J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y T r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y o n E . c o l i i n r e s p o n s e t o d i f f e r e n t b i v a l e n t s a l t s K e y w o r d s : T r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y , E . c o l i , B i v a l e n t s a l t . A B S T R A C T : B a c t e r i a l t r a n s f o r m a t i o n i s t h e p r o c e s s o f u p t a k i n g f o r e i g n D N A m o l e c u l e s b y b a c t e r i a l c e l l s . B a c t e r i a , w h i c h a r e a b l e t o u p t a k e s u c h f o r e i g n D N A a r e c a l l e d “ c o m p e t e n t ” c e l l . F o r e i g n D N A c a r r y i n g a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e g e n e c a n b e e x p r e s s e d i n t h e b a c t e r i a a n d t r a n s f o r m i n g t h e b a c t e r i a f r o m a n t i b i o t i c s e n s i t i v e t o a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e . S u c h t r a n s f o r m e d b a c t e r i a c a n e a s i l y b e i s o l a t e d . T h e e f f i c i e n c y o f t h e t r a n s f o r m a t i o n p l a y s a c r i t i c a l r o l e i n r e c o m b i n a n t D N A t e c h n o l o g y . S e v e r a l m e t h o d s h a v e b e e n d e v e l o p e d t o i m p r o v e t h e t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y . I n o u r w o r k w e h a v e s t u d i e d t h e t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y o n s t r a i n s o f E . c o l i a n d i n r e s p o n s e t o d i f f e r e n t b i v a l e n t s s a l t s a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s . A l l t h e e x p e r i m e n t s r e v e a l e d t h a t t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y w a s h i g h e s t o n E . c o l i D H 5 α s t r a i n i n 5 0 m M C a C l 2 c o n c e n t r a t i o n . C o m p a r i n g t o t h e o t h e r E . c o l i a n d b i v a l e n t s s a l t s c o n c e n t r a t i o n , 5 0 m M C a C l 2 , r e s u l t e d i n m u c h f a s t e r g r o w t h o f t r a n s f o r m e d b a c t e r i a . T h u s , o u r r e s u l t s s u g g e s t t h a t E . c o l i D H 5 α s t r a i n a n d C a C l 2 c a n b e u s e d a s a n e f f e c t i v e a g e n t f o r t h e t r a n s f o r m a t i o n t e c h n i q u e . 7 0 4 - 7 1 0 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 8 T h i s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : S a h a n a w a z A l a m S K a n d P a n i g r a h i A K . I n s t i t u t i o n : F i s h e r i e s a n d A q u a c u l t u r e E x t e n s i o n l a b o r a t o r y , D e p a r t m e n t o f Z o o l o g y , U n i v e r s i t y o f K a l y a n i , K a l y a n i , W e s t B e n g a l . I n d i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : S a h a n a w a z A l a m S k . E m a i l : s a h a n a w a z 1 1 @ g m a i l . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / d o c u m e n t s / R A 0 2 9 5 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 2 7 O c t 2 0 1 2 A c c e p t e d : 0 5 N o v 2 0 1 2 P u b l i s h e d : 1 1 D e c 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : S a h a n a w a z A l a m S k a n d P a n i g r a h i A K . T r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y o n E . c o l i i n r e s p o n s e t o d i f f e r e n t b i v a l e n t s a l t s . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 0 4 - 7 1 0 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l O r i g i n a l R e s e a r c h

I N T R O D U C T I O N T r a n s f o r m a t i o n i s d e f i n e d a s t h e u p t a k e a n d e x p r e s s i o n o f f o r e i g n D N A b y c e l l s . T r a n s f o r m a t i o n o f b a c t e r i a i n v o l v e s D N A b i n d i n g t o a l l c e l l s u r f a c e f o l l o w e d b y u p t a k e a c r o s s t h e w a l l - m e m b r a n e c o m p l e x i n t o t h e c y t o p l a s m . B a c t e r i a l t r a n s f o r m a t i o n o c c u r s n a t u r a l l y i n m a n y b a c t e r i a l g e n u s s u c h a s M i c r o c o c c u s , E . c o l i , H a e m o p h i l u s a n d B a c i l l u s ( M i c h o d e t a l . , 1 9 8 8 ) a l l t h e s e o r g a n i s m s h a v e p r o t e i n s o n t h e i r e x t e r i o r s u r f a c e w h o s e f u n c t i o n i s t o b i n d t o D N A i n t h e i r e n v i r o n m e n t a n d t r a n s p o r t i t i n t o t h e c e l l . H o w e v e r , i t i s s t i l l a r a r e e v e n t f o r m o s t b a c t e r i a t o n a t u r a l l y t a k e u p D N A f r o m t h e e n v i r o n m e n t . B y s u b j e c t i n g b a c t e r i a t o c e r t a i n a r t i f i c i a l c o n d i t i o n s , m a n y o f t h e m b e c o m e a b l e t o t a k e u p f r e e D N A a n d t h e c e l l s i n s u c h s t a t e a r e r e f e r r e d t o a s c o m p e t e n t . I n e a r l y s e v e n t i e s , t h e d i s c o v e r i e s o f t r a n s f e r r i n g t h e p h a g e ( M a n d e l a n d H i g a , 1 9 7 0 ) a n d p l a s m i d ( C o h e n e t a l . , 1 9 7 2 ) D N A s i n t o E s c h e r i c h i a c o l i c e l l s f o l l o w i n g a c o m p e t e n c e i n d u c t i o n p r o c e s s i n v o l v i n g t r e a t m e n t w i t h c a l c i u m c h l o r i d e , s e t t h e s t a g e f o r m o l e c u l a r c l o n i n g o f r e c o m b i n a n t D N A s . T h e t e c h n i q u e o f D N A t r a n s f o r m a t i o n h a s t h e n b e c o m e i m p o r t a n t i n v i r t u a l l y a l l a s p e c t s o f m o l e c u l a r g e n e t i c s . E . c o l i h a s d e v e l o p e d i n t o a u n i v e r s a l h o s t o r g a n i s m b o t h f o r m o l e c u l a r c l o n i n g o f D N A a n d f o r a d i v e r s e s e t o f a s s a y s i n v o l v i n g c l o n e d g e n e s . I n E . c o l i t h e c o m p e t e n c e c a n b e d e v e l o p e d b y s u s p e n d i n g t h e c e l l s i n i c e - c o l d C a C l 2 a n d t h e n s u b j e c t i n g t o a b r i e f h e a t s h o c k a t 4 2 ° C ( C o h e n e t a l . , 1 9 7 2 ; M a n d e l a n d H i g a , 1 9 7 0 ) . E v e n a f t e r g e n e r a t i o n o f c o m p e t e n c e , t h e t e c h n i q u e o f E . c o l i t r a n s f o r m a t i o n i s h i g h l y i n e f f i c i e n t ; t h e v a s t m a j o r i t y o f D N A m o l e c u l e s a d d e d d o e s n o t e n t e r a n y c e l l , a n d i n t u r n t h e v a s t m a j o r i t y o f b a c t e r i a l c e l l r e c e i v e s n o D N A . W i t h t h e a d v a n c e m e n t o f t i m e , t h e o r i g i n a l m e t h o d o f c o m p e t e n c e i n d u c t i o n b y C a C l 2 t r e a t m e n t h a s g r a d u a l l y b e e n i m p r o v e d t o d i f f e r e n t h i g h - t r a n s f o r m a t i o n - e f f i c i e n c y p r o t o c o l s , w h i c h e m p l o y m a g n e s i u m i o n s , m a n g a n e s e i o n s ( H a n a h a n , 1 9 8 3 ; H a n a h a n e t a l . , 1 9 9 1 ) . B e s i d e s t h e c h e m i c a l m e t h o d s , p h y s i c a l t r e a t m e n t l i k e e l e c t r o s h o c k w i t h a b r i e f p u l s e o f h i g h v o l t a g e e l e c t r i c i t y h a s b e e n s h o w n t o b e a p p l i c a b l e t o c o m p e t e n c e i n d u c t i o n i n E . c o l i a n d o t h e r b a c t e r i a ( N e u m a n n e t a l . , 1 9 8 2 ) . E v e n a f t e r a l l s u c h d e v e l o p m e n t s , t h e e x a c t m e c h a n i s m o f C a C l 2 m e d i a t e d a r t i f i c i a l t r a n s f o r m a t i o n i s s t i l l l a r g e l y o b s c u r e . I t i s b e l i e v e d t h a t t h e C a C l 2 h e l p s i n D N A a d s o r p t i o n o f t h e c o m p e t e n t c e l l s u r f a c e a n d t h e h e a t - s h o c k s t e p f a c i l i t a t e s f o r p e n e t r a t i o n o f t h e a d s o r b e d D N A i n t o t h e c e l l c y t o s o l . E a r l i e r f i n d i n g ( S a r k a r e t a l . , 2 0 0 2 a ) s h o w s t h a t d u r i n g a r t i f i c i a l t r a n s f o r m a t i o n o f E . c o l i , t h e n a k e d D N A i s b o u n d t o t h e l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) r e c e p t o r m o l e c u l e s o n t h e c o m p e t e n t t o f o r m s u r f a c e ; t h e d i v a l e n t c a t i o n C a 2 + i s s u g g e s t e d t o f o r m c o o r d i n a t i o n c o m p l e x e s w i t h t h e t w o n e g a t i v e l y c h a r g e d m a c r o m o l e c u l e s - D N A a n d L P S . I n t h i s s t u d y , o u r p r i m a r y m o t i v a t i o n i s t o i n v e s t i g a t e t h e m e c h a n i s m o f D N A e n t r y i n t o t h e c e l l c y t o p l a s m d u r i n g a r t i f i c i a l t r a n s f o r m a t i o n . H e r e , i t h a s b e e n s h o w n t h a t h e a t s h o c k s t e p o f t h e s t a n d a r d t r a n s f o r m a t i o n p r o c e d u r e h e a v i l y d e p o l a r i z e s t h e m e m b r a n e o f C a C l 2 - t r e a t e d c o m p o n e n t c e l l s . S o , w e h a v e u s e d d i f f e r e n t t y p e o f b i v a l e n t s a l t s f o r t r a n s f o r m a t i o n . T h e a i m o f t h i s e x p e r i m e n t a t i o n i s t o s t u d y t h e e f f i c i e n c y o f t r a n s f o r m a t i o n i n r e s p e c t t o d i f f e r e n t b i v a l e n t s a l t s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S B a c t e r i a l S t r a i n – E . C o l i D H 5 . P l a s m i d – p U C - 1 9 M e d i a f o r b a c t e r i a l g r o w t h L B m e d i u m B a c t o - t r y p t o n e - 1 0 g m / L , B a c t o - y e a s t - 5 g m / L , N a c l - 1 0 g m / L , p H w a s a d j u s t e d t o 7 . 0 - 7 . 4 w i t h N a O H ( 1 0 N ) a n d w a s a u t o c l a v e d t o s t e r i l i z e . T h e a u t o c l a v e d m e d i u m w a s c o o l e d t o 5 5 ° C a n d a m p i c i l l i n w a s a d d e d ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n 5 0 m g / m l ) . F o r L B - a g a r p l a t e s , 1 . 7 % B a c t o a g a r ( 1 7 g m / L ) w a s a d d e d p r i o r t o a u t o c l a v i n g . A l a m a n d P a n i g r a h i , 2 0 1 2 7 0 5 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 0 4 - 7 1 0

S a l t s C a C l 2 , C o C l 2 , M g C l 2 , N a C l , N H 4 F e S O 4 , M g S O 4 w a s u s e d i n 2 5 m M , 3 0 m M , 5 0 m M a n d 8 0 m M c o n c e n t r a t i o n . A l l s a l t s w e r e a d d e d a s s o l i d s , a l w a y s k e p t a n d u s e d i n c o l d . M e t h o d s P r e p a r a t i o n o f E . c o l i D H 5 a c o m p e t e n t c e l l T h e f o l l o w i n g s i m p l e p r o c e d u r e i s a v a r i a t i o n o f t h a t o f ( C o h e n e t a l . , 1 9 7 2 ) a n d i s f r e q u e n t l y u s e d t o p r e p a r e b a t c h e s o f c o m p e t e n t b a c t e r i a t h a t y i e l d , 5 x 1 0 6 t o 2 x 1 0 7 t r a n s f o r m e d C o l o n i e s p e r m i c r o g r a m o f s u p e r c o i l e d p l a s m i d D N A . T h e s t a n d a r d i z a t i o n o f p r o c e d u r e i s e s t a b l i s h e d i n o u r r e s e a r c h l a b o r a t o r y . P i c k a s i n g l e C o l o n y ( 2 - 3 m m i n d i a m e t e r ) f r o m a p l a t e f r e s h l y g r o w n f o r 1 6 - 2 0 h a t 3 7 ° C a n d t r a n s f e r i n t o 1 0 0 m l o f L y s o g e n y B r o t h ( L B ) b r o t h i n a 1 - l i t e r f l a s k . I n c u b a t e t h e c u l t u r e f o r 3 h a t 3 7 ° C w i t h V i g o r o u s s h a k i n g ( 3 0 0 c y c l e s / h ) m i n u t e i n a A l a m a n d P a n i g r a h i , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 0 4 - 7 1 0 7 0 6 b . M a g n e s i u m s u l p h a t e ( M g S 0 4 ) T r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y a . C a l c i u m c h l o r i d e ( C a C l 2 ) T r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y c . M a g n e s i u m C h l o r i d e ( M g C l 2 ) d . A m m o n i u m - F e r r o u s s u l p h a t e ( N H 4 F e S 0 4 ) T r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y T r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y e . S o d i u m C h l o r i d e ( N a C l ) f . C o b a l t s C h l o r i d e ( C o C l 2 ) F i g u r e 1 I n a l l t h e t r a n s f o r m a t i o n p r o c e s s ( a , b , c , d , e , f ) 5 0 m M c o n c e n t r a t i o n i s t h e h i g h e s t f o r w i t h a b o v e b i v a l e n t s s a l t . T r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y T r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y T r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y C o n c e n t r a t i o n o f s a l t C o n c e n t r a t i o n o f s a l t C o n c e n t r a t i o n o f s a l t C o n c e n t r a t i o n o f s a l t C o n c e n t r a t i o n o f s a l t C o n c e n t r a t i o n o f s a l t

r o t a r y s h a k e r ) . T o m o n i t o r t h e g r o w t h o f t h e c u l t u r e , d e t e r m i n e t h e O D 6 0 0 n m e v e r y 3 0 m i n u t e s . O D 6 0 0 n m = 0 . 2 5 - 0 . 3 0 i s b e t t e r f o r E . c o l i D H 5 t r a n s f o r m a t i o n . A s e p t i c a l l y t r a n s f e r 1 0 m l o f t h e c u l t u r e t o s t e r i l e , i c e - c o l d 1 5 m l p o l y p r o p y l e n e t u b e s . S t o r e t h e t u b e s o n i c e f o r 1 5 m i n u t e s t o i n h i b i t t h e m e t a b o l i c a c t i v i t y o f t h e b a c t e r i a . R e c o v e r t h e c e l l s b y c e n t r i f u g a t i o n a t 4 0 0 0 r p m f o r 5 m i n s a t 4 ° C i n a S a r v a l l G S 3 r o t o r . D e c a n t t h e m e d i a f r o m t h e c e l l p e l l e t s . S t a n d t h e t u b e s i n a n i n v e r t e d p o s i t i o n f o r 1 m i n u t e t o a l l o w t h e l a s t t r a c e s o f m e d i a t o d r a i n a w a y . R e s u s p e n d e a c h p e l l e t i n 5 m l o f i c e - c o l d s a l t s o l u t i o n o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s r e s p e c t i v e l y a n d s t o r e i t o n i c e f o r 3 0 m i n u t e s . R e c o v e r t h e c e l l s b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 5 0 0 r p m f o r 1 0 m i n s a t 4 ° C i n a S a r v a l l G S 3 r o t o r . D e c a n t t h e f l u i d f r o m t h e c e l l p e l l e t s a n d s t a n d t h e t u b e s i n a n i n v e r t e d p o s i t i o n f o r 1 m i n u t e t o a l l o w t h e l a s t t r a c e o f f l u i d t o d r a i n a w a y . R e s u s p e n d t h e p e l l e t i n 1 m l o f t h e s a l t s o l u t i o n o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s r e s p e c t i v e l y . P u t t h e c e l l s b a c k o n i c e u n t i l t h e y a r e u s e d f o r t r a n s f o r m a t i o n ( m i n i m u m t w o h o u r s ) B a c t e r i a l t r a n s f o r m a t i o n A c c o r d i n g t o ( Z h i m i n g e t a l . , 2 0 0 5 ) a n d w e m o d i f y t h e T r a n s f o r m a t i o n p r o c e s s i n o u r l a b o r a t o r y . P l a s m i d t r a n s f o r m a t i o n a n d a n t i b i o t i c s e l e c t i o n C a l c i u m c h l o r i d e t r e a t m e n t o f b a c t e r i a l c e l l s p r o d u c e s c o m p e t e n t c e l l s t h a t w i l l t a k e u p D N A f o l l o w i n g a h e a t s h o c k s t e p . D N A m o l e c u l e s , i . e . p l a s m i d , w h i c h a r e i n t r o d u c e d b y t h i s m e t h o d , w i l l t h e n b e r e p l i c a t e d i n t h e b a c t e r i a l h o s t c e l l s . T o a i d t h e b a c t e r i a l c e l l s ’ r e c o v e r y , t h e c e l l s a r e i n c u b a t e d b r i e f l y w i t h n o n - s e l e c t i v e g r o w t h m e d i u m f o l l o w i n g t h e h e a t s h o c k t r e a t m e n t . H o w e v e r , d u e t o t h e l o w p e r c e n t a g e o f b a c t e r i a l c e l l s t h a t h a v e b e e n t r a n s f o r m e d w i t h t h e A l a m a n d P a n i g r a h i , 2 0 1 2 7 0 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 0 4 - 7 1 0 S a l t C o n c e n t r a t i o n ( m M ) A v e r a g e T r a n s f o r m a t i o n E f f i c i e n c y ( c f u / m g ) a . C a l c i u m c h l o r i d e ( C a C l 2 ) 2 5 0 . 5 9 0 3 0 4 . 6 7 5 5 0 2 3 . 9 8 8 0 0 . 9 8 0 b . M a g n e s i u m s u l p h a t e ( M g S o 4 ) 2 5 0 . 1 1 0 3 0 2 . 3 6 7 5 0 3 . 0 3 7 8 0 0 . 3 1 0 c . M a g n e s i u m C h l o r i d e ( M g C l 2 ) 2 5 0 . 0 7 3 3 0 0 . 3 4 4 5 0 0 . 6 9 9 8 0 0 . 0 0 0 d . A m m o n i u m - F e r r o u s - s u l p h a t e ( N H 4 F e S 0 4 ) 2 5 0 . 6 0 7 3 0 0 . 7 7 4 5 0 1 . 4 2 4 8 0 0 . 0 5 2 e . S o d i u m C h l o r i d e ( N a C l ) 2 5 0 . 1 7 8 3 0 0 . 6 5 8 5 0 1 . 5 4 3 8 0 0 . 0 0 0 f . C o b a l t s C h l o r i d e ( C o C l 2 ) 2 5 0 . 7 5 6 3 0 1 . 0 3 5 5 0 1 . 6 0 1 8 0 0 . 0 0 0 T a b l e 1 s h o w s t h a t t r a n s f o r m a t i o n r a t e i s h i g h i n 5 0 m M c o n c e n t r a t i o n o f e a c h b i v a l e n t s a l t s .