A B S T R A C T : L e a d p o l l u t i o n i s a w o r l d w i d e e n v i r o n m e n t a l c h a l l e n g e . T h e p r e s e n t s t u d y w a s i n t e n d e d t o e v a l u a t e t h e l e a d c o n t e n t o f t h e p o t m a r i g o l d ( C a l e n d u l a o f f i c i n a l i s L . ) p l a n t s c o l l e c t e d f r o m a t e s t f i e l d a d j a c e n t t o m o t o r w a y . T h e t e s t f i e l d w a s s e p a r a t e d f r o m t h e h e a v i l y t r a f f i c k e d ( > 1 0 , 0 0 0 v e h i c l e s / d ) m o t o r w a y b y t h e b l u e s p r u c e h e d g e r o w w h i c h w a s l o c a t e d t r a n s v e r s e l y i n a d i s t a n c e o f 1 2 m f r o m r o a d s i d e . T h e p o t m a r i g o l d i n f l o r e s c e n c e s ( c o m m o n l y u s e d a s p h a r m a c e u t i c a l h e r b s ) a n d l e a v e s w e r e c o l l e c t e d a t d i s t a n c e s o f 2 0 t o 8 0 m f r o m t h e r o a d s i d e ; t h e l e a d c o n t e n t w a s e s t i m a t e d u s i n g t h e d i t h i z o n e l e a d d e t e r m i n a t i o n t e c h n i q u e . T h e 2 . 5 m h i g h d e n s e s p r u c e h e d g e r o w r e d u c e d t h e l e a d c o n t a m i n a t i o n o f p o t m a r i g o l d l e a v e s f o r 4 0 m f r o m t h e h e d g e r o w ; t h e a v e r a g e l e a d c o n t e n t o f l e a v e s w a s 1 2 . 5 µ g p r o 1 0 0 c m 2 . C o n t r a r y , a t t h e 6 0 m d i s t a n c e t o t h e h e d g e r o w , a p e a k i n l e a d c o n t e n t ( 3 3 µ g / 1 0 0 c m 2 ) w a s f o u n d . T h e a b s o l u t e l e a d c o n t e n t s f o r t h e i n f l o r e s c e n c e s w e r e m u c h l o w e r ( 2 - 8 µ g / 1 0 0 c m 2 ) a n d n o u n i d i r e c t i o n a l i m p a c t o f t h e h e d g e r o w o n t h e l e a d c o n t e n t o f i n f l o r e s c e n c e s w a s f o u n d . I n c o n c l u s i o n , t h e 2 . 5 m h i g h d e n s e s p r u c e h e d g e r o w w a s f o u n d t o r e d u c e t h e l e a d c o n t a m i n a t i o n o f p o t m a r i g o l d l e a v e s f o r a d i s t a n c e u p t o 4 0 m f r o m t h e h e d g e r o w . T h e l e a d c o n t e n t o f p o t m a r i g o l d i n f l o r e s c e n c e s w a s v a r i a b l e a n d i t d e p e n d s o n a d d i t i o n a l e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s . C o n s e q u e n t l y , t o r e d u c e t h e h e a l t h r i s k s i t i s r e c o m m e n d e d t o s h i e l d t h e p o t m a r i g o l d c u l t i v a t i o n f i e l d f r o m t h e t r a f f i c - o r i g i n a t e d l e a d p o l l u t i o n w i t h a n a p p r o p r i a t e h e d g e r o w . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y T h e i m p a c t o f h e d g e r o w t o t h e l e a d c o n t e n t i n p l a n t s c u l t i v a t e d a d j a c e n t t o m o t o r w a y K e y w o r d s : L e a d c o n t e n t , l e a d , p o t m a r i g o l d , C a l e n d u l a o f f i c i n a l i s L . , e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s , d i t h i z o n e l e a d d e t e r m i n a t i o n . 7 2 6 - 7 3 2 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 8 T h i s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : A n d r e s M e o s , V a l l o M a t t o , A i n R a a l . I n s t i t u t i o n : D e p a r t m e n t o f P h a r m a c y , U n i v e r s i t y o f T a r t u , N o o r u s e 1 , 5 0 4 4 1 T a r t u , E s t o n i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : A i n R a a l . E m a i l : a i n . r a a l @ u t . e e W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / d o c u m e n t s / R A 0 3 0 9 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 2 4 N o v 2 0 1 2 A c c e p t e d : 0 4 D e c 2 0 1 2 P u b l i s h e d : 2 4 D e c 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : A n d r e s M e o s , V a l l o M a t t o , A i n R a a l . T h e i m p a c t o f h e d g e r o w t o t h e l e a d c o n t e n t i n p l a n t s c u l t i v a t e d a d j a c e n t t o m o t o r w a y . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 2 6 - 7 3 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l O r i g i n a l R e s e a r c h

I N T R O D U C T I O N T h e u s e o f m e d i c i n a l p l a n t s a s r e m e d i e s i s a n i n c r e a s i n g t r e n d b o t h i n d e v e l o p e d a n d s o u r c e l i m i t e d c o u n t r i e s ( H a l l a n d N a z i r , 2 0 0 5 ) . T h e m e d i c i n a l p l a n t s h a v e b e e n c o l l e c t e d f r o m t h e i r n a t u r a l h a b i t a t s f o r m i l l e n n i a , h o w e v e r d u e t o t h e s t a n d a r d i z a t i o n a n d q u a l i t y i s s u e s d u r i n g t h e l a s t 5 0 y e a r s t h e c u l t i v a t e d o f m e d i c i n a l p l a n t s h a v e b e c o m e a n i m p o r t a n t s o u r c e o f r a w m a t e r i a l f o r n a t u r a l l y o r i g i n a t e d p h a r m a c e u t i c a l f o r m u l a t i o n s . T h e c u l t i v a t i o n o f p h a r m a c e u t i c a l p l a n t s f a c e m a n y c h a l l e n g e s , a m o n g t h e m t h e p o l l u t i o n w i t h h e a v y m e t a l s i s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t p r o b l e m s t o b e a d d r e s s e d ( E r n s t , 2 0 0 4 ; F u e t a l . , 2 0 0 9 ; J o r d a n e t a l . , 2 0 1 0 ) . T h o u g h t h e u s u a l a d m i n i s t r a t i o n o f r e m e d i e s o f n a t u r a l o r i g i n i s t i m e l y l i m i t e d , t h e p o t e n t i a l h e a v y m e t a l c a u s e d h e a l t h r i s k i s a u g m e n t e d d u e t o t w o k e y f a c t o r s . O n e h a n d , t h e n a t u r a l m e d i c i n e s a r e c o n c e n t r a t e s o f m e d i c a l p l a n t s a n d s e c o n d l y , t h e p a t i e n t s m a y b e m o r e s u s c e p t i b l e t o a n y d a m a g i n g f a c t o r d u e t o t h e i r i l l n e s s . W o r l d w i d e , t h e r e a r e m a n y a l a r m i n g r e p o r t s i n d i c a t i n g t h a t t h e c o l l e c t e d m e d i c i n a l p l a n t s , b o t h f r o m n a t u r a l h a b i t a t s a s w e l l a s f r o m m e d i c i n a l p l a n t f i e l d s c o n t a i n h e a v y m e t a l a b o v e l i m i t s s e t b y t h e l o c a l a u t h o r i t i e s o r i n t e r n a t i o n a l o r g a n i z a t i o n s ( C a l d a s a n d M a c h a d o , 2 0 0 4 ; N a i t h a n i a n d K a k k a r , 2 0 0 5 ; O b i e t a l . , 2 0 0 6 ; M i s h r a e t a l . , 2 0 0 7 ; G a s s e r e t a l . , 2 0 0 9 ; M e e n a e t a l . , 2 0 0 9 ; B a y e a n d H y m e t e , 2 0 1 0 ) . F r o m t h e o t h e r s i d e , s e v e r a l m e d i c i n a l p l a n t s p e c i e s c o u l d a c t a s t h e b i o i n d i c a t o r s f o r p o l l u t a n t s ( S a r a l a T h a m b a v a n i a n d P r a t h i p a , 2 0 1 2 ) . I n o u r p r e v i o u s s t u d y i t w a s u n v e i l e d t h a t i n a c o u n t r y w i t h a b o l i s h e d u s e o f l e a d c o n t a i n i n g f u e l s t i l l t r a c e s o f l e a d i n m e d i c i n a l p l a n t s c a n b e d e t e c t e d , t h o u g h t h e m a j o r c o n t r i b u t o r o f t h e l e a d p o l l u t i o n w a s n o t t h e t r a f f i c i n t e n s i t y b u t t h e a m o u n t o f p r e c i p i t a t e s i n t h e t e s t f i e l d a r e a ( M e o s e t a l . , 2 0 1 1 ) . T h e p r e s e n t s t u d y w a s a i m e d t o e v a l u a t e t h e l e a d c o n t e n t i n p o t m a r i g o l d ( C a l e n d u l a o f f i c i n a l i s L . ) i n f l o r e s c e n c e s a n d l e a v e s c o l l e c t e d f r o m a t e s t f i e l d a t v a r i o u s d i s t a n c e s f r o m a h e a v i l y t r a f f i c k e d m o t o r w a y i n T a r t u , E s t o n i a . T h e t e s t f i e l d w a s s e p a r a t e d f r o m t h e m o t o r w a y b y a d e n s e s p r u c e 2 . 5 - 3 m h i g h h e d g e r o w . T h e s h i e l d i n g f a c t o r o f a h e d g e r o w i s n o t s t u d i e d s o f a r i n t h e c o n t e x t o f t h e c u l t i v a t i o n o f t h e p h a r m a c e u t i c a l p l a n t s . T h e c o n t e n t o f t h e c a r o t e n o i d s a n d f l a v o n o i d s i n p o t m a r i g o l d d i f f e r e n t c u l t i v a r s g r o w i n g i n E s t o n i a i s w e l l d o c u m e n t e d . P o t m a r i g o l d c r u d e d r u g a n d p r e p a r a t i o n s a r e w i d e l y u s e d b o t h i n E s t o n i a n f o l k a n d l a t e s t t r a d i t i o n a l m e d i c i n e f o r i n t e r n a l ( i n f u s i o n s , t i n c t u r e s ) a s w e l l e x t e r n a l ( o i n t m e n t s ) u s e ( T o o m e t a l . , 2 0 0 7 ; R a a l e t a l . , 2 0 0 9 ; R a a l a n d K i r s i p u u , 2 0 1 1 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e o b j e c t i v e t o c h o o s e t h e p o t m a r i g o l d p l a n t s w a s p r i m a r i l y t h e f a c t t h a t t h e p o t m a r i g o l d p l a n t s a r e e a s y t o c u l t i v a t e a n d t h a t t h e a n t h e s i s p e r i o d i s s u f f i c i e n t t o c o l l e c t t h e c r i t i c a l a m o u n t o f i n f l o r e s c e n c e s f o r l e a d c o n t e n t e s t i m a t i o n . T h u s , i n t h e p r e s e n t s t u d y t h e p o t m a r i g o l d w a s u s e d a s t h e m o d e l p l a n t o f t h e c u l t i v a t e d m e d i c i n a l p l a n t s i n E s t o n i a . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S P l a n t m a t e r i a l T h e p l a n t m a t e r i a l ( p o t m a r i g o l d i n f l o r e s c e n c e s a n d l e a v e s ) w a s c o l l e c t e d i n A u g u s t t o m i d - S e p t e m b e r f r o m a e x p e r i m e n t a l g a r d e n o f t h e U n i v e r s i t y o f T a r t u l o c a t e d a t h e a v i l y t r a f f i c k e d ( > 1 0 , 0 0 0 v e h i c l e s / d ) m o t o r w a y c l o s e t o t h e a d m i n i s t r a t i v e t o w n b o r d e r o f t h e T a r t u C i t y , E s t o n i a ( c o o r d i n a t e s a r e N : 5 8 . 3 6 1 9 4 ; E : 2 6 . 6 7 8 8 9 ) . T h e t e s t f i e l d w a s s e p a r a t e d f r o m t h e m o t o r w a y b y t h e d e n s e , 2 . 5 - 3 m h i g h b l u e s p r u c e ( P i c e a p u n g e n s E n g e l m . f . g l a u c a ( R e g e l ) B e i s s n . ) h e d g e r o w w h i c h w a s l o c a t e d t r a n s v e r s e l y i n a d i s t a n c e o f 1 2 m f r o m r o a d s i d e . T h e h e d g e r o w c o n t a i n e d a l s o a f e w W o l f ' s l i l a c ( S y r i n g a w o l f i i C . K . S c h n e i d . ) b u s h e s b u t t h e s e l o w a n d r a r e i n d i v i d u a l b u s h e s w e r e n o t c o n s i d e r e d t o c o n t r i b u t e m u c h t o t h e o v e r a l l s h i e l d i n g e f f e c t o f t h e h e d g e r o w . T h e w i d t h o f t h e h e d g e r o w w a s a r o u n d 2 m ( a t t h e 1 m f r o m g r o u n d ) a n d d i d n o t c o n t a i n a n y g a p s M e o s e t a l . , 2 0 1 2 7 2 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 2 6 - 7 3 2

b e t w e e n t h e i n d i v i d u a l s p r u c e s . T h e t e s t f i e l d r e a c h e d f r o m t h e h e d g e r o w l o n g i t u d i n a l l y f o r 2 0 0 m a n d t r a n s v e r s e l y t o 1 0 0 m . T h e p o t m a r i g o l d s e e d s o f t h e p r e s e n t s t u d y w e r e d i s s e m i n a t e d i n s p r i n g w i t h c o n s t a n t 1 0 m c r o s s w i s e i n t e r v a l s s t a r t i n g 2 0 m f r o m r o a d s i d e ( i . e . , 8 m f r o m t h e h e d g e r o w ) t o 8 0 m . T h e s e e d s w e r e o b t a i n e d f r o m p o t m a r i g o l d ( u n k n o w n c u l t i v a r ) p l a n t s c u l t i v a t e d a n d c o l l e c t e d a t t h e s a m e f i e l d a y e a r b e f o r e . T h e f i r s t s a m p l e s o f p l a n t m a t e r i a l w e r e t a k e n f r o m a d i s t a n c e 2 0 m o f f t h e m o t o r w a y , a n d t h e n w i t h e a c h 1 0 m i n t e r v a l s f a r t h e r f r o m t h e m o t o r w a y , t h e s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d w e e k l y d u r i n g s e v e n c o n s e c u t i v e w e e k s a l w a y s f r o m t h e s a m e s p o t . T h e l e a f a n d i n f l o r e s c e n c e s a m p l e s w e r e t a k e n f r o m e a c h c o l l e c t i o n s p o t . T h e s u r f a c e a r e a o f t h e p l a n t m a t e r i a l w a s c a l c u l a t e d u s i n g r a w l e a v e s a n d i n f l o r e s c e n c e s w h i c h w e r e p u t o n t o a s t a n d a r d p a p e r s h e e t o f w h i t e A 4 p r i n t e r p a p e r ( 5 . 1 5 4 g , 6 2 3 . 7 c m 2 ) , t h e i r c o n t o u r s w e r e m a r k e d a n d c u t o f f . T h e s u r f a c e a r e a s o f p l a n t m a t e r i a l w e r e c a l c u l a t e d o n t h e p a p e r w e i g h t b a s i s . T h e p l a n t m a t e r i a l w a s s t o r e d u n t i l t h e m a t e r i a l w a s d r i e d i n p a p e r b a g s l e f t o p e n ; a f t e r d r y i n g a t n o r m a l ( 2 3 ± 2 ° C ) t e m p e r a t u r e d u r i n g 1 0 d a y s t h e b a g s w e r e a i r - t i g h t l y c l o s e d a n d k e p t a t r o o m t e m p e r a t u r e u n t i l a n a l y s e s o f l e a d c o n t e n t . A s i t w a s s h o w n b y ( G l o v e r - A m e n g o r a n d M e n s a h , 2 0 1 2 ) , t h e b e t a - c a r o t e n e l e v e l i n p l a n t m a t e r i a l w a s l e s s t h e c o n t e n t o f s o m e v i t a m i n s a f f e c t e d b y d r y i n g a t r o o m t e m p e r a t u r e . A l l c h e m i c a l s u s e d w e r e o b t a i n e d a t t h e l o c a l S i g m a - A l d r i c h o r F l u k a d i s t r i b u t o r a n d w e r e a t l e a s t o f a n a l y t i c a l g r a d e o f p u r i t y . E s t i m a t i o n o f l e a d c o n t e n t T h e d r y p l a n t m a t e r i a l w a s t r a n s f e r r e d i n t o c l e a n v i a l s c o n t a i n i n g 2 0 m l o f 0 . 1 N n i t r i c a c i d h e a t e d t o 7 0 ° C a n d s h a k e n f o r 2 m i n , a n d t h e n f i l t e r e d . 3 m l o f t h e l i q u i d w a s t a k e n a n d t r a n s f e r r e d t o t h e v i a l s i n q u a d r u p l i c a t e ( M e o s e t a l . , 2 0 1 1 ) , a n d f i n a l l y t h e c o n t e n t o f l e a d w a s m e a s u r e d i n f o u r p a r a l l e l s u s i n g t h e d i t h i z o n e d e t e r m i n a t i o n t e c h n i q u e . T h e a c t u a l d e t e r m i n a t i o n o f l e a d c o n t e n t w a s c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d i n d e t a i l b y F i s c h e r a n d L e o p o l d i i n 1 9 4 0 ( F i s c h e r a n d L e o p o l d i , 1 9 4 0 ) w i t h s u b s e q u e n t c o l o r i m e t r i c e s t i m a t i o n a t 5 1 0 n m i n r e f e r e n c e t o t h e s t a n d a r d s o l u t i o n s ( 0 . 2 5 - 2 . 5 m g / m l ) . A l l l e a d c o n t e n t d a t a a r e e x p r e s s e d a s µ g / 1 0 0 c m 2 ± S E M . T h e e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s w e r e n o t s p e c i a l l y r e c o r d e d , b u t t h e w e e k l y p r e c i p i t a t e s w e r e e s t i m a t e d r o u g h l y u s i n g a g l a s s c y l i n d e r f o r t h e c o l l e c t i o n o f p r e c i p i t a t e s . S i n c e t h e e x a c t e s t i m a t i o n o f t h e a m o u n t o f p r e c i p i t a t e s w a s o u t o f t h e s c o p e o f t h e s t u d y a n d t h u s o n l y s u p p o r t i v e , t h e a m o u n t o f w e e k l y p r e c i p i t a t e s i s g i v e n a s “ + ” f o r < 1 0 m m p e r w e e k a n d , “ + + ” f o r > 1 0 m m p e r w e e k . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N T h e m a j o r f i n d i n g o f t h i s s t u d y w a s t h a t t h e l e a d c o n t e n t o f p o t m a r i g o l d l e a v e s a n d i n f l o r e s c e n c e s w a s M e o s e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 2 6 - 7 3 2 7 2 8 T a b l e 1 L e a d c o n t e n t i n p o t m a r i g o l d ( C a l e n d u l a o f f i c i n a l i s L . ) l e a v e s a n d i n f l o r e s c e n c e s c o l l e c t e d d u r i n g t h e f u l l s i z e p e r i o d a n d a n a l y z e d b y w e e k s C o l l e c t i o n w e e k L e a d c o n t e n t o f l e a v e s L e a d c o n t e n t o f i n f l o r e s c e n c e s P r e c i p i t a t e s 1 1 8 . 1 ± 6 . 3 3 . 1 ± 0 . 8 + 2 1 9 . 8 ± 4 . 7 7 . 8 ± 1 . 9 + 3 1 5 . 5 ± 5 . 0 7 . 6 ± 0 . 9 + 4 1 9 . 0 ± 6 . 8 6 . 3 ± 0 . 4 + + 5 1 2 . 1 ± 2 . 1 4 . 2 ± 1 . 9 + 6 1 2 . 6 ± 1 . 3 6 . 5 ± 2 . 6 + 7 1 6 . 6 ± 3 . 1 6 . 0 ± 1 . 3 + T h e l e a d c o n t e n t o f l e a v e s a n d i n f l o r e s c e n c e s i s g i v e n a s ( µ g / 1 0 0 c m 2 ± S E M ) . F o r t h e p r e c i p i t a t e s , “ + ” = < 1 0 m m p e r w e e k , “ + + ” = > 1 0 m m p e r w e e k ( r o u g h e s t i m a t e s ) .