J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f f e a t h e r d e g r a d i n g b a c t e r i a f r o m p o u l t r y w a s t e K e y w o r d s : F e a t h e r , k e r a t i n , f e a t h e r d e g r a d i n g b a c t e r i u m , p o u l t r y w a s t e , k e r a t i n a s e , k e r a t i n o l y t i c a c t i v i t y . A B S T R A C T : T h e a i m o f t h i s s t u d y w a s t o c h a r a c t e r i z e k e r a t i n o l y t i c b a c t e r i a i s o l a t e d f r o m f e a t h e r w a s t e . F e a t h e r w a s t e i s g e n e r a t e d i n l a r g e a m o u n t s a s a b y - p r o d u c t o f c o m m e r c i a l p o u l t r y p r o c e s s i n g . T h i s r e s i d u e i s a l m o s t p u r e k e r a t i n , w h i c h i s n o t e a s i l y d e g r a d a b l e b y c o m m o n p r o t e o l y t i c e n z y m e s . T h e c r u d e p r o t e i n f r o m f e a t h e r h a s o f h i g h n u t r i e n t v a l u e a n d c o u l d b e u s e d a s a n i m a l f e e d f o r l i v e s t o c k a n d f i s h f e e d i n a q u a c u l t u r e . F e a t h e r c o n s t i t u t e s o v e r 9 0 % p r o t e i n , t h e m a i n c o m p o n e n t b e i n g b e t a - k e r a t i n , a f i b r o u s a n d i n s o l u b l e s t r u c t u r a l p r o t e i n e x t e n s i v e l y c r o s s l i n k e d b y d i s u l f i d e b o n d s . T h i s r e n d e r s t h e m r e s i s t a n t t o d i g e s t i o n b y a n i m a l s , i n s e c t s a n d p r o t e a s e s l e a d i n g t o s e r i o u s d i s p o s a l p r o b l e m s . I t i s d e g r a d e d o n l y b y k e r a t i n a s e e n z y m e . T h e s e e n z y m e s w e r e p r o d u c e d b y s o m e s p e c i e s o f B a c i l l u s . I n t h e p r e s e n t s t u d y , B . l i c h e n i f o r m i s w a s u s e d f o r d e g r a d i n g k e r a t i n s u b s t r a t e s u c h a s f e a t h e r s . B a s e d o n m o r p h o l o g y a n d b i o c h e m i c a l a n a l y s i s , t h e i s o l a t e s w e r e i d e n t i f i e d a s B a c i l l u s s p p . F e r m e n t a t i o n u s i n g f e a t h e r a s a s u b s t r a t e w a s c a r r i e d o u t o n m i n i m a l s a l t m e d i a f o r s e v e n d a y s w h i c h r e s u l t e d i n a l m o s t c o m p l e t e d e g r a d a t i o n o f f e a t h e r . T h e o p t i m u m c o n d i t i o n s f o r k e r a t i n a s e p r o d u c t i o n w e r e t e m p e r a t u r e 3 7 ° C , p H 7 . 0 a n d i n i t i a l s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n 1 % . M a x i m u m e n z y m e a c t i v i t y w a s f o u n d t o b e 1 0 0 U / L w i t h t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f 4 μ g / m l . 6 7 6 - 6 8 2 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 7 T h i s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : A r u n K u m a r J M 1 , L a k s h m i A 2 , S a n g e e t h a R a n i V 2 , S a i l a j a B 2 . I n s t i t u t i o n : 1 . A s s t P r o f , D e p t o f B i o t e c h n o l o g y , B a l l a r i I n s t i t u t e o f T e c h n o l o g y a n d M a n a g m e n t , B e l l a r y . 2 . B . E . S c h o l a r , D e p t o f B i o t e c h n o l o g y , B a l l a r i I n s t i t u t e o f T e c h n o l o g y a n d M a n a g m e n t , B e l l a r y . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : A r u n K u m a r J M . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / d o c u m e n t s / R A 0 2 3 9 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 7 M a y 2 0 1 2 A c c e p t e d : 2 6 M a y 2 0 1 2 P u b l i s h e d : 0 1 N o v 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : A r u n K u m a r J M , L a k s h m i A , S a n g e e t h a R a n i V , S a i l a j a B . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f f e a t h e r d e g r a d i n g b a c t e r i a f r o m p o u l t r y w a s t e . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 7 ) : 6 7 6 - 6 8 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y O r i g i n a l R e s e a r c h A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l

I N T R O D U C T I O N F e a t h e r s , w h i c h a r e a l m o s t p u r e k e r a t i n p r o t e i n s , a r e p r o d u c e d i n l a r g e a m o u n t s a s a w a s t e b y - p r o d u c t a t p o u l t r y - p r o c e s s i n g p l a n t . A t o t a l o f 5 - 7 % w e i g h t o f m a t u r e c h i c k e n c o m p r i s e s o f f e a t h e r s ( A v i n a s h e t a l . , 2 0 1 1 ) . F e a t h e r w a s t e c o n s t i t u t e s b e t a - k e r a t i n , a i n s o l v a b l e p r o t e i n ( S w e t l a n a a n d J a i n , 2 0 1 1 ) . I n a d d i t i o n t o t h i s , f e a t h e r w a s t e i s p r o d u c e d a t t h e r a t e o f 2 2 m i l l i o n k g p e r y e a r ( U S a l o n e ) ( S a v i t h a e t a l . , 2 0 0 7 ) . A g r o u p o f p r o t e o l y t i c e n z y m e s w h i c h a r e a b l e t o h y d r o l y z e i n s o l u b l e k e r a t i n s m o r e e f f i c i e n t l y t h a n o t h e r p r o t e a s e s a r e c a l l e d k e r a t i n i z e s p r o d u c e d b y s o m e m i c r o o r g a n i s m s . T h e s e b a c t e r i a l s t r a i n s p r o d u c e e n z y m e s w h i c h s e l e c t i v e l y d e g r a d e t h e b e t a - k e r a t i n f o u n d i n f e a t h e r s . T h e s e e n z y m e s m a k e i t p o s s i b l e f o r t h e b a c t e r i a t o o b t a i n c a r b o n , s u l p h u r a n d e n e r g y f o r t h e i r g r o w t h a n d m a i n t e n a n c e f r o m t h e d e g r a d a t i o n o f b e t a k e r a t i n ( M u t h u s a m y e t a l . , 2 0 1 1 ) . K e r a t i n s a r e t h e m o s t a b u n d a n t p r o t e i n s i n e p i t h e l i a l c e l l s o f v e r t e b r a t e s a n d r e p r e s e n t t h e m a j o r c o n s t i t u e n t s o f s k i n a n d i t s a p p e n d a g e s s u c h a s n a i l , h a i r , f e a t h e r , a n d w o o l . K e r a t i n s a r e g r o u p e d i n t o h a r d k e r a t i n s ( f e a t h e r , h a i r , h o o f a n d n a i l ) a n d s o f t k e r a t i n s ( s k i n a n d c a l l u s ) a c c o r d i n g t o s u l p h u r c o n t e n t ( S c o t t a n d U n t e r e i n e r 2 0 0 4 ) . T h e p r o t e i n c h a i n s a r e p a c k e d t i g h t l y e i t h e r i n α - h e l i x ( α - k e r a t i n s ) o r i n β - s h e e t ( β - k e r a t i n s ) s t r u c t u r e s , w h i c h f o l d i n t o f i n a l 3 - d i m e n s i o n a l f o r m ( V e s l a v a e t a l . , 2 0 0 9 ) K e r a t i n a s e s w h i c h a r e p r o d u c e d b y t h e s e k e r a t i n o l y t i c o r g a n i s m s c o u l d b e u s e d t o d e g r a d e f e a t h e r w a s t e a n d f u r t h e r t h e d i g e s t e d p r o d u c t s c o u l d b e a e x c e l l e n t m a t e r i a l f o r p r o d u c i n g a n i m a l f e e d , f e r t i l i z e r s o r n a t u r a l g a s ( T a m i l m a n i e t a l . , 2 0 0 8 ) . U s e o f k e r a t i n o l y t i c m i c r o o r g a n i s m s f o r f e a t h e r d e g r a d a t i o n i s a n e c o n o m i c a l , e n v i r o n m e n t a l f r i e n d l y a l t e r n a t i v e . K e r a t i n o l y t i c p r o t e a s e s o f f e r c o n s i d e r a b l e o p p o r t u n i t i e s f o r a l o w e n e r g y c o n s u m i n g t e c h n o l o g y f o r b i o c o n v e r s i o n o f p o u l t r y f e a t h e r s f r o m a p o t e n t p o l l u t a n t t o a n u t r i t i o n a l l y u p g r a d e d p r o t e i n f e e d f o r l i v e s t o c k ( J a h a n e t a l . , 2 0 1 0 ; V i g n e s h w a r a n e t a l . , 2 0 1 0 ) . M o s t f e a t h e r w a s t e i s l a n d f i l l e d o r b u r n e d w h i c h i n v o l v e s e x p e n s e a n d c a n c a u s e c o n t a m i n a t i o n o f a i r , s o i l a n d w a t e r . B a c t e r i a l s t r a i n s a r e k n o w n w h i c h a r e c a p a b l e o f d e g r a d i n g f e a t h e r s ( S a v i t h a e t a l . , 2 0 0 7 ) . T r a d i t i o n a l w a y s t o d e g r a d e f e a t h e r s s u c h a s a l k a l i h y d r o l y s i s a n d s t e a m p r e s s u r e c o o k i n g m a y n o t o n l y d e s t r o y t h e a m i n o a c i d s ( m e t h i o n i n e , l y s i n e a n d h i s t i d i n e ) b u t a l s o c o n s u m e l a r g e a m o u n t s o f e n e r g y . U t i l i z i n g p o u l t r y f e a t h e r s a s a f e r m e n t a t i o n s u b s t r a t e i n c o n j u n c t i o n w i t h k e r a t i n - d e g r a d i n g m i c r o o r g a n i s m o r e n z y m a t i c b i o d e g r a d a t i o n m a y b e a b e t t e r a l t e r n a t i v e t o i m p r o v e n u t r i t i o n a l v a l u e o f p o u l t r y f e a t h e r s a n d r e d u c e e n v i r o n m e n t a l w a s t e ( V e s l a v a e t a l . , 2 0 0 9 ) . T h e s e f e a t h e r s c o n s t i t u t e a s i z a b l e w a s t e d i s p o s a l p r o b l e m . S e v e r a l d i f f e r e n t a p p r o a c h e s h a v e b e e n u s e d f o r d i s p o s i n g o f f e a t h e r w a s t e , i n c l u d i n g l a n d f i l l i n g , b u r n i n g , n a t u r a l g a s p r o d u c t i o n a n d t r e a t m e n t f o r a n i m a l f e e d . M o s t f e a t h e r w a s t e i s l a n d f i l l e d o r b u r n e d w h i c h i n v o l v e s e x p e n s e a n d c a n c a u s e c o n t a m i n a t i o n o f a i r , s o i l a n d w a t e r ( R a i S a p n a e t a l . , 2 0 1 1 ; S a v i t h a e t a l . , 2 0 0 7 ) . F e a t h e r s h y d r o l y s e d b y m e c h a n i c a l o r c h e m i c a l t r e a t m e n t c a n b e c o n v e r t e d t o f e e d s t u f f s , f e r t i l i z e r s , g l u e s a n d f o i l s o r u s e d f o r t h e p r o d u c t i o n o f a m i n o a c i d s a n d p e p t i d e s ( J a h a n e t a l . , 2 0 1 0 ; A n d r e a e t a l . , 1 9 9 6 ) . A n a l t e r n a t i v e t o d e c r e a s e t h i s p o l l u t i o n i s t h e u t i l i s a t i o n o f f e a t h e r c o n s t i t u t e s t h a t c a n b e u s e d a s a n i m a l f e e d , p r e v e n t i n g a c c u m u l a t i o n i n t h e e n v i r o n m e n t a n d t h e d e v e l o p m e n t o f s o m e t y p e s o f p a t h o g e n s ( V e s l a v a e t a l . , 2 0 0 9 ) . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S E n r i c h m e n t 1 g o f p o u l t r y w a s t e w a s s e r i a l l y d i l u t e d i n o r d e r t o r e d u c e t h e i n i t i a l n u m b e r o f m i c r o o r g a n i s m s . T h i s d i l u t i o n w a s t h e n i n o c u l a t e d o n m i n i m a l f e a t h e r a g a r m e d i a . F e a t h e r s w e r e w a s h e d , d r i e d a n d h a m m e r m i l l e d p r i o r t o b e i n g a d d e d t o t h e m e d i u m . T h e m e d i u m w a s s t e r i l i z e d b y a u t o c l a v i n g . A l l i n c u b a t i o n s w e r e d o n e a t 3 7 ° C . K u m a r e t a l . , 2 0 1 2 6 7 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 7 ) : 6 7 6 - 6 8 2

S c r e e n i n g S k i m m i l k a g a r ( H i m e d i a ) w a s p r e p a r e d a n d t h e a b o v e d i l u t i o n s w e r e s t r e a k e d o n m i l k a g a r p l a t e s f o r t e s t i n g t h e c a s e i n o l y t i c a c t i v i t y o f t h e o r g a n i s m . B a c t e r i a w e r e i n o c u l a t e d o n t o p l a t e s a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 2 4 h . S t r a i n s t h a t p r o d u c e d c l e a r z o n e s i n t h i s m e d i u m w e r e s e l e c t e d . S u b c u l t u r i n g T h e o r g a n i s m s c r e e n e d w i t h K e r a t i n a g a r p l a t e s w a s s u b c u l t u r e d b y c o n t i n u o u s l y g r o w i n g t h e b a c t e r i u m i n m i n i m a l b r o t h m e d i u m ( 3 d a y s a t 3 7 ° C , 1 2 0 r p m ) a n d s u b s e q u e n t l y s t r e a k i n g o n m i n i m a l a g a r m e d i u m ( 1 . 5 % a g a r , 2 d a y s 3 7 ° C ) . I d e n t i f i c a t i o n o f I s o l a t e d f e a t h e r d e g r a d i n g b a c t e r i a G r a m S t a i n , S p o r e s t a i n i n g , M o t i l i t y t e s t a n d C a t a l a s e T e s t . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e i s o l a t e u s i n g B i o c h e m i c a l a s s a y s I M V i C T e s t , H y d r o g e n S u l f i d e T e s t , U r e a s e T e s t , L i p i d h y d r o l y s i s , C a r b o h y d r a t e F e r m e n t a t i o n , S t a r c h h y d r o l y s i s a n d G e l a t i n l i q u e f a c t i o n . P r o d u c t i o n o f k e r a t i n o l y t i c e n z y m e T h e b a c t e r i a l i s o l a t e w a s c u l t i v a t e d i n 1 0 0 m l m i n i m a l f e a t h e r m e d i a . T h e s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n a n d c e n t r i f u g e d a t 6 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n . T h e s u p e r n a t a n t s w e r e p r e s e r v e d a t 4 ° C a n d a s s a y e d f o r p r o t e i n . D e t e r m i n a t i o n o f k e r a t i n a s e a c t i v i t y A z o c a s e i n h y d r o l y s i s w a s u s e d a s a n a l t e r n a t i v e t o t h e a z o k e r a t i n h y d r o l y s i s . K e r a t i n o l y t i c p r o t e a s e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d w i t h a z o c a s e i n ( S i g m a C o . S t . L o u i s . M o . ) a s a s u b s t r a t e b y a z o c a s e i n s o l u t i o n i n 0 . 0 5 M T r i s - H C I b u f f e r a t p H 8 . 5 , w h i c h w a s i n c u b a t e d w i t h 4 0 0 μ l c r u d e e n z y m e s o l u t i o n f o r 3 0 m i n a t 3 7 ° C i n a w a t e r b a t h w i t h s h a k i n g . T h e r e a c t i o n w a s t e r m i n a t e d b y a d d i t i o n o f 1 . 4 m l o f 1 0 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ( T C A ) . A f t e r 1 5 m i n a t 4 ° C , t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d a t 1 0 , 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n . O n e m l s u p e r n a t a n t w a s m i x e d w i t h 1 m l o f 0 . 5 N N a O H a n d t h e a b s o r b a n c e w a s r e a d a t 4 4 0 n m . T h e c o n t r o l w a s t r e a t e d i n t h e s a m e w a y , e x c e p t T C A w a s a d d e d b e f o r e t h e a d d i t i o n o f c r u d e e n z y m e . O n e u n i t o f c a s e i n o l y t i c a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d a s t h e a m o u n t o f e n z y m e t h a t p r o d u c e s a n i n c r e a s e i n a b s o r b a n c e o f 0 . 0 1 p e r m i n u n d e r t h e a s s a y c o n d i t i o n s . T h e s o l u b l e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e c u l t u r e s u p e r n a t a n t w a s e s t i m a t e d a c c o r d i n g t o t h e B r a d f o r d m e t h o d ( B r a d f o r d , 1 9 7 6 ) . E n z y m e c h a r a c t e r i z a t i o n T a k i n g T e m p e r a t u r e , p H , S u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n , A c t i v a t o r a n d I n h i b i t o r a s p a r a m e t e r s , c h a r a c t e r i z a t i o n o f e n z y m e w a s d o n e . F e a t h e r d e g r a d a t i o n 1 0 0 m l o f N u t r i e n t b r o t h i s p r e p a r e d ; 1 g m o f f e a t h e r i s a d d e d t o t h e m e d i a a n d s t e r i l i z e d . A l o o p f u l l o f i n o c u l u m i s i n o c u l a t e d i n t o t h e m e d i a a n d i n c u b a t e d f o r s e v e n d a y s a t 3 7 ° C . R e s i d u a l f e a t h e r s w e r e h a r v e s t e d f r o m t h e f e r m e n t a t i o n m e d i a b y f i l t e r i n g i t o v e r w h a t m a n f i l t e r p a p e r N o : 3 . T h e h a r v e s t e d f e a t h e r s w e r e k e p t i n h o t a i r o v e n a t 5 0 ° C u n t i l w e i g h t s t a b i l i z e d t o c o n s t a n t v a l u e . T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e w e i g h t o f r e s i d u a l f e a t h e r o b t a i n e d f r o m t h e c o n t r o l a n d t h a t o f i n o c u l a t e d m e d i a h a s b e e n u s e d a s m e a s u r e o f f e a t h e r d e g r a d a t i o n . D e g r a d a t i o n w a s e x p r e s s e d i n p e r c e n t a g e . R E S U L T S A s c r e e n i n g p r o g r a m w a s e m p l o y e d t o o b t a i n b a c t e r i a l i s o l a t e s c a p a b l e o f p r o d u c i n g f e a t h e r d e g r a d i n g e x t r a c e l l u l a r k e r a t i n a s e e n z y m e u s i n g f e a t h e r ( k e r a t i n ) a s s o l e c a r b o n s u b s t r a t e . T h e p o t e n t i a l i s o l a t e w a s t h e n c h a r a c t e r i z e d a n d i d e n t i f i e d t o i t s g e n u s l e v e l . K u m a r e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 7 ) : 6 7 6 - 6 8 2 6 7 8 S l . N o B i o - C h e m i c a l T e s t B a c i l l u s s p 1 . I n d o l e p r o d u c t i o n T e s t P o s i t i v e 2 . M e t h y l R e d T e s t P o s i t i v e 3 . V o g e s p r o s k a e u r T e s t N e g a t i v e 4 . C i t r a t e U t i l i z a t i o n P o s i t i v e P o s i t i v e 5 . C a r b o h y d r a t e f e r m e n t a t i o n T e s t P o s i t i v e / P r e s e n c e o f A i r B u b b l e s 6 . C a t a l a s e P o s i t i v e 7 . S t a r c h h y d r o l y s i s P o s i t i v e 8 . U r e a s e P o s i t i v e T a b l e 1 : B i o c h e m i c a l C h a r a c t e r i z a t i o n .