J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y B i o r e m e d i a t i o n o f o i l c o n t a m i n a t e d s o i l u s i n g b i o s u r f a c t a n t p r o d u c e d b y P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a K e y w o r d s : B i o s u r f a c t a n t , S o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o n , B i o r e m e d i a t i o n , P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a , S u r f a c e t e n s i o n . A B S T R A C T : B i o s u r f a c t a n t s a r e s u r f a c t a n t s t h a t a r e b i o l o g i c a l l y p r o d u c e d f r o m b a c t e r i a , y e a s t s a n d f u n g i . E x a m p l e s i n c l u d e P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a w h i c h p r o d u c e b i o s u r f a c t a n t s f r o m v a r i o u s s u b s t r a t e s i n c l u d i n g s u g a r s , o i l a n d w a s t e s . B i o s u r f a c t a n t s h a v e t h e p r o p e r t y o f r e d u c i n g s u r f a c e a n d i n t e r f a c i a l t e n s i o n . T h e s e a r e b i o d e g r a d a b l e a n d n o n t o x i c . I n t h e p r e s e n t s t u d y s a w d u s t a n d r i c e h u s k w e r e u s e d a s s u b s t r a t e s f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c t i o n . P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a w a s i s o l a t e d f r o m c o n t a m i n a t e d s o i l s a m p l e c o l l e c t e d f r o m d i e s e l c o n t a m i n a t e d s i t e f o r t h e p r o d u c t i o n o f B i o s u r f a c t a n t . T h e f e r m e n t a t i v e p r o d u c t i o n o f b i o s u r f a c t a n t f r o m P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a w a s c a r r i e d o u t b y s o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o n ( S S F ) u s i n g t w o l o w c o s t s u b s t r a t e s ( r i c e h u s k a n d s a w d u s t ) . T h e s e s u b s t r a t e s w e r e i n o c u l a t e d w i t h P . a e r u g i n o s a a n d s u r f a c e t e n s i o n w a s m e a s u r e d o n 1 s t , 3 r d , 5 t h , 7 t h a n d 9 t h d a y . T h e h i g h e s t r e d u c t i o n o f s u r f a c e t e n s i o n ( 2 2 . 9 m N / m ) w a s o b t a i n e d u s i n g s a w d u s t o n 7 t h d a y . P r o d u c e d b i o s u r f a c t a n t h a v e b e e n t e s t e d f o r r e m e d i a t i o n o f o i l c o n t a m i n a t e d s o i l . T h e c o n t a m i n a t e d s o i l w a s p r e p a r e d i n t h e l a b o r a t o r y b y m i x i n g o i l , s a n d a n d s e e d ( d i e s e l c o n t a m i n a t e d s o i l ) i n t h e r a t i o o f 1 0 : 2 : 1 . C o n t a m i n a t e d s o i l w a s f u r t h e r t r a n s f e r r e d t o c o n t a i n e r s a n d w a s a l l o w e d f o r a c c l i m a t i z a t i o n . T h r e e c o n t a i n e r s w e r e u s e d i n t h i s s t u d y 1 ) C o n t a i n i n g c o n t a m i n a t e d s o i l w i t h o u t b i o s u r f a c t a n t ( C 1 ) . 2 ) C o n t a i n e r c o n t a i n i n g c o n t a m i n a t e d s o i l w i t h 4 g o f b i o s u r f a c t a n t p e r k g o f s o i l ( C 2 ) . 3 ) C o n t a i n i n g c o n t a m i n a t e d s o i l w i t h 8 g b i o s u r f a c t a n t p e r k g o f s o i l ( C 3 ) . T h e o i l r e m a i n i n g i n s o i l w a s d e t e r m i n e d b y s o l v e n t e x t r a c t i o n m e t h o d u s i n g n - h e x a n e . O i l r e m o v a l w a s h i g h i n t h e C 2 c o n t a i n e r w h i c h c o n t a i n e d 4 g o f b i o s u r f a c t a n t p e r k g o f s o i l . 2 8 1 - 2 8 6 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 4 T h i s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : P r a d e e p N V 1 , A n u p a m a 1 , A n i t h a G 2 , R e n u k a m m a 2 , S u d h a k a r A v v a r u 2 . A f r e e n S S 2 . I n s t i t u t i o n : 1 . A s s i s t a n t P r o f e s s o r , D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , B a l l a r i I n s t i t u t e o f T e c h n o l o g y a n d M a n a g e m e n t , B e l l a r y , I n d i a . 2 . B . E S c h o l a r , D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , B a l l a r i I n s t i t u t e o f T e c h n o l o g y a n d M a n a g e m e n t , B e l l a r y , I n d i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : P r a d e e p N V . E m a i l : n a g a m a l l i v p r a d e e p @ g m a i l . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / d o c u m e n t s / R A 0 2 3 6 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 2 3 A p r 2 0 1 2 A c c e p t e d : 1 4 M a y 2 0 1 2 P u b l i s h e d : 2 3 M a y 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : P r a d e e p N V , A n u p a m a , A n i t h a G , R e n u k a m m a , S u d h a k a r A v v a r u , A f r e e n S S . B i o r e m e d i a t i o n o f o i l c o n t a m i n a t e d s o i l u s i n g b i o s u r f a c t a n t p r o d u c e d b y s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 4 ) : 2 8 1 - 2 8 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y O r i g i n a l R e s e a r c h A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l

I N T R O D U C T I O N B i o s u r f a c t a n t s a r e d i v e r s e g r o u p o f s u r f a c e - a c t i v e c h e m i c a l c o m p o u n d s t h a t a r e p r o d u c e d b y a w i d e v a r i e t y o f m i c r o o r g a n i s m s . S o m e b i o s u r f a c t a n t s a r e k n o w n t o h a v e t h e r a p e u t i c a p p l i c a t i o n s a s a n t i b i o t i c s , a n t i f u n g a l o r a n t i v i r a l c o m p o u n d s . B i o s u r f a c t a n t s c a n a l s o b e u s e d i n t h e b i o r e m e d i a t i o n o f s o i l ( Y o u s s e f e t a l . , 2 0 0 4 ) . B i o s u r f a c t a n t s c a n b e s y n t h e s i z e d b y m a n y d i f f e r e n t m i c r o o r g a n i s m s a n d a r e g r o u p e d i n t o s i x m a j o r c l a s s e s b a s e d o n t h e p r o d u c i n g m i c r o o r g a n i s m . T h e s e c l a s s e s a r e g l y c o l i p i d s , p h o s p h o l i p i d s , p o l y s a c c h a r i d e – l i p i d c o m p l e x e s , l i p o p r o t e i n s – l i p o p e t i d e s , h y d r o x y l a t e d a n d c r o s s - l i n k e d f a t t y a c i d s , a n d t h e c o m p l e t e c e l l s u r f a c e ( U r u m & P e k d e m i r . , 2 0 0 4 ) . T h e t w o m a j o r c l a s s e s o f b i o s u r f a c t a n t s i n c l u d e l i p o p e p t i d e s a n d g l y c o l i p i d s , l i p o p e p t i d e s b e i n g s y n t h e s i z e d b y m a n y b a c i l l i a n d o t h e r s p e c i e s , a n d t h e l a t t e r b e i n g s y n t h e s i z e d b y P s e u d o m o n a s s p e c i e s ( Y o u s s e f e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e s e m o l e c u l e s h a v e a t t r a c t e d c o n s i d e r a b l e s c i e n t i f i c a t t e n t i o n d u e t o l o w e r t o x i c i t y , h i g h e r b i o d e g r a d a b i l i t y , a c t i v i t y a t e x t r e m e t e m p e r a t u r e s , p H a n d s a l i n i t y a n d p o s s i b i l i t y o f t h e i r p r o d u c t i o n t h r o u g h f e r m e n t a t i o n u s i n g l o w c o s t a g r o - b a s e d s u b s t r a t e s . C a r b o n s u b s t r a t e i s a n i m p o r t a n t l i m i t i n g f a c t o r a f f e c t i n g t h e p r o d u c t i o n o f m i c r o b i a l s u r f a c t a n t s . T h e t y p e o f c a r b o n s u b s t r a t e u s e d f o r p r o d u c t i o n h a s b e e n r e p o r t e d t o i n f l u e n c e b o t h t h e q u a l i t y a n d q u a n t i t y o f b i o s u r f a c t a n t s ( D a s e t a l . , 2 0 0 9 ) . T h e m o s t w i d e l y d i s t r i b u t e d e n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o n c a n b e a t t r i b u t e d t o o i l c o n t a m i n a t i o n , c a u s e d b y t a n k e r a c c i d e n t s , s t o r a g e t a n k r u p t u r e s , p i p e l i n e l e a k s a n d t r a n s p o r t a c c i d e n t s ( M a r g e s i n , 2 0 0 0 ) . T h i s c o n t a m i n a t i o n c a u s e s s i g n i f i c a n t e n v i r o n m e n t a l i m p a c t s a n d p r e s e n t s s u b s t a n t i a l h a z a r d s t o h u m a n h e a l t h ( L u e t a l . , 2 0 0 9 ) . B i o r e m e d i a t i o n i n v o l v e s t h e a c c e l e r a t i o n o f n a t u r a l b i o d e g r a d a t i o n p r o c e s s e s i n c o n t a m i n a t e d e n v i r o n m e n t s ( C a l v o e t a l . , 2 0 0 9 ) . B i o s u r f a c t a n t s h a v e b e e n r e c o m m e n d e d a n d c l a s s i f i e d f o r e n v i r o n m e n t a l a p p l i c a t i o n s b e c a u s e t h e y a r e c o s t - e f f e c t i v e a n d r e a d i l y b i o d e g r a d a b l e w i t h l o w o r n o e n v i r o n m e n t a l t o x i c i t y a n d a r e m o r e e f f e c t i v e t h a n t h e s y n t h e t i c s u r f a c t a n t s ( U r u m e t a l . , 2 0 0 3 ) . B i o r e m e d i a t i o n o f p e t r o l e u m h y d r o c a r b o n c o n t a m i n a t e d s o i l s h a s b e e n r e c o g n i z e d a s a n e f f i c i e n t , e c o n o m i c , v e r s a t i l e , a n d e n v i r o n m e n t a l l y s o u n d t r e a t m e n t ( L i u e t a l . , 2 0 0 8 ) . P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a i s a t y p i c a l s t r a i n f o r r h a m n o l i p i d p r o d u c t i o n a n d c a n u t i l i z e v e g e t a b l e o i l o r g l y c e r o l a s t h e s o l e c a r b o n s o u r c e ( Z h a n g e t a l . , 2 0 0 5 ) . A g r o u p o f b i o s u r f a c t a n t s t h a t h a s b e e n s t u d i e d e x t e n s i v e l y i s t h e r h a m n o l i p i d s f r o m P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ( M u l l i g a n , 2 0 0 0 ) . T h e s u c c e s s o f b i o r e m e d i a t i o n i s d e p e n d e n t u p o n t h e m i c r o b i a l a b i l i t y t o d e g r a d e t h e s e c o m p l e x m i x t u r e s a n d t h e i r r a t e l i m i t i n g k i n e t i c s . H i g h e r r a t e s o f d e g r a d a t i o n o f h y d r o c a r b o n s a r e o f t e n a c h i e v e d w i t h a b a c t e r i a l e n r i c h m e n t c o n s o r t i u m i s o l a t e d f r o m t h e e n v i r o n m e n t t h a t n e e d s b i o r e s t o r a t i o n . B a c t e r i a l c o n s o r t i a d i s p l a y a w i d e a r r a y o f m e t a b o l i c m e c h a n i s m s i n t h e b r e a k d o w n o f d i e s e l o i l c o m p o n e n t s , i n c l u d i n g p r o d u c t i o n o f s u r f a c e - a c t i v e a g e n t s a n d e m u l s i f i e r s ( B e n t o e t a l . , 2 0 0 5 ) . T h e c o m b i n e d b e h a v i o u r o f t w o i m m i s c i b l e l i q u i d s s u c h a s o i l a n d w a t e r t h a t r e s u l t i n t h e f o r m a t i o n o f t h e e m u l s i o n s i s i m p o r t a n t i n t h e a p p l i c a t i o n o f s u r f a c t a n t s i n o i l - c o n t a m i n a t e d s o i l t r e a t m e n t ( U r u m & P e k d e m i r . , 2 0 0 4 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , d i e s e l c o n t a m i n a t e d s o i l w a s c o l l e c t e d a n d P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a w a s i s o l a t e d f o r t h e p r o d u c t i o n o f b i o s u r f a c t a n t . T h e p r o d u c e d b i o s u r f a c t a n t w a s u s e d f o r t h e b i o r e m e d i a t i o n o f c o n t a m i n a t e d s o i l . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S M i c r o o r g a n i s m , m e d i a c o m p o s i t i o n D i e s e l c o n t a m i n a t e d s o i l w a s u s e d f o r t h e i s o l a t i o n o f B i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g m i c r o o r g a n i s m . S e r i a l d i l u t i o n f o l l o w e d b y s t r e a k i n g t e c h n i q u e w a s c a r r i e d o u t f o r t h e i s o l a t i o n o f t h e o r g a n i s m . C e t r i m i d e a g a r w a s u s e d f o r c u l t u r e m a i n t e n a n c e a n d p r e p a r a t i o n o f t h e i n o c u l a . P r a d e e p e t a l . , 2 0 1 2 2 8 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 4 ) : 2 8 1 - 2 8 6

G r a m s t a i n i n g a n d B i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a T h e i s o l a t e d s t r a i n w a s c h a r a c t e r i z e d b y c o n v e n t i o n a l m e t h o d s l i k e g r a m s t a i n i n g a n d b i o c h e m i c a l t e s t s s u c h a s g e l a t i n h y d r o l y s i s , c i t r a t e u t i l i z a t i o n , n i t r a t e r e d u c t i o n , i n d o l e , s t a r c h , M R V P a n d c a t a l a s e t e s t . I n o c u l u m a n d S u b s t r a t e s P e t r i p l a t e s w e r e i n o c u l a t e d w i t h 1 m l o f i n o c u l u m a n d i n c u b a t e d a t c o n t r o l l e d t e m p e r a t u r e f o r t h e p r o d u c t i o n o f b i o s u r f a c t a n t . R i c e h u s k a n d s a w d u s t w e r e c o l l e c t e d f r o m r i c e m i l l a n d c a r p e n t e r s h o p r e s p e c t i v e l y a n d w e r e u s e d a s s u b s t r a t e s f o r t h e p r o d u c t i o n o f b i o s u r f a c t a n t . S u b s t r a t e s w e r e s t e r i l i z e d i n a u t o c l a v a b l e p e t r i p l a t e s p r i o r t o u s e . M i n i m u m w a t e r c o n t e n t w a s a d d e d t o m a i n t a i n t h e m o i s t u r e c o n t e n t r e q u i r e d f o r t h e g r o w t h o f P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a . B i o s u r f a c t a n t p r o d u c t i o n f r o m s a w d u s t a n d r i c e h u s k F i v e p e t r i p l a t e s n u m b e r e d 1 t o 5 w e r e p r e p a r e d f o r e a c h s u b s t r a t e a n d i n o c u l a t e d w i t h P . a e r u g i n o s a . P l a t e s w i t h s a m p l e s w e r e a n a l y s e d o n e v e r y a l t e r n a t i v e d a y s v i z . , 1 s t , 3 r d , 5 t h , 7 t h a n d 9 t h d a y o f f e r m e n t a t i o n . F e r m e n t e d s u b s t r a t e s w e r e t r a n s f e r r e d t o c o n i c a l f l a s k a n d 1 0 0 m l o f w a t e r w a s a d d e d t o i t . F l a s k s w e r e k e p t i n r o t a r y s h a k e r f o r 2 h r s . S u b s t r a t e s w e r e f i l t e r e d u s i n g f i l t e r c l o t h , f i l t r a t e w a s c e n t r i f u g e d a t 4 0 0 0 r p m f o r 1 5 m i n a n d s u p e r n a t a n t ( c r u d e b i o s u r f a c t a n t ) w a s c o l l e c t e d . M e a s u r e m e n t o f s u r f a c e t e n s i o n S t a l a g m o m e t e r w a s u s e d t o m e a s u r e s u r f a c e t e n s i o n o f s a m p l e s . S u r f a c e t e n s i o n ( S . T ) w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e f o r m u l a ( T u r k o v s k a y a e t a l . , 2 0 0 1 a n d V e e n a n a d i g e t a l . , 2 0 0 0 ) . ( d e n s i t y o f s a m p l e ) * ( d r o p s o f w a t e r ) * ( S . T . o f w a t e r ) S . T . o f s a m p l e = ( D e n s i t y o f w a t e r ) * ( d r o p o f s a m p l e ) W h e r e s u r f a c e t e n s i o n o f w a t e r = 7 2 m N / m D e n s i t y o f w a t e r = 1 g / m l P r e p a r a t i o n o f c o n t a m i n a t e d s o i l T h e s o i l ( s a n d ) w a s c o l l e c t e d a n d w a s s i e v e d u s i n g s i e v e s h a k e r m a c h i n e . S o i l p a r t i c l e s i z e o f 4 . 7 5 µ m w a s u s e d f o r t h i s s t u d y . T h r e e c o n t a i n e r s w e r e u s e d f o r c o n t a m i n a t i o n o f s o i l . A f i x e d m a s s o f 4 k g s a n d w a s m e a s u r e d a n d p l a c e d i n e a c h c o n t a i n e r . F u r t h e r , s o i l w a s c o n t a m i n a t e d w i t h o i l ( u s e d t w o w h e e l e r o i l ) a n d s e e d ( d i e s e l c o n t a m i n a t e d s o i l ) i n t h e r a t i o o f 1 0 : 2 : 1 a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d i t w a s a l l o w e d t o c o n t a m i n a t e f o r 1 0 - 1 2 d a y s . A d d i t i o n o f B i o s u r f a c t a n t A f t e r c o n t a m i n a t i o n o f s o i l , 4 g a n d 8 g o f b i o s u r f a c t a n t p e r k g o f s o i l w e r e a d d e d t o c o n t a i n e r s C 2 & C 3 r e s p e c t i v e l y a n d C 1 w a s k e p t a s a b l a n k ( n o b i o s u r f a c t a n t w a s a d d e d ) . D e t e r m i n a t i o n o f T o t a l P e t r o l e u m H y d r o c a r b o n ( T P H ) u s i n g n - h e x a n e e x t r a c t i o n T h e s o i l s a m p l e s p r e s e n t i n t h e c o n t a i n e r s w e r e a n a l y z e d u s i n g T P H m e t h o d b y n - h e x a n e e x t r a c t i o n t o d e t e r m i n e t h e o i l c o n t e n t r e m a i n i n g i n t h e s o i l s a m p l e s . F o u r g r a m s o f s o i l s a m p l e w a s t a k e n a n d m i x e d w i t h 2 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e r a n d s t i r r e d f o r 5 m i n s . T h e s a m p l e w a s a c i d i f i e d u s i n g H C l a n d 1 0 m l o f n - h e x a n e w a s a d d e d a n d m i x e d f o r 1 0 m i n s . T h e s a m p l e w a s t r a n s f e r r e d t o s e p a r a t i n g f u n n e l a n d w a s a l l o w e d t o s t a n d f o r 1 0 m i n s . T h e t o p m o s t l a y e r c o n t a i n e d n - h e x a n e a n d o i l . B o t t o m l a y e r c o n t a i n i n g w a t e r w a s d r a i n e d ; t h e t o p l a y e r w a s t r a n s f e r r e d t o e v a p o r a t i n g d i s h a n d w a s p l a c e d i n h o t a i r o v e n f o r o n e h o u r t o e v a p o r a t e t h e n - h e x a n e . T h e T P H w a s m e a s u r e d u s i n g t h e f o r m u l a e : T P H i n t h e c o n t a m i n a t e d s o i l % = ( W 2 - W 1 ) * 1 0 0 / W t o f s o i l i n g W h e r e , W 1 = w e i g h t o f t h e e m p t y d i s h . W 2 = w e i g h t o f t h e d i s h w i t h s e p a r a t e d o i l a f t e r d r i e d i n o v e n a t 1 0 3 º C f o r 2 h o u r s . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N G r a m s t a i n i n g a n d B i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n T h e r e s u l t s o f G r a m s t a i n i n g a n d b i o c h e m i c a l P r a d e e p e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 4 ) : 2 8 1 - 2 8 6 2 8 3