J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y E f f e c t o f e x t r a c t o f B a c i l l u s m e g a t e r i u m 9 5 5 4 o n o r a l c a n c e r c e l l l i n e S C C 1 3 1 K e y w o r d s : A p o p t o s i s , F l o w c y t o m e t r y , B a c i l l u s , C a n c e r . A B S T R A C T : A m i c r o b e , i d e n t i f i e d a s B a c i l l u s m e g a t e r i u m 9 5 4 4 w a s i s o l a t e d f r o m t h e s o i l s a m p l e c o l l e c t e d f r o m M a n a l i , H i m a c h a l P r a d e s h . T h e b a c t e r i a l b r o t h e x t r a c t h a d t h e p r e s e n c e o f c o m p o u n d ( s ) t h a t i n d u c e d a p o p t o t i c l i k e f e a t u r e s o n o r a l c a n c e r c e l l s , l i k e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s , c o n d e n s a t i o n o f n u c l e u s a n d d e t a c h m e n t o f c a n c e r c e l l s f r o m t h e s u r f a c e o f c u l t u r e v e s s e l . T h e e x t r a c t d i d n o t c a u s e a n y k i n d o f c h a n g e s i n m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p o t e n t i a l a s e v i d e n c e d f r o m f l o w c y t o m e t r i c a n a l y s i s a n d d i d n o t c a u s e f r a g m e n t a t i o n o f n u c l e a r D N A . T h i s p a r t i c u l a r c o m p o u n d ( s ) w h i c h w a s p r e s e n t i n t h e b a c t e r i a l e x t r a c t s e e m e d t o i n d u c e o n l y a w e a k a p o p t o t i c s i g n a l t h a t d i d n o t l e a d t o c o m p l e t e p r o g r e s s i o n o f a p o p t o s i s . 5 2 3 - 5 2 8 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 5 T h i s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m A u t h o r s : V i p i n M o h a n D a n 1 , V i n i t h a R i c h a r d 2 , A s h a N a i r 2 , P a l p u P u s h p a n g a d a n 1 , V a r u g h e s e G e o r g e 1 , A j i t V a r m a 3 a n d R a d h a k r i s h n a P i l l a i 2 . I n s t i t u t i o n : 1 . A m i t y I n s t i t u t e o f H e r b a l a n d B i o t e c h P r o d u c t D e v e l o p m e n t , T r i v a n d r u m , K e r a l a . 2 . D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r M e d i c i n e , R a j i v G a n d h i C e n t r e f o r B i o t e c h n o l o g y , T r i v a n d r u m , K e r a l a . 3 . A m i t y I n s t i t u t e o f M i c r o b i a l T e c h n o l o g y , A m i t y U n i v e r s i t y , N o i d a , U t t a r P r a d e s h . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : V i p i n M o h a n D a n a n d A j i t V a r m a . P h o n e N o : ( 0 4 7 1 ) 2 4 3 2 1 3 8 . F a x + 9 1 1 2 0 2 4 3 1 2 6 8 E m a i l : v i p i n d a n @ y a h o o . c o . i n W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / d o c u m e n t s / R A 0 2 6 2 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 3 J u l 2 0 1 2 A c c e p t e d : 1 8 J u l 2 0 1 2 P u b l i s h e d : 2 5 J u l 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : V i p i n M o h a n D a n , V i n i t h a R i c h a r d , A s h a N a i r , P a l p u P u s h p a n g a d a n , V a r u g h e s e G e o r g e , A j i t V a r m a a n d R a d h a k r i s h n a P i l l a i . E f f e c t o f e x t r a c t o f B a c i l l u s m e g a t e r i u m 9 5 5 4 o n o r a l c a n c e r c e l l l i n e S C C 1 3 1 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 5 ) : 5 2 3 - 5 2 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y O r i g i n a l R e s e a r c h J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l

I N T R O D U C T I O N S o i l b a c t e r i a h a v e b e e n a t r e a s u r e o f m a n y v a l u a b l e n a t u r a l p r o d u c t s r a n g i n g f r o m a n t i b i o t i c s , a n t i c a n c e r c o m p o u n d s t o o t h e r s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s o f i n d u s t r i a l a n d a g r i c u l t u r a l i m p o r t a n c e . M i c r o b e s h a v e a p e r p l e x i n g r e l a t i o n w i t h h u m a n s , f r o m m u t u a l b e n e f i c i a l a s s o c i a t i o n s i n t h e h u m a n b o d y , t o t h e f a t a l d i s e a s e s t h a t o t h e r m e m b e r s c a u s e a n d t h e c o u n t e r a c t i v e c o m p o u n d s y e t o t h e r f a m i l y m e m b e r s p r o d u c e t o w a r d - o f f o r c u r e s u c h i n f e c t i o n s . C a n c e r i s o n e o f t h e d i s e a s e s w h e r e i n t e n s i v e r e s e a r c h i s c a r r i e d o u t g l o b a l l y i n s e a r c h o f a c u r e . S o i l b a c t e r i a h a v e c o n t r i b u t e d i m m e n s e l y i n p r o d u c i n g m a n y c l i n i c a l l y v i a b l e a n t i c a n c e r d r u g s . A c t i n o m y c i n D i s t h e o l d e s t m i c r o b i a l m e t a b o l i t e u s e d i n c a n c e r t h e r a p y . I t s r e l a t i v e , a c t i n o m y c i n A , w a s t h e f i r s t a n t i b i o t i c i s o l a t e d f r o m a c t i n o m y c e t e s a n d w a s o b t a i n e d f r o m S t r e p t o m y c e s a n t i b i o t i c u s b y W a k s m a n a n d W o o d r u f f ( 1 9 4 1 ) . A n t h r a c y c l i n e s r a n k a m o n g t h e m o s t e f f e c t i v e a n t i c a n c e r d r u g s e v e r d e v e l o p e d ( W e i s s , 1 9 9 2 ) . T h e y a r e e f f e c t i v e a g a i n s t m o s t t y p e s o f c a n c e r t h a n a n y o t h e r c l a s s o f c h e m o t h e r a p y a g e n t s . T h e y a r e u s e d t o t r e a t a w i d e r a n g e o f c a n c e r s , i n c l u d i n g l e u k e m i a s , l y m p h o m a s , a n d b r e a s t , u t e r i n e , o v a r i a n a n d l u n g c a n c e r s . A n t h r a c y c l i n e s a c t b y i n t e r c a l a t i n g D N A s t r a n d s , w h i c h r e s u l t i n a c o m p l e x f o r m a t i o n t h a t i n h i b i t s t h e s y n t h e s i s o f D N A a n d R N A . I t a l s o t r i g g e r s D N A c l e a v a g e b y t o p o i s o m e r a s e I I , r e s u l t i n g i n m e c h a n i s m s t h a t l e a d t o c e l l d e a t h ( W e i s s 1 9 9 2 ) . A m o n g t h e B a c i l l u s s p e c i e s , a c l a s s o f p r o t e i n c a l l e d P a r a s p o r i n s t h a t c o m e u n d e r C r y p r o t e i n s p r o d u c e d b y B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s h a d s h o w n c y t o c i d a l a c t i v i t y a g a i n s t h u m a n c a n c e r c e l l l i n e s ( M i z u k i e t a l . , 2 0 0 0 ) . I n a n o t h e r s t u d y B a c i l l u s v a l l i s m o r t i s B I T - 3 3 p r o d u c e d a c o m p o u n d o f a n t i c a n c e r n a t u r e t h a t w a s e f f e c t i v e a g a i n s t v a r i o u s c o l o n c a n c e r c e l l l i n e s ( J e o n g e t a l . , 2 0 0 8 ) . T h e p r e s e n t s t u d y i n v o l v e s t h e i n v e s t i g a t i o n o f c u l t u r e e x t r a c t s o f B a c i l l u s m e g a t e r i u m 9 5 5 4 f o r p r e s e n c e o f c o m p o u n d ( s ) w i t h a n t i c a n c e r p o t e n t i a l . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S C a n c e r c e l l l i n e H u m a n o r a l c a n c e r c e l l l i n e S C C 1 3 1 w a s p r o c u r e d f r o m N a t i o n a l C e n t r e f o r C e l l S c i e n c e s ( N C C S , P u n e ) . T h e c e l l l i n e w a s g r o w n i n D M E M ( D u l b e c c o ’ s M o d i f i e d E a g l e M e d i a ) m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 p e r c e n t F B S ( F e t a l B o v i n e S e r u m ) i n a 5 p e r c e n t C O 2 i n c u b a t o r a t 3 7 ° C . A n t i b i o t i c s p e n i c i l l i n ( 1 0 0 µ g / m L ) a n d s t r e p t o m y c i n ( 1 0 0 µ g / m L ) w e r e a l s o a d d e d i n t o t h e m e d i u m t o a v o i d a n y b a c t e r i a l c o n t a m i n a t i o n . M i c r o o r g a n i s m T h e b a c t e r i a l s t r a i n u s e d i n t h i s s t u d y w a s B a c i l l u s m e g a t e r i u m 9 5 5 4 , w h i c h w a s p r e v i o u s l y i s o l a t e d f r o m s o i l s a m p l e s c o l l e c t e d f r o m M a n a l i , H i m a c h a l P r a d e s h . T h e b a c t e r i a l c u l t u r e w a s r o u t i n e l y m a i n t a i n e d o n N u t r i e n t a g a r s l a n t s . T h e o r g a n i s m w a s s u b c u l t u r e d e v e r y m o n t h . T h e b a c t e r i a l i s o l a t e w a s i d e n t i f i e d b a s e d o n m o r p h o l o g i c a l , p h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a s d e s c r i b e d i n B e r g e y ’ s m a n u a l o f d e t e r m i n a t i v e b a c t e r i o l o g y ( H o l t e t a l . , 1 9 9 4 ) . B a c t e r i a l e x t r a c t T h e b a c t e r i a l c u l t u r e w a s g r o w n i n n u t r i e n t b r o t h a t 1 5 0 r p m , 3 7 ° C f o r 4 8 h . T h e b r o t h w a s c e n t r i f u g e d a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s f i l t e r e d t o r e m o v e b a c t e r i a . T h e p H o f s u p e r n a t a n t w a s a d j u s t e d t o 2 w i t h C o n c . H C l a n d t h e n c e n t r i f u g e d a t 1 6 , 0 0 0 g , 1 0 m i n a t 4 ° C . T h e p r e c i p i t a t e o b t a i n e d w a s d i s s o l v e d i n D i m e t h y l s u l p h o x i d e : D M E M ( 5 0 : 5 0 ) , p H w a s m a i n t a i n e d a t 8 , f i l t e r e d t h r o u g h 0 . 2 µ m f i l t e r a n d k e p t a t - 2 0 ° C . M i c r o s c o p i c a n a l y s i s a n d M T T a s s a y C a n c e r c e l l s w e r e s e e d e d i n 9 6 - w e l l p l a t e s a t a d e n s i t y o f 5 0 0 0 c e l l s p e r w e l l . T h e a t t a c h e d c e l l s w e r e i n c u b a t e d f o r 2 4 h a n d t h e n t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s ( 2 5 µ g , 5 0 µ g , 1 0 0 µ g , 1 5 0 µ g , 2 0 0 µ g , 3 0 0 µ g a n d 4 0 0 µ g p e r m l o f D M E M m e d i u m ) o f b a c t e r i a l e x t r a c t , a n d w e r e t h e n i n c u b a t e d f o r 2 4 a n d D a n e t a l . , 2 0 1 2 5 2 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 5 ) : 5 2 3 - 5 2 8

4 8 h . T h e c e l l s w e r e v i s u a l l y a n a l y z e d w i t h m i c r o s c o p e f o r m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s . T h e c e l l v i a b i l i t y w a s d e t e r m i n e d w i t h 2 0 µ l o f M T T s o l u t i o n ( 5 m g / m l ) . T h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d f o r 4 h a t 3 7 ° C . D M S O w a s u s e d t o d i s s o l v e t h e f o r m a z a n c r y s t a l s t h a t f o r m e d a n d s o l u b l e f o r m a z a n p r o d u c t w a s s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y q u a n t i f i e d u s i n g a n E L I S A r e a d e r a t 5 7 5 n m . N u c l e a r S t a i n i n g w i t h H o e c h s t 3 3 4 2 T r y p s i n i z e d c e l l s w e r e s e e d e d i n t o 1 2 w e l l p l a t e s a t 1 0 , 0 0 0 c e l l s p e r w e l l a n d k e p t f o r 2 4 h i n c u b a t i o n . T h e s p e n t m e d i a w a s a s p i r a t e d a n d c e l l s w e r e r i n s e d w i t h P B S , d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f t h e b a c t e r i a l e x t r a c t w e r e a d d e d t o r e s p e c t i v e w e l l s . P l a t e s w e r e p l a c e d i n c a r b o n d i o x i d e i n c u b a t o r . A f t e r 2 4 a n d 4 8 h e a c h w e l l w a s i n c u b a t e d w i t h H o e c h s t 3 3 4 2 ( 5 µ l / m L ) f o r a n o t h e r 1 5 m i n a t 3 7 ° C i n c a r b o n d i o x i d e i n c u b a t o r . T h e s a m p l e s w e r e a n a l y z e d t h r o u g h f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e . M i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p o t e n t i a l a n a l y s i s M i t o P r o b e ™ J C - 1 A s s a y K i t p r o c u r e d f r o m L i f e t e c h n o l o g i e s w a s u s e d f o r a n a l y z i n g m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p o t e n t i a l o f c o n t r o l a n d t r e a t e d o r a l c a n c e r c e l l l i n e b y f l o w c y t o m e t r y . C e l l s w e r e c u l t u r e d i n 1 2 w e l l p l a t e s a t a d e n s i t y o f 5 x 1 0 5 c e l l s p e r w e l l a n d i n c u b a t e d i n C O 2 i n c u b a t o r f o r o v e r n i g h t a t 3 7 ° C . T h e c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h b a c t e r i a l e x t r a c t a n d u n t r e a t e d c e l l s w e r e t a k e n a s c o n t r o l a n d i n c u b a t e d f o r 4 8 h . A f t e r t h e i n c u b a t i o n p e r i o d 1 0 0 µ l o f J C - 1 s t a i n i n g s o l u t i o n w a s a d d e d p e r m L o f c u l t u r e m e d i u m t o e a c h w e l l o f t h e p l a t e . T h e c e l l s w e r e i n c u b a t e d i n a C O 2 i n c u b a t o r a t 3 7 ° C f o r 1 5 - 3 0 m i n . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d f r o m e a c h w e l l a n d w e r e a n a l y z e d u s i n g f l o w c y t o m e t r y . D N A F r a g m e n t a t i o n a s s a y O r a l c a n c e r c e l l s w e r e p l a t e d i n c u l t u r e p l a t e s a t a d e n s i t y o f 1 x 1 0 5 / m l a n d t h e n t r e a t e d s e p a r a t e l y w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f b a c t e r i a l e x t r a c t ( 1 5 0 µ g / m l a n d 3 0 0 µ g / m l ) a n d c u r c u m i n ( 1 0 0 µ g / m l ) f o r 4 8 h . D N A w a s e x t r a c t e d b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y M o r i e t a l . , ( 2 0 0 1 ) . D N A f r a g m e n t a t i o n w a s a n a l y z e d o n a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . D a n e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 5 ) : 5 2 3 - 5 2 8 5 2 5 F i g u r e 1 : E f f e c t o f e x t r a c t t r e a t m e n t o n o r a l c a n c e r c e l l l i n e . C h a n g e s i n c e l l m o r p h o l o g y w e r e o b s e r v e d o n t r e a t m e n t w i t h e x t r a c t . F i g u r e 2 : N u c l e a r s t a i n i n g w i t h H o e c h s t 3 3 4 2 a s s a y . C o n d e n s a t i o n o f n u c l e u s ( i n t e n s e b r i g h t f l u o r e s c e n c e ) w a s o b s e r v e d i n t h e t w o e x t r a c t t r e a t m e n t s a s c o m p a r e d t o c o n t r o l c a n c e r c e l l s a t 4 8 h .

R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N B a c i l l u s m e g a t e r i u m 9 5 5 4 w a s i d e n t i f i e d b a s e d o n m o r p h o l o g i c a l , b i o c h e m i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ( T a b l e 1 ) a s p e r t h e B e r g e y ’ s m a n u a l o f d e t e r m i n a t i v e b a c t e r i o l o g y ( H o l t e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e t r e a t m e n t w i t h e x t r a c t c a u s e d m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s i n c a n c e r c e l l s a s e v i d e n c e d f r o m m i c r o s c o p i c a n a l y s i s , t h e c e l l s l o s t t h e i r s t r i a t e d s h a p e , a t t a i n e d a r o u n d e d m o r p h o l o g y a n d d e t a c h e d f r o m s u r f a c e o f c u l t u r e v e s s e l ( f i g . 1 ) . I n i t i a l a n a l y s i s w i t h M T T a s s a y r e v e a l e d t h a t m o r p h o l o g i c a l l y r e d e f i n e d c e l l s w e r e v i a b l e a s i t u t i l i z e d M T T t h e r e b y s i g n i f y i n g t h e p r e s e n c e o f i n t a c t m i t o c h o n d r i a w i t h m i t o c h o n d r i a l d e h y d r o g e n a s e e n z y m e r e s p o n s i b l e f o r c l e a v i n g t h e y e l l o w M T T t o b l u e f o r m a z a n c r y s t a l s . T w o c o n c e n t r a t i o n s o f t h e b a c t e r i a l e x t r a c t , 1 5 0 µ g a n d 3 0 0 µ g , t h a t p r o d u c e d e f f e c t i v e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e i n m o r e t h a n 5 0 % o f t h e c e l l s w e r e s e l e c t e d f o r f u r t h e r s t u d y . H o e c h s t s t a i n i n g r e v e a l e d t h a t t h e o r a l c e l l l i n e s h o w e d c o n d e n s a t i o n o f n u c l e u s o n t r e a t m e n t w i t h b a c t e r i a l e x t r a c t ( f i g . 2 ) . D u r i n g t h e e a r l y p r o c e s s o f a p o p t o s i s , c e l l s h r i n k a g e a n d p y k n o s i s a r e v i s i b l e b y l i g h t m i c r o s c o p y ( K e r r e t a l . , 1 9 7 2 ) . P y k n o s i s i s t h e r e s u l t o f c h r o m a t i n c o n d e n s a t i o n a n d t h i s i s t h e m o s t c h a r a c t e r i s t i c f e a t u r e o f a p o p t o s i s ( E l m o r e 2 0 0 7 ) . M i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p o t e n t i a l a s s a y , r e v e a l e d t h a t t h e b a c t e r i a l e x t r a c t h a d n o c o m p o u n d s o f a n t i c a n c e r n a t u r e , w i t h t h e t w o t r e a t m e n t s a n d c o n t r o l r e g i s t e r i n g , a b o v e 9 9 p e r c e n t h e a l t h y v i a b l e c e l l s w i t h n o c h a n g e s i n m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p o t e n t i a l ( f i g . 3 ) . D N A f r a g m e n t a t i o n a s s a y c o n f i r m e d t h a t t h e a p o p t o t i c f e a t u r e s i n i t i a l l y i n d u c e d b y b a c t e r i a l e x t r a c t d i d n o t l e a d t o f r a g m e n t a t i o n o f c e l l ’ s D N A w h i l e t r e a t m e n t w i t h c u r c u m i n ( p o s i t i v e c o n t r o l ) g a v e t h e f r a g m e n t e d D N A l a d d e r p a t t e r n ( f i g . 4 ) . T h e c e l l s e v e n t h o u g h i n i t i a l l y s h o w e d a p o p t o t i c f e a t u r e s l i k e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s , d e t a c h m e n t f r o m c u l t u r e v e s s e l a n d c o n d e n s a t i o n o f D a n e t a l . , 2 0 1 2 5 2 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 5 ) : 5 2 3 - 5 2 8 F i g u r e 3 : M i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p o t e n t i a l a n a l y s i s o f c o n t r o l a n d e x t r a c t t r e a t e d S C C 1 3 1 o r a l c a n c e r c e l l l i n e a t 4 8 h . V i a b l e c e l l s a r e s e e n i n Q u a r t e r Q 2 w h i l e d e a d c e l l s a r e s e e n i n Q u a r t e r Q 4 . T h e p e r c e n t o f v i a b l e c a n c e r c e l l s r e m a i n e d a b o v e 9 9 % i n t w o t r e a t m e n t s a s w e l l a s c o n t r o l . F i g u r e 4 : D N A F r a g m e n t a t i o n a s s a y . A : E x t r a c t ( 1 5 0 µ g / m l ) t r e a t e d S C C 1 3 1 D N A ; B : E x t r a c t ( 3 0 0 µ g / m l ) t r e a t e d S C C 1 3 1 D N A ; C : C u r c u m i n ( 1 0 0 µ g / m l ) t r e a t e d , f r a g m e n t a t i o n o f S C C 1 3 1 D N A w a s c a u s e d o n l y b y c u r c u m i n .