s e a r c h

I N T R O D U C T I O N F l a v o n o i d s b e l o n g t o t h e l a r g e g r o u p o f p l a n t ‘ s p o l y p h e n o l s . T h e y h a v e p r o m i n e n t r o l e i n t h e p i g m e n t a t i o n a n d p r o t e c t i o n o f p l a n t s a g a i n s t d i f f e r e n t e x t e r n a l a g e n t s . I n r e c e n t y e a r s , t h e r e i s a r a i s i n g i n t e r e s t i n f l a v o n o i d s m o s t l y b e c a u s e o f t h e i r a n t i o x i d a n t , a n t i - i n f l a m m a t o r y , a n t i - a l l e r g i c , a n t i m i c r o b i a l a n d a n t i c a n c e r a c t i v i t y . F l a v o n o i d s a r e t h e b u i l d i n g b l o c k o f p o l y p h e n o l i c c o m p o u n d s t h a t c a n b e f o u n d i n v a r i o u s f o o d s . T h e y c o m m o n l y h a v e a g e n e r i c s t r u c t u r e c o n s i s t i n g o f t w o a r o m a t i c r i n g s ( A a n d B r i n g s ) l i n k e d b y t h r e e c a r b o n s t h a t a r e u s u a l l y i n a n o x y g e n a t e d h e t e r o c y c l i c r i n g ( C r i n g ) . S o f a r , o v e r 4 0 0 0 s t r u c t u r a l l y u n i q u e f l a v o n o i d s h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m p l a n t s o u r c e s ( H a r b o r n a n d W a l b u c h , 2 0 0 0 ) . D u r i n g 1 9 9 0 ’ s , f l a v o n o i d s w e r e s h o w n t o p o s s e s s s e v e r a l b i o l o g i c a l e f f e c t s , r e l a t e d t o h u m a n h e a l t h ( H a r b o r n a n d W i l l i a m s , 2 0 0 0 ) m a k i n g i t n a t u r a l t o s e a r c h f o r e v e n m o r e e f f e c t i v e c o m p o u n d s a m o n g t h e s o u r c e s o f t h o s e p h e n o l i c c o m p o u n d s i n t h e p l a n t k i n g d o m . T h e r e i s a l s o a p o s s i b i l i t y t h a t t h e n e w c o m p o u n d s c o u l d p o s s e s s a n o t e d b u t s t r o n g e r a c t i v i t y i n c o m p a r i s o n t o k n o w n s u b s t a n c e s . T h e s t r u c t u r a l d i v e r s i t y o f t h e n a t u r a l c o m p o u n d s a r e g r e a t e r t h a n t h a t b y t h e s y n t h e t i c o n e s ( H a r v e y , 1 9 9 9 ) . T h e n e w f l a v o n o i d s t r u c t u r e c a n b e u s e d a s p h a r m a c o l o g i c a l l y u n s p e c i f i c l e a d s f o r m o l e c u l a r d e s i g n i n g o f d r u g s ( N a h r s t e d , 1 9 9 7 ) . T h e a n t i m i c r o b i a l a n d r e s i s t a n c e m o d i f y i n g p o t e n t i a l s o f n a t u r a l l y o c c u r r i n g f l a v o n o i d s a n d p o l y p h e n o l i c c o m p o u n d s h a v e b e e n r e p o r t e d i n o t h e r s t u d i e s b y C u s h n i e a n d L a m b ( 2 0 0 5 ) a n d S a t o e t a l . ( 2 0 0 4 ) . T h e s y n e r g i s t i c e f f e c t f r o m t h e a s s o c i a t i o n o f a n t i b i o t i c a n d p l a n t e x t r a c t s a g a i n s t r e s i s t a n t b a c t e r i a l e a d s t o n e w c h o i c e s f o r t h e t r e a t m e n t o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s . T h i s e f f e c t e n a b l e s t h e u s e o f r e s p e c t i v e a n t i b i o t i c w h e n i t i s n o l o n g e r e f f e c t i v e b y i t s e l f d u r i n g t h e r a p e u t i c t r e a t m e n t ( N a s c i m e n t o e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h e a p p l i c a t i o n o f s y n e r g i s t i c p r i n c i p l e i s e v i d e n t i n c o m m e r c i a l p r e p a r a t i o n s f o r t h e t r e a t m e n t o f v a r i o u s i n f e c t i o n s ( e g . t h e a n t i b i o t i c , A u g m e n t i n ) . T r a d i t i o n a l h e a l e r s o f t e n u s e c o m b i n a t i o n s o f p l a n t s t o t r e a t o r c u r e d i s e a s e s ( K a m a t o u e t a l . , 2 0 0 6 ) . M e d i c i n a l p l a n t s h a v e b e e n u s e d i n m a n y f o r m s o v e r t h e y e a r s t o t r e a t , m a n a g e o r c o n t r o l m a n ’ s a i l m e n t s ( P r e s c o t t e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h e r e f o r e , a n y e f f o r t t o f u r t h e r e x p l o r e t h e m e d i c i n a l o r n a t u r a l p r o d u c t s f r o m m a n ’ s b o t a n i c a l f l o r a t o w a r d s i m p r o v i n g h e a l t h c a r e d e l i v e r y d e s e r v e s a t t e n t i o n . T h e p r e s e n c e o f e f f l u x p u m p s a n d M u l t i D r u g R e s i s t a n c e ( M D R ) p r o t e i n s i n a n t i b i o t i c r e s i s t a n t o r g a n i s m s c o n t r i b u t e s i g n i f i c a n t l y t o t h e i n t r i n s i c a n d a c q u i r e d r e s i s t a n c e i n t h e s e p a t h o g e n s ( O l u w a t u y i e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e d i s c o v e r y a n d d e v e l o p m e n t o f n e w c o m p o u n d s t h a t e i t h e r b l o c k o r c i r c u m v e n t r e s i s t a n c e m e c h a n i s m s c o u l d i m p r o v e t h e c o n t a i n m e n t , t r e a t m e n t , a n d e r a d i c a t i o n o f t h e s e s t r a i n s ( O l u w a t u y i e t a l . , 2 0 0 4 ; S i b a n d a a n d O k o h , 2 0 0 8 ) . C o m b i n a t i o n t h e r a p y c a n b e u s e d t o e x p a n d t h e a n t i m i c r o b i a l s p e c t r u m , t o p r e v e n t t h e e m e r g e n c e o f r e s i s t a n t m u t a n t s , t o m i n i m i z e t o x i c i t y , a n d t o o b t a i n s y n e r g i s t i c a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y ( P a n k e y e t a l . , 2 0 0 5 ) . O n e w a y t o o v e r c o m e a n t i b i o t i c - r e s i s t a n t b a c t e r i a i s t h r o u g h t h e u s e o f n e w a n t i m i c r o b i a l c o m p o u n d s a n d / o r c o m b i n a t i o n t h e r a p y . T h i s s t u d y w a s c a r r i e d o u t t o s e e k a n a p p r o a c h c o n s i d e r e d a s a n a l t e r n a t i v e t r e a t m e n t i n t e r m s o f c o m b i n a t i o n t h e r a p y b e t w e e n f l a v o n o i d s a n d a n a v a i l a b l e a n t i b i o t i c a g a i n s t d i f f e r e n t p a t h o g e n s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S A s t r u c t u r a l l y d i v e r s e l i b r a r y o f 1 8 f l a v o n i o d s w a s o b t a i n e d f r o m N a t u r a l P r o d u c t C h e m i s t r y L a b , I n d i a n I n s t i t u t e o f I n t e g r a t i v e M e d i c i n e ( I I I M ) f o r m e r l y k n o w n a s R e g i o n a l R e s e a r c h L a b o r a t o r y ( C S I R ) J a m m u . A m p h o t e r i c i n - B w a s p u r c h a s e d f r o m ( s i g m a A l d r i c h C O . S t . L o u i s , M O , U S A ) . T h e m e d i a c o m p o n e n t S a b o u r a d M a h m o o d e t a l . , 2 0 1 6 2 0 3 5 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 6 ) 6 ( 4 ) : 2 0 3 4 - 2 0 4 0 F u n g a l c u l t u r e s Z o n e o f i n h i b i t i o n ( m m ) ( M e a n ) A M B ( 1 µ g / m l ) F l a v o n e s d i g l y c o s i d e C . a l b i c a n s V - 0 1 - 1 9 1 2 1 3 6 C . k r u s e i 2 3 2 8 C . p a r a p s i l o s i s 2 7 3 2 C . t r o p i c a l i s 2 8 3 3 C . n e o f o r m a n i s 1 2 0 2 2 5 3 0 T a b l e 1 . D i s k d i f f u s i o n a s s a y s o f f l a v o n e s d i g l y c o s i d e a n d s t a n d a r d d r u g A M B

J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 6 ) 6 ( 4 ) : 2 0 3 4 - 2 0 4 0 2 0 3 6 M a h m o o d e t a l . , 2 0 1 6 D e x t r o s e a g a r ( B e c t o n - D i c k n s o n ) a n d R P M I ( S i g m a , S t e i n h e i m , G e r m a n y ) w e r e p u r c h a s e d f o r t h e c u l t u r e o f f u n g i s t r a i n s . T h e f u n g a l s t r a i n s u s e d i n t h i s s t u d y v i z C a n d i d a a l b i c a n s V - 0 1 - 1 9 1 , C a n d i d a k r u s e i A T C C , C a n d i d a p a r a p s i l o s i s A T C C , C a n d i d a t r o p i c a l i s A T C C a n d C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s 1 2 0 2 w e r e o b t a i n e d f r o m t h e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n ( M a n a s s a s . V a . ) . T o e v a l u a t e t h e g e n e r a l a n t i f u n g a l a c t i v i t y o f t h e f l a v o n i o d s , a g a r d i f f u s i o n a s s a y w a s u s e d . S t o c k s o l u t i o n o f 1 m g / m l o f f l a v o n o i d a n d a n t i f u n g a l d r u g w a s p r e p a r e d i n D M S O / d i s t i l l e d w a t e r . S a b o u r a d D e x t r o s e A g a r ( S D A ) w a s p r e p a r e d f o r c u l t u r i n g f u n g a l s t r a i n s . 5 0 0 µ l f r o m 0 . 5 M c f a r l a n d o f t h e s u s p e n s i o n w a s s t a n d a r d i s e d b y a d j u s t i n g t h e o p t i c a l d e n s i t y t o 0 . 1 a t 6 0 0 n m w a v e l e n g t h ( S h i m a d z u U V - v i s s p e c t r o p h o t o m e t e r ) . I t w a s p o u r e d i n t h e a g a r f l a s k a n d m i x e d a n d p o u r e d i n t o P D 1 5 0 m m s t e r i l e p l a s t i c p l a t e s . T h e p l a t e s w e r e s e t d o w n a n d 6 m m w e l l s w e r e p u n c h e d . 5 0 µ l o f r e s p e c t i v e d i l u t i o n w e r e p i p e t t e d i n t o t h e w e l l s . P l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 2 4 h . M i c r o b i a l g r o w t h i n h i b i t i o n w a s d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e z o n e s o f i n h i b i t i o n u s i n g a t r a n s p a r e n t r u l e r . E v a l u a t i o n s o f t h e s u s c e p t i b i l i t y o f f u n g a l c u l t u r e s w e r e m a d e b y t h e m i c r o b r o t h d i l u t i o n m e t h o d a s p e r N C C L S d o c u m e n t M 2 7 - A ( N C C L S , 2 0 0 0 ) . T h e f u n g i u s e d a s i n o c u l a w e r e g r o w n o v e r n i g h t o n S a b o u r a u d d e x t r o s e a g a r a t 3 7 ° C f o r 2 4 h . T e s t s w e r e p e r f o r m e d i n R P M I 1 6 4 0 ( G i b c o - B R L ) b u f f e r e d t o p H 7 . 0 w i t h 0 . 1 6 5 M M o r p h O l i n e P r o p a n e S u l p h o n i c a c i d ( M O P S ; S i g m a ) . I n o c u l u m e f f e c t s w e r e d e t e r m i n e d a s p e r N C C L S ( 2 0 0 0 ) , e x c e p t t h a t s t r a i n s w e r e s u s p e n d e d t o a t u r b i d i t y e q u i v a l e n t t o t h a t o f a 0 . 5 M c F a r l a n d s t a n d a r d i n 0 . 9 % ( w / v ) N a C l a n d w e r e f u r t h e r d i l u t e d i n 0 . 9 % N a C l t o a c h i e v e t h e d e s i r e d i n o c u l u m l e v e l s . I n o c u l u m d e n s i t i e s w e r e v e r i f i e d b y d e t e r m i n i n g t h e n u m b e r o f v i a b l e c o l o n i e s p e r m i l l i l i t r e o n S a b o u r a u d d e x t r o s e a g a r a f t e r s e r i a l d i l u t i o n s i n 0 . 9 % N a C l . T h e s t o c k s o l u t i o n o f t h e f l a v o n i o d s a n d a n t i f u n g a l d r u g w e r e p r e p a r e d i n D M S O / d i s t i l l e d w a t e r a n d w a s s e r i a l l y d i l u t e d i n t h e m i c r o t i t r e p l a t e s b y t w o f o l d d i l u t i o n s o f a n t i f u n g a l d r u g i n c o m b i n a t i o n w i t h t w o f o l d d i l u t i o n s o f f l a v o n i o d s i n U - b o t t o m 9 6 - w e l l m i c r o t i t r e p l a t e s . T h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f a n t i f u n g a l a g e n t s r a n g e d f r o m 0 . 1 2 µ g / m l t o 6 4 µ g / m l a n d f o r f l a v o n o i d s f r o m 0 . 8 µ g / m l t o 5 0 µ g / m l . T h e c u l t u r e s w e r e t h e n d i l u t e d t o 1 : 5 0 i n n o r m a l s a l i n e a n d 1 : 2 0 i n R P M I m e d i a t o g e t f i n a l i n o c u l u m s ( 1 - 2 × 1 0 3 c f u / m l ) . E a c h w e l l o f t h e m i c r o t i t r e p l a t e w a s t h e n i n o c u l a t e d w i t h 1 0 0 µ l o f d i l u t e d i n o c u l u m a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 4 8 h . T h e M I C w a s c o n s i d e r e d t o b e t h e l o w e s t c o n c e n t r a t i o n o f t h e c o m p o u n d t h a t i n h i b i t e d t h e v i s i b l e g r o w t h o f f u n g i . T i m e - k i l l e x p e r i m e n t D e t e r m i n a t i o n o f t h e r a t e o f k i l l o f t h e f l a v o n e s d i g l y c o s i d e w a s d o n e f o l l o w i n g t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d b y A i y e g o r o e t a l . ( 2 0 0 8 ) w i t h s l i g h t m o d i f i c a t i o n s . A m p h o t e r i c i n - B w a s t e s t e d a t 0 . 2 5 a n d 0 . 5 m g / m l r e s p e c t i v e l y . F l a v o n e s d i g l y c o s i d e a t a c o n c e n t r a t i o n o f 5 0 m g / m l w a s c o m b i n e d w i t h a m p h o t e r i c i n - B a t a c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 2 5 a n d 0 . 5 m g / m l . A m p h o t e r i c i n - B w a s a l s o t e s t e d a l o n e a t 5 0 m g / m l . T i m e - k i l l s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d a t a n i n o c u l u m o f 2 x 1 0 6 c o l o n y f o r m i n g u n i t i n 2 0 m l v o l u m e o f t h e m e d i u m . T h e f l a s k s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C o n a n o r b i t a l s h a k e r a t 1 2 0 r p m . O n e f l a s k o f i n o c u l a t e d S a b o u r a u d d e x t r o s e b r o t h w i t h n o d r u g s e r v e d a s a c o n t r o l . C o l o n y c o u n t s w e r e p e r f o r m e d o n t h e c o n t r o l s u s p e n s i o n a t t i m e z e r o a n d o n t h e c o n t r o l a s w e l l O r g a n i s m s M I C ( µ g / m l ) A M B A M B + 0 . 2 A M B + 0 . 4 A M B + 0 . 8 A M B + 1 . 5 6 A M B + 3 . 1 2 A M B + 6 . 2 5 A M B + 1 2 . 5 C . a l b i c a n s V - 0 1 - 1 9 1 0 . 5 0 . 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 C . k r u s e i 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 1 2 0 . 1 2 0 . 1 2 0 . 1 2 0 . 1 2 C . p a r a p s i l o s i s 0 . 5 0 . 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 C . t r o p i c a l i s 0 . 5 0 . 5 0 . 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n i s 1 2 0 2 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 1 2 0 . 1 2 0 . 1 2 0 . 1 2 0 . 1 2 0 . 1 2 T a b l e 2 . C o m b i n a t i o n s t u d i e s o f f l a v o n e s d i g l y c o s i d e w i t h A M B