J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y I n v i t r o r e s p o n s e o f H u m a n P r e - o s t e o c l a s t s t o l o w i n t e n s i t y L a s e r i r r a d i a t i o n K e y w o r d s : P r e - o s t e o c l a s t s , L o w e n e r g y l a s e r , C y t o t o x i c i t y , C e l l c y c l e , O r t h o d o n t i c m o v e m e n t . A B S T R A C T : I n v i t r o a n d i n v i v o s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t l o w i n t e n s i t y l a s e r i r r a d i a t i o n s t i m u l a t e s g r o w t h a n d c e l l d i f f e r e n t i a t i o n o f p r e c u r s o r c e l l s , p r o m o t i n g d e n t a l m o v e m e n t a n d a l v e o l a r b o n e r e m o d e l i n g . B u t t h e i n f o r m a t i o n a b o u t t h e e f f e c t o f l a s e r i r r a d i a t i o n o n h u m a n p r e - o s t e o c l a s t s i s l i m i t e d . O b j e c t i v e : T o e v a l u a t e t h e e f f e c t s o n t h e v i a b i l i t y o f t h e p r e - o s t e o c l a s t s a n d c e l l p r o l i f e r a t i o n i n c u l t u r e s o f h u m a n p r e - o s t e o c l a s t s , a f t e r i r r a d i a t i o n w i t h l o w i n t e n s i t y l a s e r . M e t h o d : P o i e t i c s T M H u m a n O s t e o c l a s t P r e c u r s o r s C a t N o . 2 T - 1 1 0 C a m b r e x - L o n z a I n c . w e r e i r r a d i a t e d w i t h l o w i n t e n s i t y l a s e r ( A s - G a - A l ) o f 8 3 2 . 7 9 n m w a v e l e n g t h . A c y t o x i c i t y t e s t w a s p e r f o r m e d u s i n g t h e L a c t a t e d e h y d r o g e n a s e ( L D H ) t e c h n i q u e , m e a s u r i n g a b s o r b a n c e , 6 a n d 2 4 h a f t e r t h e t r e a t m e n t , i n t h e S t a t F a x - 2 1 0 0 a t a w a v e l e n g t h o f 4 9 2 n m . T h e p r e - o s t e o c l a s t c e l l d e n s i t y w a s m e a s u r e d b y t h e a b s o r b a n c e e v e r y 2 4 h f o r 6 d a y s , u s i n g a m i c r o p l a t e r e a d e r . ( C e l l p r o l i f e r a t i o n w i t h T e t r a z o l i u m s a l t s : k i t X T T , R o c h e ) . R e s u l t s : T h e a v e r a g e c y t o t o x i c i t y a t 2 4 h w a s t w i c e t h e o b s e r v e d a t 6 h ( 5 9 % d i f f e r e n c e ) i n t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p t r e a t e d w i t h l a s e r ; T r i t o n c y t o t o x i c i t y i n t h e p o s i t i v e c o n t r o l g r o u p w a s s e v e n t i m e s h i g h e r a t 2 4 h ( 8 6 . 3 % d i f f e r e n c e ) . A f t e r 6 h t h e l a s e r w a s 3 0 t i m e s l e s s c y t o t o x i c t h a n T r i t o n a n d a f t e r 2 4 h w a s 8 9 t i m e s l e s s c y t o t o x i c t h a n T r i t o n ( 9 6 , 6 % d i f f e r e n c e f o r 6 h a n d 9 8 . 8 % d i f f e r e n c e f o r 2 4 h ) . T h e s e t i m e d i f f e r e n c e s a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 0 1 ) . I n t h e c e l l p r o l i f e r a t i o n t e s t t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n g r o u p s w e r e n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d u r i n g t h e s i x d a y s f o l l o w - u p . B o t h c u l t u r e s p r e s e n t e d t h e s a m e b i o l o g i c a l r e s p o n s e , a c c o r d i n g t o t h e c e l l c y c l e u n d e r s t u d y . C o n c l u s i o n s : L o w l e v e l l a s e r i r r a d i a t i o n d o e s n o t h a v e a c y t o t o x i c e f f e c t t h a t a f f e c t t h e c e l l v i a b i l i t y i n n o r m a l h u m a n P r e - o s t e o c l a s t s c e l l s c u l t u r e d I n v i t r o . 7 3 3 - 7 4 1 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 8 T h i s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : A n g e l a D o m í n g u e z a , G i n n a B a y o n a b , A l e j a n d r o C a s a s b . I n s t i t u t i o n : a . O r t h o d o n t i s t , C . I . E . O F o u n d a t i o n B o g o t á , C o l o m b i a , P r o f e s s o r , D e p a r t m e n t o f O r t h o d o n t i c s , F a c u l t y o f D e n t i s t r y , U n i v e r s i d a d d e l V a l l e , C a l i , C o l o m b i a . b . O r t h o d o n t i s t , U n i v e r s i d a d d e l V a l l e , C a l i , C o l o m b i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : Á n g e l a D o m í n g u e z . E m a i l : a n g e l a . d o m i n g u e z c @ g m a i l . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / d o c u m e n t s / R A 0 2 9 2 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 1 7 O c t 2 0 1 2 A c c e p t e d : 2 6 N o v 2 0 1 2 P u b l i s h e d : 2 4 D e c 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : A n g e l a D o m í n g u e z C a m a c h o , G i n n a B a y o n a , A l e j a n d r o C a s a s . I n v i t r o r e s p o n s e o f H u m a n P r e - o s t e o c l a s t s t o l o w i n t e n s i t y L a s e r i r r a d i a t i o n . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 3 3 - 7 4 1 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l O r i g i n a l R e s e a r c h

I N T R O D U C T I O N D u r i n g n o r m a l o r s t i m u l a t e d d e n t a l m o v e m e n t s o m e b i o c h e m i c a l p r o c e s s e s w i t h i n c e l l s m u s t b e t r i g g e r e d . ( R o b e r t s e t a l . , 1 9 8 1 , N o r t o n , 2 0 0 0 , M e i k l e , 2 0 0 6 , K r i s h n a n a n d D a v i d o v i t c h , 2 0 0 6 , M a s e l l a a n d E i s t e r , 2 0 0 6 , C a r d a r o p o l i a n d G a v e g l i o , 2 0 0 7 ) c e l l s p a r t i c i p a t i n g i n d e n t a l m o v e m e n t s t i m u l a t e d b y a n a p p l i e d f o r c e a r e e s s e n t i a l l y p e r i o d o n t a l f i b r o b l a s t s , o s t e o b l a s t s a n d o s t e o c l a s t s ( M c C u l l o c h , 1 9 9 5 , R o o d m a n , 1 9 9 6 , D o l c e e t a l . , 2 0 0 2 , P o m p e r m a i e r e t a l . , 2 0 0 8 , K r i s h n a n a n d D a v i d o v i t c h , 2 0 0 9 ) . T r y i n g t o p o t e n t i a t e t h o s e e f f e c t s i n o r d e r t o a c c e l e r a t e t h e r a t e o f d e n t a l m o v e m e n t i t w a s p r e v i o u s l y d e m o n s t r a t e d t h a t t h e a p p l i c a t i o n o f l o w e n e r g y l a s e r b e a m s i n d e e d a c c e l e r a t e s s o m e c e l l c h a n g e s r e l a t e d t o o r t h o d o n t i c m o v e m e n t , b o t h i n a n i m a l m o d e l s ( S a i t o a n d S h i m i z u , 1 9 9 7 , S e i f i e t a l . , 2 0 0 7 , Y a m a g u c h i e t a l . , 2 0 1 0 ) a n d i n H u m a n s u b j e c t s w i t h d i f f e r e n t p r o t o c o l s : ( A b e l l o a n d V a l b u e n a , 1 9 9 6 ) : 9 0 4 n m , 1 1 0 W , 2 0 s e c p e r t o o t h , ( C r u z e t a l . , 2 0 0 4 ) : 7 8 0 n m , 2 0 m W a n d 5 J / c m 2 , ( D o m i n g u e z a n d V e l a s q u e z , 2 0 1 0 ) : 8 3 0 n m , 1 0 0 m W , 8 0 J / c m 2 ( 2 , 2 J ) , 4 4 s e c ( S o u s a e t a l . , 2 0 1 1 ) : 7 8 0 n m , 2 0 m W , 5 J / c m 2 , a n d 1 0 s e c p e r t o o t h . T h e b i o l o g i c a l b a s i s o f t h e c l i n i c a l e f f e c t s o f l a s e r , ( D o m i n g u e z e t a l . , 2 0 0 9 ) h a d b e e n p a r t i a l l y e x p l a i n e d b y t h e r e s u l t s o f i n v i t r o s t u d i e s i n f i b r o b l a s t s ( D o m í n g u e z e t a l . , 2 0 0 8 , L o p e s e t a l . , 2 0 0 1 , P e r e i r a e t a l . , 2 0 0 2 , M a r q u e s e t a l . , 2 0 0 4 , K r e i s l e r e t a l . , 2 0 0 3 , V i n c k e t a 1 . , 2 0 0 3 ) a n d o s t e o b l a s t s ( C o o m b e e t a l . , 2 0 0 1 , F u j i h a r a e t a l . , 2 0 0 6 , O z a w a e t a l . , 1 9 9 8 , D o m i n g u e z e t a l . , 2 0 0 9 , P i r e s e t a l . , 2 0 0 8 ) . L a s e r e f f e c t s o n O s t e o c l a s t s t u d i e s i n a n i m a l s r e p o r t e d t h a t a l o w i n t e n s i t y l a s e r f a c i l i t a t e s b o n e r e s o r p t i o n . I n r a t s , ( K a w a s a k i a n d S h i m i z u , 2 0 0 0 ) f o u n d t h a t i n t h e t e n s i o n s i d e t h e n u m b e r s o f o s t e o c l a s t s a r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d w i t h r e s p e c t t o u n i r r a d i a t e d c o n t r o l . T h e s e r e p o r t s s u g g e s t t h a t t h e a p p l i c a t i o n o f l a s e r c a n a c c e l e r a t e t h e o r t h o d o n t i c m o v e m e n t t h r o u g h b o n e r e m o d e l i n g . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s r e s e a r c h t h a t r e p o r t e d s e v e r a l d i f f e r e n c e s i n t h e a m o u n t o f i r r a d i a t e d o s t e o c l a s t s v s t h e c o n t r o l s i d e 3 , 5 a n d 7 d a y s a f t e r t h e i n i t i a t i o n o f t h e t r e a t m e n t , p r o m o t i n g d e n t a l m o v e m e n t a n d a l v e o l a r r e m o d e l i n g ( S u n e t a l . , 2 0 0 1 ) . B o n e r e s o r p t i o n c l e a r l y d e p e n d s o n t h e o s t e o c l a s t i c a c t i v i t y d u r i n g o r t h o d o n t i c d e n t a l m o v e m e n t ( T s a y e t a l . , 1 9 9 9 , N o x o n e t a l . , 2 0 0 1 , R o d y e t a l . , 2 0 0 1 , X i e e t a l . , 2 0 0 8 ) ; t h e r e f o r e i t i s i m p o r t a n t t o k n o w t h e e f f e c t s o f l a s e r i r r a d i a t i o n u p o n t h e p r e c u r s o r c e l l s ( B o y l e e t a l . , 2 0 0 3 , M i k a n a n d O l i v e r o s , 2 0 0 7 ) . T h e o n l y p r e v i o u s r e p o r t o n t h i s s u b j e c t w a s o b t a i n e d i n c u l t u r e s o f p r e - o s t e o c l a s t s i s o l a t e d f r o m r a t f e t a l c a l v a r i a ( A i h a r a e t a l . , 2 0 0 6 ) f i n d i n g t h a t l a s e r i r r a d i a t i o n i n d u c e d d i f f e r e n t i a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f o s t e o c l a s t s v i a e f f e c t s o n t h e R A N K s y s t e m o f s i g n a l l i n g , b u t t h e r e a r e n o p r e v i o u s s t u d i e s o n h u m a n p r e - o s t e o c l a s t s t r e a t e d w i t h a n y k i n d o f l a s e r . T h e r e f o r e , t h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o e v a l u a t e t h e e f f e c t s o n t h e v i a b i l i t y o f t h e p r e - o s t e o c l a s t s a n d c e l l p r o l i f e r a t i o n i n c u l t u r e s o f h u m a n p r e - o s t e o c l a s t s , a f t e r t h e i r r a d i a t i o n w i t h l o w i n t e n s i t y l a s e r , d u r i n g a f o l l o w - u p p e r i o d o f s i x d a y s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S T h e c e l l c u l t u r e u s e d w a s t h e P o i e t i c s T M H u m a n O s t e o c l a s t P r e c u r s o r s C a t N o . 2 T - 1 1 0 C a m b r e x - L o n z a I n c . ( W a l k e r s v i l l e , U S A ) D o m í n g u e z e t a l . , 2 0 1 2 7 3 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 3 3 - 7 4 1 F i g u r e 1 P o i e t i c s T M H u m a n O s t e o c l a s t P r e c u r s o r s f r o m C a m b r e x - L o n z a I n c . ( 3 X )

P r e p a r a t i o n o f m e d i a T h e c u l t u r e m e d i u m f o r O s t e o c l a s t p r e c u r s o r s i s p r e p a r e d b y a d d i n g o n l y c u l t u r e m e d i u m c o m p o n e n t s ( 1 0 % b o v i n e f e t a l s e r u m , g l u t a m i n e 2 m M o l , P e n i c i l l i n 1 0 0 u n i t s / m L a n d S t r e p t o m y c i n 1 0 0 µ g / m L ) a n d p r e - h e a t e d a t 3 7 ° C C e l l c u l t u r e T h e i n v i t r o h u m a n p r e - o s t e o c l a s t c e l l s h a v e a n a v e r a g e i n c r e a s e i n c e l l d e n s i t y i n 4 d a y s , i n T - 2 5 b o t t l e s w i t h a n i n i t i a l s e e d c o n c e n t r a t i o n o f 2 x 1 0 4 c e l l s p e r c m 2 . T h e c e l l s g r o w t h i n s u s p e n s i o n , h e n c e t h e g r o w t h i s n o t d e s c r i b e d a s m o n o l a y e r b u t i n t e r m s o f c e l l d e n s i t y . T h e c r y o v i a l p r o v i d e d b y C a m b r e x - L o n z a I n c . ( W a l k e r s v i l l e , U S A ) c o n t a i n i n g 1 x 1 0 6 c e l l s , w a s d e f r o s t e d a n d h e a t e d t o 3 7 ° C i n a w a t e r - b a t h . T h e c e l l s w e r e r e c o v e r e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 0 0 x g f o r 1 5 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e n u m b e r o f c e l l s w a s m e a s u r e d b y t h e T r y p a n B l u e e x c l u s i o n m e t h o d a n d a d j u s t e d t o a c o n c e n t r a t i o n o f 2 x 1 0 4 c e l l s p e r c m 2 i n c u l t u r e f l a s k s T - 2 5 F a l c o n T M . F o r t h e c y t o t o x i c i t y a s s a y t h e f i n a l c e l l c o n c e n t r a t i o n w a s a d j u s t e d t o 2 x 1 0 4 c e l l s p e r 2 0 0 m L , a n d f o r t h e c e l l p r o l i f e r a t i o n a s s a y i t w a s a d j u s t e d t o 4 . 0 0 0 c e l l s p e r 2 0 0 m L T h e v i a l s w e r e p l a c e d i n t h e 3 2 c e n t r a l w e l l s o f t h e 9 6 w e l l p l a t e . T h e m i c r o p l a t e s c o n t a i n i n g t h e c e l l s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 o C u n d e r a n a t m o s p h e r e o f 5 % C O 2 , 9 0 % h u m i d i t y d u r i n g 2 4 h . ( F i g u r e 1 ) E f f e c t s o n t h e v i a b i l i t y o f t h e o s t e o c l a s t s w i t h L D H a s s a y T h e L D H a c t i v i t y i n t h e s u p e r n a t a n t i s m e a s u r e d w i t h t h e L D H k i t ( R o c h e ) b y a m i c r o p l a t e r e a d e r s p e c t r o p h o t o m e t e r ( E L I S A r e a d e r ) a t 4 9 2 n m . T h e a m o u n t o f s u p e r n a t a n t t a k e n f o r t h e a s s a y i s 1 0 0 μ L p e r w e l l . T o e a c h w e l l 1 0 0 µ L o f r e a g e n t a r e a d d e d a n d t h e m i x t u r e i s i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n . A f t e r t h a t t i m e o f i n c u b a t i o n t h e c e l l s o f t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p a r e i r r a d i a t e d . A n y i n c r e a s e i n d e a t h c e l l s o r c e l l m e m b r a n e b r e a k d o w n w i l l b e r e f l e c t e d b y a p r o p o r t i o n a l i n c r e a s e i n L D H a c t i v i t y m e a s u r e d b y t h e a m o u n t o f f o r m a z a n p r o d u c e d , w h o s e a b s o r p t i o n i s m e a s u r e d a t 5 0 0 n m T o c a l c u l a t e t h e p e r c e n t a g e o f c y t o t o x i c i t y i t i s n e c e s s a r y t o r e a d t h r e e c o n t r o l s . ( T a b l e 1 ) T o d e t e r m i n e t h e p e r c e n t a g e o f c y t o t o x i c a c t i v i t y , t h e a v e r a g e v a l u e s o f a b s o r b a n c e f r o m t h r e e r e a d i n g s i s f i r s t c a l c u l a t e d a n d t h e n t h e a v e r a g e a b s o r b a n c e i s s u b t r a c t e d f r o m t h e a b s o l u t e c o n t r o l , w h i c h i n t h i s c a s e w a s < 0 . 2 0 0 , a n d t h e r e f o r e w a s n e g l e c t a b l e . T h e m e a s u r e d v a l u e s w e r e s u b s t i t u t e d i n t h e f o l l o w i n g f o r m u l a : C e l l p r o l i f e r a t i o n e v a l u a t i o n C e l l p r o l i f e r a t i o n w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e X T T k i t f r o m R o c h e ( R o c h e ; S t L o u i s , M O , U S A ) . T h e p r e - o s t e o c l a s t c e l l s a r e p l a c e d i n t h e m i c r o p l a t e w e l l s t o a f i n a l v o l u m e o f 2 0 0 m L w i t h f r e s h c u l t u r e m e d i u m a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C , i n a h u m i d i f i e d a t m o s p h e r e w i t h 5 % C O 2 , f o r 2 4 h . A f t e r t h e i n c u b a t i o n t i m e l a s e r i s a p p l i e d a n d t h e n 5 0 m l o f t h e X T T r e a c t i v e a r e a d d e d t o h a v e a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 3 m g / m L X T T . T h e p l a t e s a r e i n c u b a t e d f o r 2 4 t o 1 4 4 h i n h u m i d i f i e d a t m o s p h e r e D o m í n g u e z e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 3 3 - 7 4 1 7 3 5 C o n t r o l C o n t r o l L o w C o n t r o l h i g h T o x i c i t y A s s a y A b s o l u t e M e d i u m 2 0 0 u L 1 0 0 m L - - - T r i t ó n X - 1 0 0 ( 2 % ) - - 1 0 0 m L 1 0 0 m L T r i t ó n 1 0 0 % - C e l l s - + + + + I r r a d i a t i o n - - - - + T a b l e 1 R e a g e n t D i s t r i b u t i o n i n w e l l s f o r t h e L D H a s s a y E x p e r i m e n t a l L o w C o n t r o l % C y t o t o x i c i t y = x 1 0 0 H i g h C o n t r o l L o w C o n t r o l

( 3 7 ° C , 5 % C O 2 ) a n d t h e a b s o r b a n c e w a s m e a s u r e d e v e r y 2 4 h f o r s i x d a y s . T h e a b s o r b a n c e i s p r o p o r t i o n a l t o t h e c e l l d e n s i t y . I r r a d i a t i o n P r o t o c o l T h e p r o t o c o l u s e d i s t h e s a m e d e s c r i b e d i n p r e v i o u s s t u d i e s f o r g i n g i v a l a n d p e r i o d o n t a l f i b r o b l a s t s ( D o m í n g u e z e t a l . , 2 0 0 8 ) a n d f o r h u m a n o s t e o b l a s t s ( D o m i n g u e z e t a l . , 2 0 0 9 ) . T h e l a s e r p a r a m e t e r s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e - 2 . T h e s o u r c e w a s a n i n f r a r e d l a s e r P h o t o n L A S E I I ( A s - G a - A l . D M C E q u i p a m e n t o s ; S a o C a r l o s , B r a z i l ) a t a w a v e l e n g t h o f 8 3 2 . 7 9 n m . I t w a s a d a p t e d w i t h a c o n v e r g e n t l e n s a t a f o c a l d i s t a n c e o f 5 c m f r o m t h e d i s p o s i t i v e o u t p u t a n d a t 7 . 0 c m a w a y o f t h e c e l l c u l t u r e s u r f a c e . T h e p o w e r o u t p u t w a s m a i n t a i n e d a t 3 6 . 7 3 m W i n c o n t i n u e d m o d e . T h e t o t a l t i m e o f i r r a d i a t i o n p e r w e l l w a s 3 2 . 4 0 s e c . T h e f l o w o f e n e r g y w a s 3 . 7 5 J / c m 2 . T h e i r r a d i a t i o n o f c u l t u r e m e d i a w a s p e r f o r m e d d u r i n g t h e p r o l i f e r a t i o n p h a s e , 2 4 h a f t e r s e e d i n g . A f t e r t h e a p p l i c a t i o n o f l a s e r t h e c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d a g a i n t o e v a l u a t e c e l l p r o l i f e r a t i o n a f t e r 2 4 , 4 8 , 7 2 , 9 6 , 1 2 0 a n d 1 4 8 h o u r s a n d t h e c e l l c y t o t o x i c i t y w a s e v a l u a t e d a f t e r s i x a n d 2 4 h . E t h i c a l i s s u e s A c c o r d i n g t o t h e C o l o m b i a n N o r m 0 0 8 4 3 0 o f 1 9 9 3 , t h i s s t u d y w a s c l a s s i f i e d a s F R E E O F R I S K f o r t h e p a r t i c i p a n t s a s t h e r e w a s n o t a n y i n t e r v e n t i o n o n s u b j e c t s b e c a u s e t h e s t u d y w a s m a d e i n h u m a n p r e - o s t e o c l a s t s f r o m a c e l l l i n e a l r e a d y e s t a b l i s h e d . R E S U L T S C e l l C y t o t o x i c i t y T h e L D H a s s a y r e s u l t s a r e g i v e n a s a v e r a g e d a t a f o r a b s o r b a n c e a t s i x h o u r s i n T a b l e 3 . T h e i r r a d i a t e d c e l l s p r e s e n t e d 0 . 2 2 % o f c y t o t o x i c i t y a t 6 h , w h i c h c o r r e s p o n d s t o 4 4 c e l l s o u t o f 2 0 0 0 0 d a m a g e d d u r i n g t h a t p e r i o d o f t i m e . T h e t r i t o n t r e a t e d g r o u p ( T r i t o n X - 1 0 0 , 1 0 0 % ) g a v e 6 . 6 % c y t o t o x i c i t y , w h i c h a r e 1 3 2 0 l y s e d c e l l s a f t e r 6 h . T h e a v e r a g e a b s o r b a n c e r e s u l t s a f t e r 2 4 h a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 4 . A f t e r 2 4 h t h e l a s e r g r o u p p r e s e n t e d 0 . 5 4 3 % o f c y t o t o x i c i t y a g a i n s t 4 8 . 3 7 % f o r T r i t o n X - 1 0 0 , w h i c h m e a n s t h a t i n 2 4 h f r o m t h e i n i t i a l a m o u n t o f 2 0 , 0 0 0 c e l l s , o n l y 1 0 8 w e r e l y s e d i n t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p w h i l e i n t h e T r i t o n X - 1 0 0 g r o u p 9 6 7 4 c e l l s w e r e d a m a g e d . ( T a b l e 5 ) T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n g r o u p s i n t h e p e r c e n t a g e o f c y t o t o x i c i t y i s s i g n i f i c a n t f o r 6 a n d 2 4 h ( P < 0 . 0 0 1 ) . N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e w a s f o u n d b e t w e e n l a s e r a n d h i g h c o n t r o l i n t e r m s o f c y t o t o x i c i t y : D o m í n g u e z e t a l . , 2 0 1 2 7 3 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 3 3 - 7 4 1 T a b l e 2 L a s e r P a r a m e t e r s P o w e r W a v e l e n g t h D o s e T i m e 3 6 . 7 3 m W 8 3 2 . 7 9 n m 3 . 7 5 J / c m 2 3 2 . 4 0 s e c / p e r w e l l G r o u p H i g h C o n t r o l L o w C o n t r o l T r i t o n L a s e r 0 , 4 2 3 1 , 2 1 8 0 , 7 5 4 1 , 0 6 4 A b s o r b a n c e 0 , 3 8 1 0 , 7 5 4 0 , 9 2 7 1 , 0 2 3 0 , 5 3 2 1 , 1 0 2 0 , 9 7 9 0 , 9 5 1 0 , 5 2 6 0 , 9 3 4 0 , 6 3 9 0 , 9 8 0 , 4 3 9 0 , 9 7 6 0 , 8 2 9 0 , 9 6 4 0 , 7 1 0 , 7 5 4 0 , 9 6 0 , 8 2 3 0 , 9 6 3 0 , 9 9 1 0 , 5 9 7 0 , 9 8 2 1 , 1 7 9 0 , 9 6 4 1 , 6 9 0 , 8 2 3 0 , 9 2 4 0 , 9 5 1 0 , 6 7 5 0 , 9 4 2 M e a n 0 , 5 0 2 0 , 9 5 6 0 , 9 2 6 0 , 9 5 5 S t d d e v i a t i o n 0 , 1 1 8 0 , 1 8 6 0 , 2 9 3 0 , 0 7 T a b l e 3 C y t o t o x i c i t y R e s u l t s a t 6 h F i g u r e 2 C o m p a r a t i v e p e r c e n t a g e o f C y t o t o x i t y l a s e r V s T r i t o n h h

A f t e r 2 4 h t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n l a s e r g r o u p a n d l o w c o n t r o l w a s 0 . 1 % . I n c o n t r a s t , t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n h i g h c o n t r o l a n d l o w c o n t r o l w a s 1 9 % A f t e r 6 h , t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n l a s e r a n d l o w c o n t r o l w a s 0 . 1 % . T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n h i g h a n d l o w c o n t r o l w a s 4 9 % . T h a t m e a n s t h e c y t o t o x i c i t y o f t h e l a s e r g r o u p i s s i m i l a r t o t h e l o w c o n t r o l a f t e r 2 4 a n d 6 h ( t h e r e s p e c t i v e a v e r a g e s a r e 0 , 9 6 4 a n d 0 , 9 6 3 . A l s o a t 6 h t h e a v e r a g e s a r e : 0 . 9 5 6 a n d 0 . 9 5 5 . ) . T h e a v e r a g e c y t o t o x i c i t y m e a s u r e d a f t e r 2 4 h i s t w i c e t h e o b s e r v e d a f t e r 6 h ( 5 9 % d i f f e r e n c e ) i n t h e l a s e r t r e a t e d g r o u p ; w i t h T r i t o n t h e c y t o t o x i c i t y w a s s e v e n t i m e s h i g h e r a f t e r 2 4 h ( 8 6 . 3 % d i f f e r e n c e ) . F o r s i x h o u r s , t h e l a s e r w a s 3 0 t i m e s l e s s c y t o t o x i c t h a n T r i t o n a n d f o r 2 4 h i t w a s 8 9 t i m e s l e s s c y t o t o x i c t h a n T r i t o n ( 9 6 , 6 % d i f f e r e n c e a f t e r 6 h a n d 9 8 . 8 % d i f f e r e n c e a f t e r 2 4 h ) . T h e s e a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s ( p < 0 . 0 0 1 ) . T h e o n l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e a t a s i g n i f i c a n c e l e v e l p = 0 , 0 5 i s b e t w e e n l a s e r a n d C o n t r o l h i g h a t 6 h ( p < 0 , 0 0 0 0 1 ) . F o r t h e 2 4 h i n t e r v a l t h e r e a r e n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s ( p > 0 , 0 5 ) . C o m p a r i s o n b e t w e e n g r o u p s a r e i n T a b l e 6 . C e l l v i a b i l i t y N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e i r r a d i a t e d a n d t h e c o n t r o l g r o u p w e r e d e t e c t e d a t a n y t i m e a f t e r t h e t r e a t m e n t . D a t a a b o u t t h e p r o l i f e r a t i o n r e s u l t s a r e i n T a b l e s 7 - 8 . D u e t o t h e n o n - p a r a m e t r i c d i s t r i b u t i o n o f t h e d a t a t h e K r u s k a l - W a l l i s t e s t w a s a p p l i e d , t o d e t e c t a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t i m e p e r i o d s e v a l u a t e d ( p < 0 . 0 0 0 1 ) . T h e M a n n - W h i t n e y t e s t a l s o d e t e c t e d s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n d a y s 1 , 2 a n d 3 a n d n o t s i g n i f i c a n t b e t w e e n t h e 4 , 5 a n d 6 d a y s . A f t e r t h r e e d a y s t h e e f f e c t d o e s n o t c o n t i n u e t o i n c r e a s e i n a s i g n i f i c a n t w a y . D I S C U S S I O N P r e v i o u s s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t l o w i n t e n s i t y l a s e r i s n o t c y t o t o x i c a g a i n s t g i n g i v a l a n d p e r i o d o n t a l f i b r o b l a s t s . G i n g i v a l f i b r o b l a s t s p r o l i f e r a t i o n w a s g r e a t e r i n t h e e x p e r i m e n t a l c u l t u r e s t h a n i n c o n t r o l s , a l t h o u g h t h e d i f f e r e n c e w a s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t , w h i l e i n p e r i o d o n t a l f i b r o b l a s t s t h e r a t e o f c e l l p r o l i f e r a t i o n w a s g r e a t e r i n t h e c o n t r o l g r o u p , b u t a g a i n n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( D o m i n g u e z e t a l . , 2 0 0 9 ) N o r m a l h u m a n o s t e o b l a s t c u l t u r e s ( N H O s t ) a r e s e n s i t i v e t o l o w i n t e n s i t y l a s e r i r r a d i a t i o n w i t h P h o t o n L A S E ( A s - G a - A l ) d u r i n g t h e i n i t i a l s t a g e o f t h e c u l t u r e , p r e s e n t i n g a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n c e l l p r o l i f e r a t i o n s i n c e t h e f i r s t d a y ( D o m i n g u e z e t a l . , 2 0 0 9 ) . F o l l o w i n g t h e s a m e p r o t o c o l a r e a c t i o n o f h u m a n p r e - o s t e o c l a s t s i n v i t r o a g a i n s t l o w i n t e n s i t y l a s e r i r r a d i a t i o n f o u n d n o D o m í n g u e z e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 3 3 - 7 4 1 7 3 7 H o u r s L a s e r T r i t o n 6 0 , 2 2 6 , 6 2 4 0 , 5 4 3 4 8 , 3 7 T a b l e 5 A v e r a g e c y t o t o x i c i t y ( % ) T a b l e 4 C y t o t o x i c i t y R e s u l t s a f t e r 2 4 h G r o u p H i g h C o n t r o l L o w C o n t r o l T r i t o n L a s e r 0 , 3 4 1 , 0 0 3 0 , 9 8 8 0 , 8 7 0 , 7 2 7 0 , 9 5 6 0 , 8 1 1 0 , 8 6 1 A b s o r b a n c e V a l u e s 0 , 7 7 5 0 , 9 8 7 0 , 9 0 3 1 , 0 4 9 0 , 7 7 3 0 , 8 1 9 0 , 8 7 8 0 , 9 2 4 0 , 9 3 4 1 , 1 9 7 0 , 8 5 1 0 , 9 0 4 1 , 1 2 9 0 , 8 1 9 0 , 9 5 8 0 , 8 0 9 0 , 9 9 7 0 , 9 0 2 0 , 8 6 5 0 , 9 3 0 , 9 0 1 1 , 1 3 9 0 , 7 6 7 1 , 1 0 4 0 , 8 1 7 0 , 8 6 9 0 , 7 6 5 1 , 1 9 3 0 , 7 8 0 , 9 6 4 0 , 8 7 5 0 , 9 6 3 M e a n S t a n d a r d d e v i a t i o n 0 , 2 6 2 0 , 1 4 0 , 0 7 8 0 , 1 2 5

c y t o t o x i c e f f e c t . A d d i t i o n a l l y t h e r e w a s n o t a n y s i g n i f i c a n t e f f e c t o n c e l l v i a b i l i t y . P r e - o s t e o c l a s t s a r e m o n o n u c l e a r c e l l s d e r i v e d f r o m t h e l i n a g e o f m a c r o p h a g e - m o n o c y t e s ( C F U - G M ) t h a t n o r m a l l y a r e d i f f e r e n t i a t e d t o o s t e o c l a s t s , a n d t h e r e f o r e m a y i n c r e a s e t h e i r c e l l d e n s i t y a s a c t i v e f o r m s o r m a y b e f u s e d a n d d i f f e r e n t i a t e d t o m a t u r e m u l t i n u c l e a r o s t e o c l a s t s i n t h e p r e s e n c e o f s p e c i f i c s i g n a l s , w i t h o u t u n d e r g o i n g p r o l i f e r a t i o n . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e s e w o r k r e s u l t s d o n ' t c o r r e s p o n d t o ( K a r u , 1 9 8 8 ) m o d e l a b o u t t h e m e c h a n i s m o f t h e l a s e r a c t i o n w h i c h c o n d u c e d t o c e l l p r o l i f e r a t i o n o r p r o t e i n s y n t h e s i s . I n t h e p r e s e n t s t u d y w e f o u n d s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e r e s u l t s o f c y t o t o x i c i t y o b s e r v e d a t 6 v s 2 4 h ( P < 0 . 0 0 1 ) a n d b e t w e e n t h e i r r a d i a t e d g r o u p a n d t h e g r o u p t r e a t e d w i t h T r i t o n X - 1 0 0 . T h e c e l l d e n s i t y w a s n o t a f f e c t e d a s t h e r e a r e n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n g r o u p s , c o n c l u d i n g t h a t t h e b i o l o g i c a l b e h a v i o r w a s t h e s a m e , a c c o r d i n g t o t h e e x p e c t e d f o r t h e c e l l c y c l e o b s e r v e d . P r e v i o u s s t u d i e s i n a n i m a l m o d e l s ( S a i t o a n d S h i m i z u , 1 9 9 7 , S e i f i e t a l . , 2 0 0 7 , Y a m a g u c h i e t a l . , 2 0 1 0 ) a s w e l l a s t h e s t u d y o f K a w a s a k i a n d S h i m i z u ( K a w a s a k i a n d S h i m i z u , 2 0 1 0 ) r e p o r t e d t h a t o r t h o d o n t i c m o v e m e n t i s f a s t e r i n i r r a d i a t e d r a t s , a n d t h a t t h e r e i s a n i n c r e a s e d a m o u n t o f o s t e o c l a s t s i n t h e c o m p r e s s i o n s i d e . T h e e f f e c t o f l a s e r i r r a d i a t i o n o n t h e s p e e d o f o r t h o d o n t i c m o v e m e n t i s t r a c e d b a c k t o d i f f e r e n t i a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f o s t e o c l a s t s b y t h e e x p r e s s i o n o f R A N K s i g n a l s a n d t h e i n t e r a c t i o n R a n k - R a n k - L , a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n T R A P p o s i t i v e c e l l s ( F u j i t a e t a l . , 2 0 0 8 ) a n d c h a n g e s i n t h e e x p r e s s i o n o f M M P - 9 , c a t e p s i n e K , a n d i n t e g r i n s a l p h a a n d b e t a . B e s i d e s a n i n c r e m e n t i s d e t e c t e d i n t h e i n t e r a c t i o n o f M - C S F w i t h t h e r e c e p t o r c - F m s i n o s t e o c l a s t i c p r e c u r s o r s , t h a t s t i m u l a t e o s t e o c l a s t i c d i f f e r e n t i a t i o n ( Y a m a g u c h i e t a l . , 2 0 1 0 ) . T h e n e w e x p e r i m e n t a l r e s u l t s r e p o r t e d h e r e e v a l u a t e i n - v i t r o e f f e c t s o f l o w i n t e n s i t y l a s e r o n h u m a n p r e - o s t e o c l a s t s c e l l s , w h i c h m u s t b e t a k e n i n t o a c c o u n t t o g e t a n i n s i g h t i n t o t h e b i o l o g i c a l p r o c e s s e s o c c u r r i n g i n v i v o . S o f a r , a c c o r d i n g t o o u r k n o w l e d g e t h e r e a r e n o r e p o r t s a b o u t t h e e f f e c t o f t h i s l a s e r o r a n y o t h e r l a s e r t y p e o n H u m a n p r e - o s t e o c l a s t s i n v i t r o . T h i s m a y b e d u e t o t h e d i f f i c u l t y o f m a i n t a i n i n g t h e s h o r t l i f e c y c l e o f c u l t u r e p r e - o s t e o c l a s t s c u l t u r e . O n l y o n e a r t i c l e : ( A i h a r a e t a l . , 2 0 0 6 ) s u g g e s t e d t h a t l o w - e n e r g y l a s e r i r r a d i a t i o n f a c i l i t a t e d d i f f e r e n t i a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f o s t e o c l a s t s w i t h u p r e g u l a t i o n o f R A N K e x p r e s s i o n s ; L o w - e n e r g y l a s e r i r r a d i a t i o n ( G a - A l - A s s e m i c o n d u c t o r l a s e r ) w a s a p p l i e d t o r a t o s t e o c l a s t s p r e c u r s o r c e l l s b u t n o t t h e , n o h u m a n c e l l s . T h i s i s t h e f i n a l w o r k a b o u t t h e e f f e c t o f l o w l e v e l l a s e r o n c e l l s r e l a t e d t o o r t h o d o n t i c m o v e m e n t w i t h t h e s a m e p r o t o c o l o f i r r a d i a t i o n ( D o m i n g u e z e t a l . , 2 0 0 9 D o m i n g u e z e t a l . , 2 0 0 8 , D o m i n g u e z e t a l . , 2 0 0 9 ) . T h e r e a s o n t o u s e o n l y o n e d o s e i s t h a t t h e c l i n i c i a n c a n ´ t r a d i a t e w i t h d i f f e r e n t p a r a m e t e r s i n t h e s a m e z o n e . C o r r e l a t i n g t h e p r e s e n t r e s u l t s w i t h p r e v i o u s s t u d i e s i n o s t e o b l a s t s , i n w h i c h t h e s e c e l l s h a d a s i g n i f i c a n t l y D o m í n g u e z e t a l . , 2 0 1 2 7 3 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 3 3 - 7 4 1 G r o u p s c o m p a r e d p 6 h L a s e r v s H i g h c o n t r o l < 0 , 0 0 0 0 1 L a s e r v s l o w c o n t r o l 0 , 9 9 L a s e r v s T r i t o n 0 , 7 4 2 l o w c o n t r o l v s T r i t o n > 0 , 0 5 2 4 h L a s e r v s H i g h c o n t r o l 0 , 1 2 4 L a s e r v s l o w c o n t r o l > 0 , 0 5 L a s e r v s T r i t o n 0 , 7 4 2 l o w c o n t r o l v s T r i t o n > 0 , 0 5 T a b l e 6 C o m p a r i s o n b e t w e e n g r o u p s - C y t o t o x i c i t y

h i g h e r p r o l i f e r a t i o n ( D o m i n g u e z e t a l . , 2 0 0 9 ) , i t i s l i k e l y t h a t t h e o s t e o c l a s t i c s t i m u l a t i o n i s d u e t o c e l l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n o s t e o b l a s t s - o s t e o c l a s t s r a t h e r t h a n b y a d i r e c t e f f e c t o n t h e n o r m a l a c t i v i t y o f p r e - o s t e o c l a s t s ( d e n s i t y c e l l w a s n o t a f f e c t e d ) . T h e r e s u l t s o b t a i n e d d o n o t e x c l u d e t h e f a c t t h a t l o w i n t e n s i t y l a s e r i r r a d i a t i o n b e n e f i t s t h e p r o c e s s o f b o n e r e m o d e l i n g d u r i n g t h e o r t h o d o n t i c d e n t a l m o v e m e n t . C O N C L U S I O N S L o w i n t e n s i t y l a s e r i r r a d i a t i o n d o e s n o t h a v e a s i g n i f i c a n t c y t o t o x i c e f f e c t o n h u m a n p r e - o s t e o c l a s t s c e l l s i n v i t r o . L o w l e v e l l a s e r t h e r a p y i s n o t a f f e c t i n g t h e c e l l v i a b i l i t y o f n o r m a l h u m a n p r e - o s t e o c l a s t s c e l l s c u l t u r e s i n v i t r o . A C K N O W L E D G E M E N T S T o D r . L u i s R o g e l i o H e r n a n d e z , M a s t e r o f S c i e n c e f r o m t h e U n i v e r s i t y o f S o u t h a m p t o n , f o r h i s s t a t i s t i c a l a n a l y s i s a n d t h e t r a n s l a t i o n o f t h i s p a p e r T o C a r l o s C r u z , s t a s t i c i a n , f o r h i s a s s i s t a n c e i n s t a t i s t i c s . T o D r . W i l l i a m C r i o l l o , f o r h i s e x c e l l e n t s u p p o r t i n t h e e x p e r i m e n t a l m a n a g e m e n t o f c e l l c u l t u r e s . T o D r . A d r i a n a J a r a m i l l o f o r h e r m e t h o d o l o g i c a l a s s i s t a n c e . T o D r . E f r a í n S o l a r t e R . , f r o m t h e o p t i c a l c u a n t i c s g r o u p o f t h e d e p a r t m e n t o f p h y s i c s , s c i e n c e f a c u l t y , U n i v e r s i d a d d e l v a l l e T o T h e c e l l u l a r i n v i t r o c u l t u r e l a b , U n i v e r s i d a d d e l v a l l e R E F E R E N C E S A b e l l o M , V a l b u e n a D . 1 9 9 6 . E f e c t o d e l l á s e r b l a n d o ( i r ) e n l a v e l o c i d a d d e a l i n e a c i ó n d e l t r a t a m i e n t o o r t o d ó n c i c o . T e s i s d e p o s t g r a d o F u n d a c i ó n C . I . E . O B o g o t á , C o l o m b i a . A i h a r a N , Y a m a g u c h i M , K a s a i K . 2 0 0 6 . L o w - e n e r g y i r r a d i a t i o n s t i m u l a t e s f o r m a t i o n o f o s t e o c l a s t - l i k e c e l l s v i a R A N K e x p r e s s i o n i n V i t r o . L a s e r s M e d S c i . , 2 1 ( 1 ) : 2 4 - 3 3 . B o y l e W , S i m o n e t S , L a c e y D . 2 0 0 3 . O s t e o c l a s t d i f f e r e n t i a t i o n a n d a c t i v a t i o n . N a t u r e 4 2 3 : 3 3 7 - 4 2 3 . C a r d a r o p o l i D , G a v e g l i o L . 2 0 0 7 . T h e i n f l u e n c e o f o r t h o d o n t i c m o v e m e n t o n p e r i o d o n t a l t i s s u e s l e v e l s . S e m i n O r t h o d . , 1 3 ( 4 ) : 2 3 4 - 2 4 5 . C o o m b e A R , H o C T , D a r e n d e l i l e r M A , H u n t e r N , P h i l i p s J R , C h a p p l e C C , Y u m L W . 2 0 0 1 . T h e e f f e c t s o f l o w l e v e l l a s e r i r r a d i a t i o n o n o s t e o b l a s t i c c e l l s . C l i n O r t h o d R e s . , 4 ( 1 ) : 3 - 1 4 . C r u z D R , K o h a r a E K , R i b e i r o M S , W e t t e r N U . 2 0 0 4 . E f f e c t s o f l o w - i n t e n s i t y l a s e r t h e r a p y o n t h e o r t h o d o n t i c m o v e m e n t v e l o c i t y o f h u m a n t e e t h : a p r e l i m i n a r y s t u d y . L a s e r s i n S u r g e r y a n d M e d i c i n e 3 5 ( 2 ) : 1 1 7 - 1 2 0 . D o l c e C , M a l o n e S , W h e e l e r T . 2 0 0 2 . C u r r e n t c o n c e p t s i n t h e b i o l o g y o f o r t h o d o n t i c t o o t h m o v e m e n t . S e m i n O r t h o d . , 8 ( 1 ) : 6 - 1 2 . D o m i n g u e z A , C a s t r o P , M o r a l e s M . 2 0 0 9 . C e l l u l a r e f f e c t s r e l a t e d t o t h e c l i n i c a l u s e s o f l a s e r i n o r t h o d o n t i c s . J o u r n a l o f O r a l l a s e r A p p l i c a t i o n s 9 ( 4 ) : 1 9 9 - 2 0 3 . D o m i n g u e z A , C a s t r o P , M o r a l e s M . 2 0 0 9 . I n v i t r o S t u d y o f t h e r e a c t i o n o f h u m a n o s t e o b l a s t s t o l o w - l e v e l l a s e r i r r a d i a t i o n . J O r a l L a s e r A p p l i c a t i o n s 9 ( 1 ) : 2 1 - 2 8 . D o m í n g u e z A , C l a r k s o n A , L ó p e z R . 2 0 0 8 . A n i n v i t r o s t u d y o f t h e r e a c t i o n o f p e r i o d o n t a l a n d g i n g i v a l f i b r o b l a s t s t o l o w - l e v e l l a s e r i r r a d i a t i o n : A p i l o t s t u d y . J O r a l L a s e r A p p l i c a t i o n s 8 ( 4 ) : 2 3 5 - 2 4 4 . D o m i n g u e z A , V e l a s q u e z S . 2 0 1 0 . A c c e l e r a t i o n e f f e c t o f o r t h o d o n t i c m o v e m e n t b y a p p l i c a t i o n o f l o w - i n t e n s i t y l a s e r . J O r a l . L a s e r A p p l i c a t i o n s 1 0 : 9 9 - 1 0 5 . D o m í n g u e z e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 3 3 - 7 4 1 7 3 9

F u j i h a r a N A , H i r a k i K R , M a r q u e s M M . 2 0 0 6 . I r r a d i a t i o n a t 7 8 0 n m i n c r e a s e s p r o l i f e r a t i o n r a t e o f o s t e o b l a s t s i n d e p e n d e n t d l y o f d e x a m e t h a s o n e p r e s e n c e . L a s e r s S u r g M e d . , 3 8 ( 4 ) : 3 3 2 - 3 3 6 . F u j i t a S , Y a m a g u c h i M , U t s u n o m i y a T , Y a m a m o t o H , K a s a i K . 2 0 0 8 . L o w - e n e r g y l a s e r s t i m u l a t e s t o o t h m o v e m e n t v e l o c i t y v i a e x p r e s s i o n o f R A N K a n d R A N K L . O r t h o d C r a n i o f a c R e s . , 1 1 ( 3 ) : 1 4 3 - 1 5 5 . K a r u T I . 1 9 8 8 . M o l e c u l a r m e c h a n i s m o f t h e t h e r a p e u t i c e f f e c t o f l o w - i n t e n s i t y l a s e r r a d i a t i o n . L a s e r s L i f e S c i . , 2 ( 1 ) : 5 3 - 7 4 . K a w a s a k i K , S h i m i z u N . 2 0 0 0 . E f f e c t s o f l o w - e n e r g y l a s e r i r r a d i a t i o n o n b o n e r e m o d e l i n g d u r i n g e x p e r i m e n t a l t o o t h m o v e m e n t i n r a t s . L a s e r s S u r g M e d . , 2 6 ( 3 ) : 2 8 2 - 2 9 1 . K r e i s l e r M , C h r i s t o f f e r s A B , W i l l e r s h a u s e n B , d ' H o e d t B . 2 0 0 3 . E f f e c t o f l o w - l e v e l G a A l A s l a s e r i r r a d i a t i o n o n t h e p r o l i f e r a t i o n o f h u m a n p e r i o d o n t a l l i g a m e n t f i b r o b l a s t s : a n i n v i t r o s t u d y . J C l i n P e r i d o n t o l . , 3 0 ( 4 ) : 3 5 3 - 8 . K r i s h n a n V , D a v i d o v i t c h Z . 2 0 0 6 . C e l l u l a r , m o l e c u l a r , a n d t i s s u e - l e v e l r e a c t i o n s t o o r t h o d o n t i c f o r c e . A m e r i c a n J o u r n a l o f O r t h o d o n t i c s a n d D e n t o f a c i a l O r t h o p e d i c s 1 2 9 ( 4 ) : 4 6 9 - e 1 - 3 2 . K r i s h n a n V , D a v i d o v i t c h Z . 2 0 0 9 . O n a P a t h t o U n f o l d i n g t h e B i o l o g i c a l M e c h a n i s m s o f O r t h o d o n t i c T o o t h M o v e m e n t . J D e n t R e s . , 8 8 ( 7 ) : 5 9 7 - 6 0 8 . L o p e s A , R i g a u J , Z â n g a r o R A , G u i d u g l i - N e t o J , J a e g e r M M . 2 0 0 1 . C o m p a r i s o n o f t h e l o w l e v e l l a s e r t h e r a p y e f f e c t s o n c u l t u r e d h u m a n g i n g i v a l f i b r o b l a s t s p r o l i f e r a t i o n u s i n g d i f f e r e n t i r r a d i a n c e a n d s a m e f l u e n c e . L a s e r s S u r g M e d . , 2 9 ( 2 ) : 1 7 9 - 1 8 4 . M a r q u e s M , P e r e i r a A , F u j i h a r a N A , N o g u e i r a F N , E d u a r d o C P . 2 0 0 4 . E f f e c t o f l o w - p o w e r l a s e r i r r a d i a t i o n o n p r o t e i n s y n t h e s i s a n d u l t r a s t r u c t u r e o f h u m a n g i n g i v a l f i b r o b l a s t s . L a s e r s S u r g M e d . , 3 4 ( 3 ) : 2 6 0 - 5 . M a s e l l a R S , E i s t e r M . 2 0 0 6 . C u r r e n t c o n c e p t s i n t h e b i o l o g y o f o r t h o d o n t i c t o o t h m o v e m e n t . A m J O r t h o d D e n t o f a c i a l O r t h o p . , 1 2 9 ( 4 ) : 4 5 8 - 6 8 . M c C u l l o c h C A G . 1 9 9 5 ; O r i g i n s a n d f u n c t i o n o f c e l l s e s s e n t i a l f o r p e r i o d o n t a l r e p a i r : t h e r o l e o f f i b r o b l a s t s i n t i s s u e h o m e o s t a s i s . O r a l D i s e a s e s 1 ( 4 ) : 2 7 1 - 2 7 8 . M e i k l e M C . 2 0 0 6 . T h e t i s s u e , c e l l u l a r , a n d m o l e c u l a r r e g u l a t i o n o f o r t h o d o n t i c t o o t h m o v e m e n t : 1 0 0 y e a r s a f t e r C a r l S a n d s t e d t . E u r J O r t h o d . , 2 8 ( 3 ) : 2 2 1 - 2 4 0 . M i k a n J , O l i v e r o s W . 2 0 0 7 . O s t e o c l a s t o g é n e s i s y e n f e r m e d a d e s Ó s e a s . R e v i s t a M e d . , 1 5 : 2 6 1 - 2 7 0 . N o r t o n L . 2 0 0 0 . F u n d a m e n t a l p r i n c i p l e s o f t h e b i o l o g y o f t o o t h m o v e m e n t . S e m i n O r t h o d . , 6 ( 3 ) : 1 3 9 - 1 4 4 . N o x o n S J , K i n g G J , G u G , H u a n g G . 2 0 0 1 . O s t e o c l a s t c l e a r a n c e f r o m p e r i o d o n t a l t i s s u e s d u r i n g o r t h o d o n t i c t o o t h m o v e m e n t . A m J O r t h o d D e n t o f a c i a l O r t h o p . , 1 2 0 ( 5 ) : 4 6 6 - 4 7 6 . O z a w a Y , S h i m i z u N , K a r i y a G , A b i k o Y . 1 9 9 8 . L o w - e n e r g y l a s e r i r r a d i a t i o n s t i m u l a t e s b o n e n o d u l e f o r m a t i o n a t e a r l y s t a g e s o f c e l l c u l t u r e i n r a t c a l v a r i a l c e l l s . B o n e 2 2 ( 4 ) : 3 4 7 - 3 5 4 . P e r e i r a A N . E d u a r d o C d e P , M a t s o n E , M a r q u e s M M . 2 0 0 2 . E f f e c t o f l o w - p o w e r l a s e r i r r a d i a t i o n o n c e l l g r o w t h a n d p r o c o l l a g e n s y n t h e s i s o f c u l t u r e d f i b r o b l a s t s . L a s e r s S u r g M e d . , 3 1 ( 4 ) : 2 6 3 - 7 . P i r e s O l i v e i r a D A , D e O l i v e i r a R F , Z a n g a r o R A , S o a r e s C P . 2 0 0 8 . E v a l u a t i o n o f l o w - l e v e l l a s e r t h e r a p y o f o s t e o b l a s t i c c e l l s . P h o t o m e d L a s e r S u r g . , 2 6 ( 4 ) : 4 0 1 - 4 0 4 . P o m p e r m a i e r T , C o e l h o U , R e p e k e C , S i l v a J , Q u e i r o z F , G a r l e t G P . 2 0 0 8 . D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f o s t e o b l a s t a n d o s t e o c l a s t c h e m o a t t r a c t a n t s i n c o m p r e s s i o n a n d t e n s i o n s i d e s d u r i n g o r t h o d o n t i c D o m í n g u e z e t a l . , 2 0 1 2 7 4 0 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 3 3 - 7 4 1

m o v e m e n t . C y t o k i n e 4 2 ( 3 ) : 3 3 0 - 3 3 5 . R o b e r t s W E , G o o d w i n W C . J r , H e i n e r S R . 1 9 8 1 . C e l l u l a r r e s p o n s e t o o r t h o d o n t i c f o r c e . D e n t C l i n N o r t h A m . , 2 5 ( 1 ) : 3 - 1 7 . R o d y W J J r , K i n g G J , G u G . 2 0 0 1 . O s t e o c l a s t r e c r u i t m e n t t o s i t e s o f c o m p r e s s i o n i n o r t h o d o n t i c t o o t h m o v e m e n t . A m J O r t h o d D e n t o f a c i a l O r t h o p . , 1 2 0 ( 5 ) : 4 7 7 - 4 8 9 . R o o d m a n D . 1 9 9 6 . A d v a n c e s i n b o n e b i o l o g y : T h e O s t e o c l a s t . E n d o c r i n e R e v i e w s 1 7 ( 4 ) : 3 0 8 - 3 3 2 . S a i t o S , S h i m i z u N . 1 9 9 7 . S t i m u l a t o r y e f f e c t s o f l o w - p o w e r l a s e r i r r a d i a t i o n o n b o n e r e g e n e r a t i o n i n m i d p a l a t a l s u t u r e d u r i n g e x p a n s i o n i n t h e r a t . A m J O r t h o d D e n t o f a c O r t h o p 1 1 1 ( 5 ) : 5 2 5 - 5 3 2 . S e i f i M , S h a f e e i H A , D a n e s h d o o s t S , M i r M . 2 0 0 7 . E f f e c t s o f t w o t y p e s o f l o w - l e v e l l a s e r w a v e l e n g t h s ( 8 5 0 a n d 6 3 0 n m ) o n t h e o r t h o d o n t i c t o o t h m o v e m e n t s i n r a b b i t s . L a s e r s i n M e d i c a l S c i e n c e 2 2 ( 4 ) : 2 6 1 - 4 . S o u s a M V , S c a n a v i n i M A , S a n n o m i y a E K , V e l a s c o L G , A n g e l i e r i F . 2 0 1 1 . I n f l u e n c e o f l o w - l e v e l l a s e r o n t h e s p e e d o f o r t h o d o n t i c m o v e m e n t . P h o t o m e d L a s e r S u r g . , 2 9 ( 3 ) : 1 9 1 - 6 . S u n X , Z h u X , X u C , Y e N , Z h u H . 2 0 0 1 . E f f e c t s o f l o w e n e r g y l a s e r o n t o o t h m o v e m e n t a n d r e m o d e l i n g o f a l v e o l a r b o n e i n r a b b i t s . H u a X i K o u Q i a n g 1 9 ( 5 ) : 2 9 0 - 2 9 3 . T s a y T P , C h e n M H , O y e n O J . 1 9 9 9 . O s t e o c l a s t a c t i v a t i o n a n d r e c r u i t m e n t a f t e r a p p l i c a t i o n o f o r t h o d o n t i c f o r c e . A m e r i c a n J o u r n a l o f O r t h o d o n t i c s a n d D e n t o f a c i a l O r t h o p e d i c s 1 1 5 ( 3 ) : 3 2 3 - 3 3 0 . V i n c k E M . C a g n i e B J , C o r n e l i s s e n M J , D e c l e r c q H A , C a m b i e r D C . 2 0 0 3 . I n c r e a s e d f i b r o b l a s t p r o l i f e r a t i o n i n d u c e d b y l i g h t e m i t t i n g d i o d e a n d l o w p o w e r l a s e r i r r a d i a t i o n . L a s e r s M e d S c i . , 1 8 ( 2 ) : 9 5 - 9 . X i e R , K u i j p e r s - J a g t m a n A M , M a l t h a J C . 2 0 0 8 . O s t e o c l a s t d i f f e r e n t i a t i o n d u r i n g e x p e r i m e n t a l t o o t h m o v e m e n t b y a s h o r t - t e r m f o r c e a p p l i c a t i o n : A n i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d y i n r a t s . A c t O d o n t o l S c a n d 6 6 ( 5 ) : 3 1 4 - 3 2 0 . Y a m a g u c h i M , H a y a s h i M , F u j i t a S , Y o s h i d a T , U t s u n o m i y a T , Y a m a m o t o H , K a s a i K . 2 0 1 0 . L o w e n e r g y l a s e r i r r a d i a t i o n f a c i l i t a t e s t h e v e l o c i t y o f t o o t h m o v e m e n t a n d t h e e x p r e s s i o n s o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e - 9 , c a t h e p s i n K , a n d a l p h a ( v ) b e t a ( 3 ) i n t e g r i n i n r a t s . E u r o p e a n J o u r n a l o f O r t h o d o n t i c s 3 2 ( 2 ) : 1 3 1 - 1 3 9 . D o m í n g u e z e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 8 ) : 7 3 3 - 7 4 1 7 4 1 S u b m i t y o u r a r t i c l e s o n l i n e a t j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m A d v a n t a g e s E a s y o n l i n e s u b m i s s i o n C o m p l e t e P e e r r e v i e w A f f o r d a b l e C h a r g e s Q u i c k p r o c e s s i n g E x t e n s i v e i n d e x i n g Y o u r e t a i n y o u r c o p y r i g h t s u b m i t @ j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / S u b m i t . p h p .