J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y U r s o l i c a c i d f r o m l e a f e x t r a c t s o f B a r l e r i a l u p u l i n a a c t i n g a s a n t i c l a s t o g e n i c a n d a n t i t u m o r a g e n t . K e y w o r d s : B a r l e r i a l u p u l i n a ; A c a n t h a c e a e f a m i l y ; a n t i - c a n c e r , a n t i - t u m o r a c t i v i t i e s ; u r s o l i c a c i d ; β s i t o s t e r o l ; s i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e . A B S T R A C T : I n o u r p r e v i o u s s t u d y , w e h a v e r e p o r t e d t h e r a d i o - p r o t e c t i v e , a n t i c l a s t o g e n i c a n d a n t i t u m o r a c t i v i t i e s o f t h e l e a f e x t r a c t o f B a r l e r i a l u p u l i n a o n m i c e a n d f i s h . I n t h e p r e s e n t w o r k , b i o l o g i c a l a c t i v e c o m p o n e n t f r o m t h e l e a f e x t r a c t h a s b e e n i s o l a t e d , b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y . P h y t o c h e m i c a l a n a l y s i s , T L C a n d N M R s t u d i e s c o n f i r m t h e p r e s e n c e o f u r s o l i c a c i d a s t h e m a i n a n t i c a n c e r c o m p o n e n t , b e s i d e s o t h e r s u c h c o m p o n e n t s , a s β s i t o s t e r o l , s i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e a r e a l s o p r e s e n t . 6 6 7 - 6 7 5 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 7 T h i s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : P r a n a b K u m a r D a s 1 a n d P r a d i p K u m a r S u r 2 I n s t i t u t i o n : 1 . U G C R e s e a r c h S c h o l a r , C y t o g e n e t i c s L a b o r a t o r y , D e p t . o f Z o o l o g y , K a n c h r a p a r a C o l l e g e , K a n c h r a p a r a - 7 4 3 1 4 5 , D i s t - ( N ) 2 4 P g n s , W e s t B e n g a l , I n d i a . 2 . A s s o c i a t e P r o f e s s o r , C y t o g e n e t i c s L a b o r a t o r y , D e p t . o f Z o o l o g y , K a n c h r a p a r a C o l l e g e , P . O . K a n c h r a p a r a - 7 4 3 1 4 5 , D i s t - ( N ) 2 4 P g n s , W e s t B e n g a l , I n d i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : P r a n a b K u m a r D a s . E m a i l : d r p k s u r @ r e d i f f m a i l . c o m p r n v _ 2 0 0 4 2 0 0 3 @ r e d i f f m a i l . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / d o c u m e n t s / R A 0 2 8 1 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 6 S e p 2 0 1 2 A c c e p t e d : 2 4 S e p 2 0 1 2 P u b l i s h e d : 2 9 O c t 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : P r a n a b K u m a r D a s a n d P r a d i p K u m a r S u r . U r s o l i c a c i d f r o m l e a f e x t r a c t s o f B a r l e r i a l u p u l i n a a c t i n g a s a n t i c l a s t o g e n i c a n d a n t i t u m o r a g e n t . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 7 ) : 6 6 7 - 6 7 5 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y O r i g i n a l R e s e a r c h A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l

I N T R O D U C T I O N T u m o r f o r m a t i o n a n d c a n c e r i s a l i f e t h r e a t e n i n g d i s e a s e a n d a p r o b l e m t o m a n k i n d a l l o v e r t h e w o r l d . T u m o r s i n m a l i g n a n t f o r m l e a d t o c a n c e r . S e a r c h f o r a n t i c a n c e r a n d r a d i o p r o t e c t i v e a g e n t s f r o m p l a n t e x t r a c t s i s a i m e d b y r e s e a r c h e r s a l l o v e r t h e g l o b e . S i n c e t h e d i s c o v e r y o f P a t t e t a l . , ( 1 9 4 9 ) t h a t c y s t e i n e p r o t e c t s a g a i n s t X - i r r a d i a t i o n i n r a t s a n d m i c e , s e v e r a l w o r k e r s a r e e n g a g e d i n a c t i v e r e s e a r c h f o r t h e s e a r c h o f r a d i o - p r o t e c t i v e c o m p o n e n t , e v e n f r o m p l a n t e x t r a c t s . J a g e t i a e t a l . , ( 2 0 0 3 ) p r o v e d t h a t n a r i n g i n , a c i t r u s f l a v o n o n e p r o t e c t s m i c e f r o m γ - i r r a d i a t e d c h r o m o s o m a l d a m a g e . K a n c h a n a p o o m e t a l . , ( 2 0 0 1 ) r e p o r t e d t h a t B a r l e r i a l u p u l i n a p l a n t i s e x t e r n a l l y u s e d a s a n a n t i - i n f l a m m a t o r y a g e n t . I t s a n t i d i a b e t i c p o t e n t i a l h a s b e e n s t a t e d b y S u b a e t a l . , ( 2 0 0 4 ) . K a n c h a n a p o o m e t a l . , ( 2 0 0 1 ) i s o l a t e d i r i d o i d g l u c o s i d e s f r o m t h e a e r i a l p a r t s o f B a r l e r i a l u p u l i n a . I n o u r p r e v i o u s e x p e r i m e n t s ( S u r a n d D a s , 2 0 1 2 ) , w e r e p o r t e d f o r t h e f i r s t t i m e t h e a n t i c a n c e r , a n t i c l a s t o g e n i c , r a d i o - p r o t e c t i v e p r o p e r t i e s o f t h e l e a f e x t r a c t o f B a r l e r i a l u p u l i n a L i n d l ; o n l a b o r a t o r y m o d e l s a s m i c e a n d a n t i t u m o r p r o p e r t y o n f i s h . I n v e s t i g a t i o n o f a c t i v e c o m p o n e n t i n t h e l e a f e x t r a c t i s c a r r i e d o u t i n t h i s s t u d y . U r s o l i c a c i d h a s b e e n f o u n d t o b e t h e m a i n c o m p o n e n t i n t h e l e a f e x t r a c t , w h i c h p e r t a i n s t o i t s a n t i c a n c e r p r o p e r t y . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S P l a n t M a t e r i a l B a r l e r i a l u p u l i n a o f A c a n t h a c e a e f a m i l y ( c o m m o n n a m e h o p h e a d P h i l i p p i n e v i o l e t ) , w a s i d e n t i f i e d f r o m t h e C e n t r a l N a t i o n a l H e r b a r i u m , B o t a n i c a l S u r v e y o f I n d i a , H o w r a h - 7 1 1 1 0 3 ( M i n i s t r y o f E n v i r o n m e n t a n d F o r e s t s , G o v t . o f I n d i a ) . L e a v e s o f t h i s p l a n t ( F i g 1 ) w e r e c l e a n e d , w a s h e d a n d d r i e d i n s h a d e . A f t e r s u f f i c i e n t d r y i n g , t h e y w e r e s u b j e c t e d t o S o x h l e t e x t r a c t i o n i n e t h a n o l a n d i t s l e a f e x t r a c t ( L E ) w a s o b t a i n e d a s d e s c r i b e d i n o u r p r e v i o u s s t u d y ( S u r a n d D a s , 2 0 1 2 ) . I n s t r u m e n t a t i o n N M R ( B r u k e r C o r p . ) w a s o p e r a t e d a t 4 0 0 M H z . D a t a w e r e r e c o r d e d b y d i s s o l v i n g 1 5 m g o f s a m p l e i n 1 m l d e u t e r a t e d c h l o r o f o r m ( C D C l 3 ) . C o l u m n c h r o m a t o g r a p h y w a s o p e r a t e d u s i n g a g l a s s c o l u m n o f 1 m e t e r l e n g t h , a n d 1 0 c m d i a m e t e r p a c k e d w i t h s i l i c a g e l C ( m e s h s i z e 1 0 0 - 2 0 0 , E M e r c k ) . C o l u m n w a s p a c k e d f o l l o w i n g w e t p a c k i n g m e t h o d , w i t h 1 0 0 % p e t r o l e u m e t h e r . S o l v e n t s y s t e m s u s e d f o r e l u t i o n w e r e p e t r o l e u m e t h e r ( n o n - p o l a r s o l v e n t ) , c h l o r o f o r m , e t h y l a c e t a t e ( m e d i u m p o l a r s o l v e n t s ) , m e t h a n o l a n d e t h a n o l ( h i g h l y p o l a r s o l v e n t s ) a c c o r d i n g t o i n c r e a s i n g o r d e r o f t h e i r p o l a r i t y . E l u t i o n w a s s t a r t e d w i t h 1 0 0 % p e t r o l e u m e t h e r ( i s o c r a t i c n o n - p o l a r s o l v e n t ) , t h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f p e t r o l e u m e t h e r w a s g r a d u a l l y d e c r e a s e d a n d t h a t o f c h l o r o f o r m w a s g r a d u a l l y i n c r e a s e d ( g r a d i e n t e l u e n t ) . T h e n 1 0 0 % c h l o r o f o r m w a s u s e d ( i s o c r a t i c e l u e n t ) . A f t e r t h i s , m e d i u m p o l a r s o l v e n t a s e t h y l a c e t a t e w a s u s e d a l o n g w i t h c h l o r o f o r m , f o r e l u t i o n ( g r a d i e n t e l u e n t ) . T h i s w a s f o l l o w e d b y 1 0 0 % e t h y l a c e t a t e ( i s o c r a t i c e l u e n t , m e d i u m p o l a r s o l v e n t ) . M e t h a n o l ( a m o r e p o l a r s o l v e n t ) w a s u s e d n e x t . T h e c o n c e n t r a t i o n o f m e t h a n o l w a s g r a d u a l l y i n c r e a s e d a n d e t h y l a c e t a t e w a s d e c r e a s e d . G r a d u a l l y 1 0 0 % m e t h a n o l w a s u s e d . A n d f i n a l l y e t h a n o l ( m o s t p o l a r s o l v e n t ) w a s u s e d t o w a s h i n g o f f t h e c o l u m n . D a s a n d S u r , 2 0 1 2 6 6 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 7 ) : 6 6 7 - 6 7 5 F i g ( i ) : L e a v e s o f B a r l e r i a l u p u l i n a

E x t r a c t i o n a n d I s o l a t i o n b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y A f t e r S o x h l a t i o n 1 . 7 5 g m o f L E w a s d i s s o l v e d i n a d e q u a t e a m o u n t o f 9 9 . 9 % e t h a n o l . T h e n i t w a s m i x e d w i t h s i l i c a g e l C , a n d d r i e d t o r e m o v e t h e s o l v e n t . T h i s w a s f u r t h e r u s e d f o r c o l u m n p a c k i n g . C o l u m n w a s p a c k e d w i t h s i l i c a g e l C m i x e d i n 1 0 0 % p e t r o l e u m e t h e r b y f o l l o w i n g w e t p a c k i n g m e t h o d . E l u t i o n w a s d o n e b y u s i n g v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f n o n - p o l a r , m e d i u m p o l a r a n d p o l a r s o l v e n t s s u c h a s p e t r o l e u m e t h e r , c h l o r o f o r m , e t h y l a c e t a t e , m e t h a n o l a n d e t h a n o l a c c o r d i n g t o t h e i r i n c r e a s i n g o r d e r o f p o l a r i t y . A f t e r e l u t i o n , e a c h f r a c t i o n w a s h e a t e d o n w a t e r b a t h t o e v a p o r a t e t h e s o l v e n t s a n d c o n c e n t r a t e t h e i r c o n s t i t u e n t s . Q u a l i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e p h y t o - c o n s t i t u e n t s p r e s e n t i n t h e f r a c t i o n s w a s p e r f o r m e d b y s t a n d a r d p h y t o c h e m i c a l t e s t s d e s c r i b e d i n T r e a s e a n d E v a n s ( 1 9 9 7 ) . P r e p a r a t i v e T L C ( f o r i d e n t i f i c a t i o n o f a c t i v e c o m p o n e n t ) P r e p a r a t i v e T L C w a s p e r f o r m e d b y u s i n g s t a n d a r d 6 0 F 2 5 4 T L C p l a t e s ( p o r e s i z e ; 6 0 Å , u v f l u o r e s c e n c e a t 2 5 4 n m , M e r c k , G e r m a n y ) . T h e s i l i c a g e l w h i c h a c t e d a s t h e s t a t i o n a r y p h a s e a n d m o b i l e p h a s e w a s c h o s e n b y t r i a l a n d e r r o r m e t h o d . V e r y s m a l l a m o u n t o f t h e f r a c t i o n s f r o m c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( t e s t ) w e r e p u t o n t h e p l a t e s w i t h t h e h e l p o f a c a p i l l a r y t u b e a l o n g w i t h t h e s t a n d a r d p h y t o - c o n s t i t u e n t s ; a n d T L C w a s r u n u s i n g t h e m o b i l e p h a s e . C o m p o n e n t s o f t h e f r a c t i o n s w e r e i d e n t i f i e d b y c o m p a r i n g w i t h R f v a l u e o f t h e s t a n d a r d s . D i f f e r e n t s t a n d a r d s a n d m o b i l e p h a s e s w e r e u s e d f o r t h e c o m p a r i s o n s t u d y . S t a n d a r d s a n d m o b i l e p h a s e t h a t s h o w e d f r u i t f u l r e s u l t s a r e s u m m e d u p i n ( T a b l e 1 ) . 1 H N M R s t u d y o f t h e f r a c t i o n s 1 H N M R o f t h e f r a c t i o n s w a s p e r f o r m e d b y d i s s o l v i n g 1 5 m g o f e a c h f r a c t i o n i n 1 m l ( C D C l 3 ) . T h e N M R m a c h i n e ( B r u k e r C o r p . ) w a s o p e r a t e d a t 4 0 0 M H z . R E S U L T S C o l u m n C h r o m a t o g r a p h y a n d P h y t o c o n s t i t u e n t s P r e s e n t ( Q u a l i t a t i v e ) A t o t a l o f 5 2 f r a c t i o n s w e r e o b t a i n e d f r o m c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y . T h e u s e o f n o n - p o l a r , m e d i u m p o l a r a n d p o l a r s o l v e n t s f o r e l u t i o n i s m e n t i o n e d i n m a t e r i a l s a n d m e t h o d s . C o m p o u n d s i n p u r e f o r m a s t e r p e n o i d s w e r e i s o l a t e d i n f r a c t i o n s 2 - 5 ( e l u t e d w i t h p e t r o l e u m e t h e r a n d c h l o r o f o r m ) , a n d i n f r a c t i o n s 1 2 a n d 1 3 ( e l u t e d w i t h e t h y l a c e t a t e a n d c h l o r o f o r m ) ; s t e r o i d s w e r e i s o l a t e d i n f r a c t i o n s 6 - 1 1 ( e l u t e d w i t h p e t r o l e u m e t h e r a n d c h l o r o f o r m ) a n d a l s o i n f r a c t i o n s 2 4 - 2 6 ( e l u t e d w i t h e t h y l a c e t a t e a n d c h l o r o f o r m ) . F u r t h e r e l u t i n g w i t h e t h y l a c e t a t e a n d m e t h a n o l i n v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s , t h e m i x t u r e y i e l d e d f l a v o n o i d i n f r a c t i o n s 3 1 - 3 5 , g l y c o s i d e i n f r a c t i o n s 2 8 - 3 0 , 4 0 - 4 4 a n d f i n a l l y s t e r o i d a g a i n i n f r a c t i o n s 4 5 - 5 2 . E a c h f r a c t i o n w a s t e s t e d f o r t h e i r n a t u r e b y p e r f o r m i n g q u a l i t a t i v e p h y t o c h e m i c a l t e s t s , s i m u l t a n e o u s l y . T h e f r a c t i o n s 1 4 - 2 3 , 2 7 a n d 3 6 - 3 9 w e r e m i x t u r e s o f c o m p o u n d s . P r e p a r a t i v e T L C ( f o r I d e n t i f i c a t i o n o f a c t i v e c o m p o n e n t ) I n f r a c t i o n N o . 1 3 , t e r p e n o i d w a s i d e n t i f i e d a s u r s o l i c a c i d ( R f v a l u e = 1 ) , i n f r a c t i o n N o . 2 4 - 2 6 , s t e r o i d D a s a n d S u r , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 7 ) : 6 6 7 - 6 7 5 6 6 9 S l N o P h y t o c h e m i c a l R e s u l t s S t a n d a r d s U s e d M o b i l e p h a s e u s e d R a t i o o f m o b i l e p h a s e 1 T e r p e n o i d U r s o l i c a c i d M e t h a n o l : c h l o r o f o r m 7 : 4 3 2 S t e r o i d β S i t o s t e r o l B e n z e n e : p e t r o l e u m e t h e r : c h l o r o f o r m : e t h y l a c e t a t e 4 : 2 : 3 : 1 3 G l y c o s i d e S i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e B e n z e n e : c h l o r o f o r m : e t h y l a c e t a t e : m e t h a n o l 1 8 : 2 : 1 : 4 T a b l e 1 S t a n d a r d s a n d m o b i l e p h a s e u s e d i n T L C t o i d e n t i f y t h e a c t i v e c o m p o n e n t b y t r i a l a n d e r r o r m e t h o d

a s β s i t o s t e r o l ( R f v a l u e = 0 . 5 9 ) a n d i n F r a c t i o n N o . 2 8 - 3 0 , g l y c o s i d e a s S i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e ( R f v a l u e = 0 . 3 5 ) ( T a b l e 2 a n d F i g 2 ) . 1 H N M R s t u d y o f t h e f r a c t i o n s T h e 1 H N M R r e s u l t s o f u r s o l i c a c i d , β s i t o s t e r o l a n d s i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e a r e s h o w n i n F i g - 3 , F i g - 4 a n d F i g - 5 r e s p e c t i v e l y . F i v e m a i n s i g n a l p e a k s a r e o b s e r v e d i n c a s e o f u r s o l i c a c i d . T h e h i g h e s t s i g n a l p e a k ( d o u b l e t ) i s o b s e r v e d a t 1 . 2 9 3 a n d 1 . 2 5 4 i n t e n s i t i e s , a n d c h e m i c a l s h i f t b e t w e e n 1 . 5 t o 1 . 1 p p m . I n c a s e o f β s i t o s t e r o l , f i v e d o u b l e t s , o n e d o u b l e t - o f - d o u b l e t s a n d o n e t r i p l e t i s o b s e r v e d , r e p r e s e n t i n g t h a t t h e p r o t o n s a r e a r r a n g e d i n t h r e e d i f f e r e n t c o u p l i n g p a t t e r n s . S o m e p e a k s i n t h i s N M R a r e a t 5 . 8 2 3 , 4 . 9 4 1 , 4 . 3 0 7 e t c s i g n a l i n t e n s i t i e s . D a s a n d S u r , 2 0 1 2 6 7 0 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 7 ) : 6 6 7 - 6 7 5 S l N o F r a c t i o n N o P h y t o c h e m i c a l R e s u l t ( t e s t ) S t a n d a r d u s e d M o b i l e p h a s e u s e d R f v a l u e o f s t a n d a r d R f v a l u e o f t e s t 1 1 3 T e r p e n o i d U r s o l i c a c i d M e t h a n o l : c h l o r o f o r m ( 7 : 4 3 ) 1 1 2 2 4 - 2 6 S t e r o i d β s i t o s t e r o l B e n z e n e : p e t r o l e u m e t h e r : c h l o r o f o r m : e t h y l a c e t a t e ( 4 : 2 : 3 : 1 ) 0 . 5 9 0 . 5 9 3 2 8 - 3 0 G l y c o s i d e S i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e B e n z e n e : c h l o r o f o r m : e t h y l a c e t a t e : m e t h a n o l ( 1 8 : 2 : 1 : 4 ) 0 . 3 5 0 . 3 5 T a b l e 2 P r e p a r a t i v e T L C : I d e n t i f i c a t i o n o f t e r p e n o i d , s t e r o i d a n d g l y c o s i d e b y c o m p a r i s o n w i t h c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e s t a n d a r d s F i g 2 I d e n t i f i c a t i o n o f t e r p e n o i d , s t e r o i d a n d g l y c o s i d e b y c o m p a r i s o n w i t h s t a n d a r d s b y T L C ( t h e c o r r e s p o n d i n g R f v a l u e s a r e s h o w n ) M - 1 4 , C - 1 6 B - G P e t - 2 , C - 3 , E t o n e - 1 B - 1 8 , C - 2 , E t o n e - 1 , M e c h - 4

T h i r d l y , t h e N M R d a t a o f S i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e r e v e a l s t h r e e p e a k s , a m o n g w h i c h , t h e h i g h e s t s i g n a l i n t e n s i t y i s 1 . 2 5 4 b e t w e e n 7 1 . 3 0 p p m c h e m i c a l s h i f t s . C h e m i c a l s t r u c t u r e o f t h e a c t i v e c o m p o n e n t s T h e c h e m i c a l s t r u c t u r e s o f u r s o l i c a c i d ( F u r t a d o e t a l . , 2 0 0 8 ) , β s i t o s t e r o l ( h t t p : / / w e b p r o d . h c - s c . g c . c a ) a n d S i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e ( M i z u s h i n a e t a l . , 2 0 0 6 ) a r e s h o w n i n F i g - 6 , F i g - 7 a n d F i g - 8 r e s p e c t i v e l y . D I S C U S S I O N U r s o l i c a c i d i s a p e n t a c y c l i c t r i t e r p e n o i d a n d i s a m a j o r c o m p o n e n t o f t r a d i t i o n a l m e d i c i n a l h e r b s D a s a n d S u r , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 7 ) : 6 6 7 - 6 7 5 6 7 1 F i g 3 1 H N M R s t u d y o f u r s o l i c a c i d F i g 4 1 H N M R s t u d y o f β s i t o s t e r o l

( L a i e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h e f i v e s i g n a l p e a k s o b t a i n e d i n o u r N M R r e s u l t r e p r e s e n t s i t s p e n t a c y c l i c n a t u r e . T h e h i g h e s t p e a k w h i c h i s a d o u b l e t r e p r e s e n t s t h e s i n g l e p r o t o n o f t h e O H g r o u p w h i c h i s n e a r t h e = O g r o u p a t t h e r i g h t h a n d s i d e o f F i g ( v i ) . T h e o t h e r w e a k s i g n a l p e a k s a r e f o r t h e p r o t o n s a t t h e s i d e c h a i n s . T h i s t r i t e r p e n o i d h a s s h o w n a n t i - u l c e r ( O v e s n á e t a l . , 2 0 0 4 ) , a n t i - i n f l a m m a t o r y , a n a l g e s i c ( V a s c o n c e l o s e t a l . , 2 0 0 6 ) a n t i o x i d a n t ( J u n e t a l . , 2 0 1 0 ) a c t i v i t i e s e t c . I t h a s p o t e n t a n t i t u m o r a c t i v i t y a l s o ( F u r t a d o e t a l . , 2 0 0 8 ) . U r s o l i c a c i d a c t s o n d i f f e r e n t s t a g e s o f t u m o r d e v e l o p m e n t a s t u m o r i n i t i a t i o n a n d p r o m o t i o n a n d a l s o p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t u m o r c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a p o p t o s i s ( F u r t a d o e t a l . , 2 0 0 8 ) . P a t h a k e t a l . , ( 2 0 0 7 ) h a d s h o w n t h a t t h i s t e r p e n o i d i n h i b i t s S T A T 3 a c t i v a t i o n p a t h w a y , l e a d i n g t o t h e s u p p r e s s i o n o f H u m a n M u l t i p l e M y e l o m a C e l l s . S u b b a r a m a i a h e t a l . , ( 2 0 0 0 ) p r o v e d t h a t u r s o l i c a c i d s u p p r e s s e s t h e a c t i v a t i o n o f C O X - 2 g e n e e x p r e s s i o n b y i n h i b i t i n g t h e P K C s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y . β s i t o s t e r o l i s w i d e l y a v a i l a b l e i n a v a r i e t y o f p l a n t a n d p l a n t p a r t s . T h e f i v e d o u b l e t s , o n e d o u b l e t o f D a s a n d S u r , 2 0 1 2 6 7 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 7 ) : 6 6 7 - 6 7 5 F i g 6 S t r u c t u r e o f u r s o l i c a c i d F i g 7 S t r u c t u r e o f β s i t o s t e r o l F i g 5 1 H N M R s t u d y o f S i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e

d o u b l e t s a n d o n e t r i p l e t i s o b s e r v e d i n o u r N M R s t u d y o f i n t h i s s t e r o i d r e p r e s e n t t h e h e x a c y c l i c a n d p e n t a c y c l i c g r o u p s ; t h e c o n n e c t i n g c h a i n a n d t h e m e t h y l g r o u p s r e s p e c t i v e l y . T h i s s t e r o l i s r e p o r t e d i n t h e t r e a t m e n t o f b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a ( B e r g e s e t a l . , 1 9 9 5 ) . C a r i n e e t a l . , ( 2 0 0 6 ) p r o v e d t h a t b e t a - s i t o s t e r o l i n c o m b i n a t i o n w i t h p o l y p h e n o l s f r o m c o c o a i n h i b i t s p r o l i f e r a t i o n o f p r o s t a t i c c a n c e r c e l l g r o w t h . S i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e f a l l s u n d e r t h e c l a s s β D g l y c o s i d e . T h e t h r e e p e a k s o f S i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e o u r N M R s t u d y r e p r e s e n t t h e g l u c o - p y r a n o s e s u g a r , c y c l o - h e x a g o n a n d c y c l o - p e n t a g o n g r o u p s a n d t h e f r e e s i d e c h a i n s ( F i g ( v i i i ) . G o h a r e t a l . , ( 2 0 0 9 ) h a d r e p o r t e d t h a t m e t h a n o l i c e x t r a c t s o f s e e d s o f C e r a t o n i a s i l i q u a L . h a s a r i c h s o u r c e o f n a t u r a l a n t i o x i d a n t s , w h i c h c o n t a i n s β - s i t o s t e r o l - 3 - O - β - D - g l u c o s i d e a l o n g w i t h o t h e r f l a v o n o l g l y c o s i d e s . I n t h e p r e s e n t w o r k , w e a r e t h e f i r s t t o r e p o r t t h e r i c h s o u r c e o f u r s o l i c a c i d , β s i t o s t e r o l a n d s i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e i n l e a v e s a n d o t h e r p a r t s o f t h e p l a n t , B a r l e r i a l u p u l i n a . I t i s d i s c u s s e d a b o v e t h a t u r s o l i c a c i d a n d β s i t o s t e r o l s h o w p o t e n t a n t i c a n c e r a c t i v i t y a n d s i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e h a s a n t i o x i d a n t a c t i v i t y . L e a f e x t r a c t o f B a r l e r i a l u p u l i n a c o n t a i n i n g t h e s e c o m p o n e n t s , h a s b e e n f o u n d b y u s t o h a v e a n t i c l a s t o g e n i c a n d a n t i t u m o r a c t i v i t y ( i n m i c e a n d f i s h ) w h i c h h a d b e e n d i s c u s s e d i n o u r p r e v i o u s w o r k ( S u r a n d D a s , 2 0 1 2 ) . T h e r e f o r e i n c o n j u g a t i o n w i t h u r s o l i c a c i d , t h e s e c o m p o n e n t s t o g e t h e r a c t a s a p o t e n t a n t i c a n c e r a g e n t i n m i c e a n d f i s h m o d e l s . W e a l s o r e p o r t t h e a n t i c a n c e r a c t i v i t y i n e t h a n o l i c e x t r a c t s o f l e a v e s o f B a r l e r i a l u p u l i n a , d u e t o t h e p r e s e n c e o f u r s o l i c a c i d ; f o r t h e f i r s t t i m e . A n t i c l a s t o g e n i c , r a d i o - p r o t e c t i v e , a n t i - t u m o r a n d a n t i - c a n c e r a c t i v i t i e s f r o m t h i s p l a n t e x t r a c t h a s b e e n a p p l i e d t o G o v t . o f I n d i a f o r p a t e n t i n g , b y u s ( S u r a n d D a s , 2 0 1 2 ) . A C K N O W L E D G E M E N T S T h e a u t h o r s a r e h i g h l y t h a n k f u l t o t h e U n i v e r s i t y G r a n t C o m m i s s i o n , B a h a d u r S h a h Z a f a r M a r g , N e w D e l h i - 1 1 0 0 0 2 , f o r p r o v i d i n g f i n a n c i a l s u p p o r t i n t h e f o r m o f U G C M a j o r R e s e a r c h P r o j e c t i n Z o o l o g y , 2 0 1 1 e n t i t l e d A s s e s s m e n t o f p r o t e c t i v e r o l e o f s o m e a y u r v e d i c f o r m u l a t i o n s o n a r t i f i c i a l m u t a g e n e s i s i n s o m e m a m m a l i a n m o d e l s m i c e M u s m u s c u l u s a n d s h r e w S u n c u s m u r i n u s ) ( F . N o : 3 9 - 5 7 9 / 2 0 1 0 ( S R ) ) . T h e a u t h o r s a l s o h i g h l y a c k n o w l e d g e P r o f . P a n d e y ( T h e P r i n c i p a l ) a n d M s . M o u l i s h a B i s w a s , B e n g a l I n s t i t u t e o f P h a r m a c e u t i c a l S c i e n c e s , K a l y a n i , N a d i a , W e s t B e n g a l , I n d i a , f o r h e l p i n g i n t h e w o r k o n c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y , T L C a n d P h y t o c h e m i c a l a n a l y s i s . M o r e o v e r D r . S u k h e n D a s o f D e p t . o f P h y s i c s , J a d a v p u r U n i v e r s i t y i s a c k n o w l e d g e d f o r h i s g r e a t c o o p e r a t i o n i n P h . D . r e g i s t r a t i o n o f t h e f i r s t a u t h o r . R E F E R E N C E S B e r g e s R R , W i n d e l e r J , T r a m p i s c h H J , S e n g e T . 1 9 9 5 . β - S i t o s t e r o l S t u d y G r o u p . R a n d o m i s e d , p l a c e b o - c o n t r o l l e d , d o u b l e - b l i n d c l i n i c a l t r i a l o f β - s i t o s t e r o l i n p a t i e n t s w i t h b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a . T h e L a n c e t . 3 4 5 ( 8 9 6 4 ) : 1 5 2 9 - 1 5 3 2 . D a s a n d S u r , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 7 ) : 6 6 7 - 6 7 5 6 7 3 F i g 8 S t r u c t u r e o f S i t o s t e r o l - 3 - O - g l u c o s i d e

C a r i n e J , G u i l l a u m e T , A l a i n D , P h i l i p p e T , D i r k P . 2 0 0 6 . I n - v i t r o e f f e c t s o f p o l y p h e n o l s f r o m c o c o a a n d [ b e t a ] - s i t o s t e r o l o n t h e g r o w t h o f h u m a n p r o s t a t e c a n c e r a n d n o r m a l c e l l s . E u r J C a n c e r P r e v . , 1 5 ( 4 ) : 3 5 3 - 3 6 1 . F u r t a d o R A , R o d r i g u e s É P , A r a ú j o F R R , O l i v e i r a W L , F u r t a d o M A , C a s t r o M B , C u n h a W R , T a v a r e s D C . 2 0 0 8 . U r s o l i c a c i d a n d o l e a n o l i c a c i d s u p p r e s s p r e n e o p l a s t i c l e s i o n s i n d u c e d b y 1 , 2 - D i m e t h y l h y d r a z i n e i n r a t c o l o n . T o x P a t h . 3 6 : 5 7 6 - 5 8 0 . G o h a r A , G e d a r a S R , B a r a k a H N . 2 0 0 9 . N e w a c y l a t e d f l a v o n o l g l y c o s i d e f r o m C e r a t o n i a s i l i q u a L . s e e d s . J M e d P l a n t R e s e a r c h . 3 ( 5 ) : 4 2 4 - 4 4 8 . J a g e t i a G C , V e n k a t e s h a V A , R e d d y T K . 2 0 0 3 . N a r i n g i n , a c i t r u s f l a v o n o n e , p r o t e c t s a g a i n s t r a d i a t i o n - i n d u c e d c h r o m o s o m e d a m a g e i n m o u s e b o n e m a r r o w . M u t a g e n e s i s 1 8 ( 4 ) : 3 3 7 - 3 4 3 . J u n L , D o n g - m e i W , Y u a n - l i n Z , B i n H , Z i - f e n g Z , Q i n Y , C h a n - m i n L , Q u n S , Y o n g - j i a n W . 2 0 1 0 . U r s o l i c a c i d a t t e n u a t e s D - g a l a c t o s e - i n d u c e d i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e i n m o u s e p r e f r o n t a l c o r t e x t h r o u g h i n h i b i t i n g A G E s / R A G E / N F - k B p a t h w a y a c t i v a t i o n . C e r C o r . , 2 0 : 2 5 4 0 - 2 5 4 8 . K a n c h a n a p o o m T , K a s a i R , Y a m a s a k i K . 2 0 0 1 . I r i d o i d g l u c o s i d e s f r o m B a r l e r i a l u p u l i n a . P h y t o c h e m i s t r y . 5 8 : 3 3 7 - 3 4 1 . L a i M Y , L e u n g H W C , Y a n g W H , C h e n W H , L e e H Z . 2 0 0 7 . U p - r e g u l a t i o n o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e f a m i l y g e n e i n v o l v e m e n t i n u r s o l i c a c i d - i n d u c e d h u m a n l u n g n o n - s m a l l c a r c i n o m a c e l l a p o p t o s i s . A n t i c a n c e r R e s . , 2 7 : 1 4 5 - 1 5 4 . O v e s n á Z , V a c h a l k o v a A , H o r v a t h o v a K , T o t h o v a D . 2 0 0 4 . P e n t a c y c l i c t r i t e r p e n o i c a c i d s : n e w c h e m o p r o t e c t i v e c o m p o u n d s [ m i n i r e v i e w ] . N e o p l a s m a 5 1 : 3 2 7 - 3 3 . P a t h a k A K , B h u t a n i M , N a i r A S , A h n K S , C h a k r a b o r t y A , K a d a r a H , G u h a S , S e t h i G , A g g a r w a l B B . 2 0 0 7 . U r s o l i c a c i d i n h i b i t s S T A T 3 a c t i v a t i o n p a t h w a y l e a d i n g t o s u p p r e s s i o n o f p r o l i f e r a t i o n a n d c h e m o s e n s i t i z a t i o n o f H u m a n M u l t i p l e M y e l o m a c e l l s . M o l C a n c e r R e s . , 5 : 9 4 3 - 9 5 5 . P a t t H M , T y r e e E B , S t r a u b e R L , S m i t h D E . 1 9 4 9 . C y s t e i n e p r o t e c t s a g a i n s t X - i r r a d i a t i o n . S c i e n c e . 1 1 0 : 2 1 3 - 2 1 4 . S u b a V , M u r u g e s a n T , R a o R B , G h o s h L , P a l M , M a n d a l S C , S a h a B P . 2 0 0 4 . A n t i d i a b e t i c p o t e n t i a l o f B a r l e r i a l u p u l i n a e x t r a c t i n r a t s . F i t o t e r a p i a . 7 5 ( 1 ) : 1 - 4 . S u b b a r a m a i a h K , M i c h a l u a r t P , S p o r n M B , D a n n e n b e r g A J . 2 0 0 0 . U r s o l i c a c i d i n h i b i t s c y c l o o x y g e n a s e - 2 t r a n s c r i p t i o n i n h u m a n m a m m a r y e p i t h e l i a l c e l l s . C a n c e r R e s . , 6 0 : 2 3 9 9 - 2 4 0 4 . S u r P K , D a s P K . 2 0 1 2 . R a d i o - p r o t e c t i v e a n d a n t i - c l a s t o g e n i c e f f e c t s o f B a r l e r i a l u p u l i n a L i n d l . e x t r a c t a g a i n s t γ ( g a m m a ) - r a y ( 1 . 2 G y ) i n d u c e d m i t o t i c c h r o m o s o m a l a b e r r a t i o n s o f l a b o r a t o r y m i c e M u s m u s c u l u s a n d i t s e f f e c t o n f i s h t u m o r i n d u c e d a f t e r γ - i r r a d i a t i o n . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y . 2 ( 5 ) : 4 3 9 - 4 4 7 . S u r P K a n d D a s P K . 2 0 1 2 . A P r o c e s s o f E x t r a c t i n g B a r l e r i a l u p u l i n a L i n d l . a n d t h e p r o d u c t t h e r e o f ( P a t e n t ) . P a t e n t N o - 6 3 9 / K O L / 2 0 1 2 , D a t e - 0 7 / 0 6 / 2 0 1 2 , G o v t . o f I n d i a . D a s a n d S u r , 2 0 1 2 6 7 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 7 ) : 6 6 7 - 6 7 5

T r e a s e G E a n d E v a n s W C . 1 9 9 7 . P h a r m a c o g n o s y , f o u r t e e n t h e d . M a c M i l l i a n P u b l . L t d . , L o n d o n . V a s c o n c e l o s M A , R o y o V A , F e r r e i r a D S , C r o t t i A E , S i l v a M L A , C a r v a l h o J C , B a s t o s J K , C u n h a W R . 2 0 0 6 . I n v i v o a n a l g e s i c a n d a n t i - i n f l a m m a t o r y a c t i v i t i e s o f u r s o l i c a c i d a n d o l e a n o l i c a c i d f r o m M i c o n i a a l b i c a n s . Z N a t u r f o r s c h 6 1 : 4 7 7 - 8 2 . M i z u s h i n a Y , N a k a n i s h i R , K u r i y a m a I , K a m i y a K , S a t a k e T . 2 0 0 6 . β - S i t o s t e r o l - 3 - O - β - d - g l u c o p y r a n o s i d e : A e u k a r y o t i c D N A p o l y m e r a s e λ i n h i b i t o r . J S t e r o i d B i o c h e m a n d M o l B i o . , 9 9 ( 2 - 3 ) : 1 0 0 - 1 0 7 . h t t p : / / w e b p r o d . h c - s c . g c . c a / n h p i d - b d i p s n / i n g r e d R e q . d o ? i d = 3 6 1 8 & l a n g = e n g D a s a n d S u r , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 7 ) : 6 6 7 - 6 7 5 6 7 5 S u b m i t y o u r a r t i c l e s o n l i n e a t j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m A d v a n t a g e s E a s y o n l i n e s u b m i s s i o n C o m p l e t e P e e r r e v i e w A f f o r d a b l e C h a r g e s Q u i c k p r o c e s s i n g E x t e n s i v e i n d e x i n g Y o u r e t a i n y o u r c o p y r i g h t s u b m i t @ j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / S u b m i t . p h p .