J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y P u r i f i c a t i o n o f p h e n y l a l a n i n e a m m o n i a l y a s e ( P A L ) a n d p e r o x i d a s e ( P O X ) e n z y m e s o b t a i n e d f r o m l u c e r n e ( M e d i c a g o s a t i v a L . c v . V e r t u s ) f o l l o w i n g i n o c u l a t i o n w i t h V e r t i c i l l i u m a l b o - a t r u m K e y w o r d s : A m m o n i u m s u l p h a t e p r e c i p i t a t i o n , V e r t i c i l l i u m , l u c e r n e , P A L , P O X . A B S T R A C T : P h e n y l a l a n i n e a m m o n i a l y a s e ( E C 4 . 3 . 1 . 2 4 , P A L ) a n d p e r o x i d a s e ( E C 1 . 1 1 . 1 . 7 , P O X ) e n z y m e a c t i v i t i e s w e r e d e t e r m i n e d i n s e e d l i n g s o f l u c e r n e ( M e d i c a g o s a t i v a L . c v . V e r t u s ) a f t e r t h e i n o c u l a t i o n o f V . a l b o - a t r u m ( V 2 , a w e a k p a t h o g e n i c i s o l a t e t o l u c e r n e ) . P A L a n d P O X a c t i v i t i e s o f l u c e r n e i n o c u l a t e d w i t h V 2 w e r e f o u n d s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f t h e c o n t r o l g r o u p a f t e r 4 8 h i n o c u l a t i o n . P a r t i a l p u r i f i c a t i o n o f e n z y m e s w i t h 0 - 5 0 % ( N H 4 ) 2 S O 4 p r e c i p i t a t i o n i n c o n t r o l g r o u p s r e s u l t e d i n 2 . 7 4 a n d 2 . 4 2 f o l d i n c r e a s e s . O n t h e o t h e r h a n d , 1 . 7 8 a n d 1 . 7 4 f o l d i n c r e a s e s i n P A L a n d P O X a c t i v i t i e s , r e s p e c t i v e l y w e r e e v i d e n t i n V 2 - i n o c u l a t e d p l a n t s . T h i s s t u d y s h o w e d t h a t t h e p u r i f i c a t i o n o f t h e e n z y m e s w i t h l i t t l e e f f o r t e n a b l e d u s t o s e e t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e t r e a t m e n t s c l e a r l y . T h i s t y p e o f w o r k c o u l d b e s u g g e s t e d w h e r e t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f t h e s a m p l e i s l o w o r a t i m e - s c a l e e x p e r i m e n t i s t o b e c a r r i e d o u t t o s e e t h e e n z y m e c h a n g e s o r t o c h a r a c t e r i z e t h e p a t h o g e n - r e l a t e d p r o t e i n s . 3 5 5 - 3 6 1 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 4 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : M u r a t D i k i l i t a s . I n s t i t u t i o n : D e p a r t m e n t o f P l a n t P r o t e c t i o n , F a c u l t y o f A g r i c u l t u r e , H a r r a n U n i v e r s i t y , S . U r f a , T u r k e y . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : M u r a t D i k i l i t a s . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / d o c u m e n t s / R A 0 2 2 0 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 2 1 M a r 2 0 1 2 A c c e p t e d : 1 5 A p r 2 0 1 2 P u b l i s h e d : 0 1 J u n 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : M u r a t D i k i l i t a s . P u r i f i c a t i o n o f p h e n y l a l a n i n e a m m o n i a l y a s e ( P A L ) a n d p e r o x i d a s e ( P O X ) e n z y m e s o b t a i n e d f r o m l u c e r n e ( M e d i c a g o s a t i v a L . c v . V e r t u s ) f o l l o w i n g i n o c u l a t i o n w i t h V e r t i c i l l i u m a l b o - a t r u m . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 4 ) : 3 5 5 - 3 6 1 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h

I N T R O D U C T I O N V . a l b o - a t r u m i s a m a j o r p r o b l e m i n l u c e r n e , c o t t o n a n d v e g e t a b l e g r o w n a r e a s . V a r i o u s c u l t i v a r s h a v e d i f f e r e n t r e s p o n s e s t o t h e v a r i o u s i s o l a t e s o f V . a l b o - a t r u m . F o r e x a m p l e , v a r i o u s l e v e l s o f r e s i s t a n c e t o V . a l b o - a t r u m w e r e f o u n d t o v a r y f r o m o n e p l a n t t o a n o t h e r w i t h i n t h e s a m e c u l t i v a r ( p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n w i t h P r o f . B a r b a r a W . P e n n y p a c k e r , U S A ) . D e f e n s e r e s p o n s e s s u c h a s p e r o x i d a s e ( E C 1 . 1 1 . 1 . 7 , P O X ) a n d p h e n y l a l a n i n e a m m o n i a l y a s e ( E C 4 . 3 . 1 . 2 4 , P A L ) h a v e b e e n r e p o r t e d t o c h a n g e d u r i n g i n f e c i o n s t a g e . T h e s e e n z y m e s a r e a g o o d c r i t e r i a t o m e a s u r e t h e r e s p o n s e s o f t h e c r o p p l a n t s . H o w e v e r , d u r i n g i n f e c t i o n p r o c e s s , i t i s d i f f i c u l t t o d i f f e r e n t i a t e t h e c o n t r o l p l a n t s f r o m t h e i n f e c t e d o n e s b y m e a s u r i n g t h e e n z y m e a c t i v i t i e s i n e a r l y s t a g e s t h r o u g h c r u d e e x t r a c t o f p l a n t s s i n c e t h e l e v e l o f e n z y m e s i n b o t h c o n t r o l a n d i n f e c t e d g r o u p s s h o w s i m i l a r p a t t e r n s d u e t o s i m i l a r p r o t e i n p r o f i l e s o r s i m i l a r m o l e c u l a r w e i g h t s , t h e r e f o r e , i t i s d i f f i c u l t t o j u d g e a b o u t t h e d e f e n c e r e s p o n s e s a t t h i s s t a g e . U n d e r t h e s e c i r c u m t a n c e s , i t w o u l d b e b e t t e r t o p u r i f y t h e p r o t e i n s a n d m e a s u r e t h e i r e n z y m a t i c a c t i v i t i e s i f v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n o f p r o t e i n s e x i s t . P e r o x i d a s e ( E C 1 . 1 1 . 1 . 7 , P O X ) e n z y m e s , i n g e n e r a l , a r e d i v i d e d i n t o t h r e e g r o u p s d i f f e r i n g i n m o l e c u l a r w e i g h t a n d i n a b s o r p t i o n s p e c t r a i n c l u d i n g a s c o r b a t e t y p e , f u n g a l d e r i v e d a n d p l a n t d e r i v e d e n z y m e s ( D a s e t a l . , 2 0 1 1 ) . O f t h e m , p l a n t s a r e t h e r i c h e s t s o u r c e s o f p e r o x i d a s e s a n d p r i m a r i l y f o u n d i n r o o t s a n d l e a v e s o f h i g h e r p l a n t s , w h i c h p l a y i m p o r t a n t r o l e s i n l i g n i f y i n g c e l l w a l l s a f t e r i n f e c t i o n , a n d t h u s i n c r e a s i n g p l a n t r e s i s t a n c e ( T a n g , 2 0 0 1 ; D i k i l i t a s , 2 0 0 3 ; B o k a a n d O r b a n , 2 0 0 7 ; R e n u g a d e v i e t a l . , 2 0 1 1 ) . P l a n t d e r i v e d p e r o x i d a s e e n z y m e s w e r e i s o l a t e d , p u r i f i e d a n d c h a r a c t e r i z e d f r o m a v a r i o u s p l a n t s p e c i e s i n c l u d i n g h o r s e r a d i s h , s o y b e a n , b e e t , t o m a t o , c a r r o t , w h e a t , a p r i c o t , p e a r s , b a n a n a s a n d t e a ( S i l v a a n d F r a n c o , 2 0 0 0 ; L a v e r y e t a l . , 2 0 1 0 ) . A m o n g t h e m , h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e w a s t h e m o s t c o m m o n l y u s e d e n z y m e f o r t h e s t a n d a r d p r e p a r a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p r o t e i n p r o f i l e s . I s o l a t i o n o f p e r o x i d a s e e n z y m e s f r o m m i c r o o r g a n i s m s a l s o l e d t o i n c r e a s e d r e s e a r c h i n t e r e s t i n t h i s a r e a . M a n y f u n g a l a g e n t s h a v e b e e n k n o w n t o p r o d u c e p e r o x i d a s e e n z y m e s ( T s u j i m u r a e t a l . , 1 9 9 4 ; H a m i d a n d R e h m a n , 2 0 0 9 ) . T h e r o l e o f p e r o x i d a s e i n m e t a b o l i s m i s n o t c l e a r d u e t o t h e l a r g e n u m b e r o f r e a c t i o n s i n v o l v e d a n d t h e c o n s i d e r a b l e n u m b e r o f i s o e n z y m i c s p e c i e s ( K i m a n d L e e , 2 0 0 5 ) a l t h o u g h i t i s c l e a r l y i n v o l v e d i n t h e e n z y m a t i c r e a c t i o n s f o r r e m o v a l o f H 2 O 2 a n d o x i d a n t s i n c e l l s . P h e n y l a l a n i n e a m m o n i a l y a s e ( E C 4 . 3 . 1 . 2 4 , P A L ) , s y n t h e s i z e d b y a m u l t i s t e p p h e n y l p r o p a n o i d b i o s y n t h e s i s p a t h w a y , i s t h e e n t r y - p o i n t e n z y m e c a t a l y s i n g t h e d e a m i n a t i o n o f p h e n y l a l a n i n e t o t r a n s c i n n a m i c a c i d . T h e i n d u c t i o n o f P A L i s a s s o c i a t e d w i t h t h e a c c u m u l a t i o n o f s e c o n d a r y p r u d u c t s s u c h a s f l a v o n o i d s a n d l i g n i n s i n v o l v e d i n d e f e n c e r e s p o n s e s p r o v i d i n g s p e c i f i c m e a n s t o p r o t e c t t h e p l a n t f r o m s t r e s s . P A L i s a l s o i n v o l v e d i n p h e n o l i c s s y n t h e s i s , i n c l u d i n g p h y t o a l e x i n s a n d s u b e r i n ( T a n g , 2 0 0 1 ; A g r i o s , 2 0 0 2 ) . S t u d i e s w i t h s e v e r a l d i f f e r e n t s p e c i e s o f p l a n t s s h o w e d t h a t P A L a c t i v i t y i n c r e a s e s w i t h t h e b i o t i c a n d a b i o t i c s t r e s s e s ( H a m m e r s c h m i d t , 1 9 9 9 ) . T h e r e s i s t a n c e o f p l a n t s t o t h e p a t h o g e n m a y d e p e n d o n t h e s p e e d a n d t h e e x t e n t o f s y n t h e s i s o f t h e e n z y m e s . T h e r e f o r e , P A L s h o w s t h e l e v e l o f r e s i s t a n c e o f t h e o r g a n i s m a g a i n s t s t r e s s . F o r e x a m p l e , D u n n e t a l . , ( 1 9 9 8 ) r e p o r t e d t h a t a f t e r 3 0 d a y s o f h i g h s a l i n i t y ( 0 . 1 M N a C l ) , c i t r u s p l a n t g r e w m o r e s l o w l y a n d p r o d u c e d l o w e r P A L a c t i v i t y a n d a s a r e s u l t o f t h a t t h e y b e c a m e m o r e s u s c e p t i b l e t o n e m a t o d e a t t a c k ( T y l e n c h u l u s s e m i p e n e t r a n s ) . S i m i l a r l y , D i k i l i t a s ( 2 0 0 3 ) s t a t e d t h a t i n c r e a s e i n P A L a c t i v i t y a f t e r t h e i n o c u l a t i o n o f e l i c i t o r d e r i v e d f r o m V e r t i c i l l i u m a l b o - a t r u m o n c e l l c u l t u r e s o f l u c e r n e ( M e d i c a g o s a t i v a c v . M a r i s K a b u l ) d e c r e a s e d w h e n t h e c u l t u r e w a s g r o w n i n M u r a s h i g e a n d S k o o g ( M & S ) m e d i u m c o n t a i n i n g 5 0 m M N a C l . A s a r e s u l t , t h e r e s i s t a n t c u l t i v a r b e c a m e m o r e s u s c e p t i b l e t o t h e e f f e c t M u r a t D i k i l i t a s , 2 0 1 2 3 5 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 4 ) : 3 5 5 - 3 6 1

o f p a t h o g e n w h e n e x p o s e d t o s a l i n i t y . P a r t i a l p r u f i c a t i o n o f e n z y m e s w a s r e p o r t e d b y m a n y r e s e a r c h p e o p l e ( A l t u n k a y a a n d G ö k m e n , 2 0 1 1 ; H u e t a l . , 2 0 1 2 ) t o c h a r a c t e r i z e a n d f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e i r p r o p e r t i e s . I n t h i s s t u d y , p a r t i a l p u r i f i c a t i o n o f t h e e n z y m e s o b t a i n e d f r o m t h e l u c e r n e p l a n t s a f t e r t h e p a t h o g e n a t t a c k w a s a c h i e v e d b y ( N H 4 ) 2 S O 4 p r e c i p i t a t i o n m e t h o d t o d i f f e r e n t i a t e t h e e n z y m e l e v e l s a t s i m i l a r e n d - p o i n t s w i t h l i t t l e e f f o r t . V i a t h i s m e t h o d , w e w o u l d t h e n b e a b l e t o s e e t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e s e v e r i t y o f s t r e s s f a c t o r s s u c h a s s a l i n i t y a n d t h e p a t h o g e n s i n c r o p p l a n t s b y d e m o n s t r a t i n g t h e i r c o m b i n e d a n d s e p e r a t e e f f e c t s o f e a c h s t r e s s f a c t o r . D a t a o f t h i s s t u d y w o u l d a l s o e n a b l e u s t o e s t a b l i s h o t h e r p u r i f i c a t i o n s y s t e m s f o r f u r t h e r p u r i f i c a t i o n s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S I n o c u l a t i o n o f p l a n t s V . a l b o - a t r u m , i s o l a t e V 2 w e r e i s o l a t e d f r o m t o m a t o p l a n t s a n d m a i n t a i n e d i n P D A a n d D o x a g a r m e d i a . T h e f u n g a l c u l t u r e w a s o r i g i n a l l y o b t a i n e d f r o m t h e c u l t u r e c o l l e c t i o n o f D r C h r i s J . S m i t h ( U n i v e r s i t y o f W a l e s , S w a n s e a - U K ) . T h e i s o l a t e w a s c h a r a c t e r i z e d a s a w e a k p a t h o g e n a c c o r d i n g t o s t u d i e s c a r r i e d o u t b y D i k i l i t a s ( 1 9 9 7 a n d 2 0 0 3 ) . L u c e r n e ( M e d i c a g o s a t i v a c v . V e r t u s ) p l a n t s w e r e i n o c u l a t e d w i t h t h e r o o t d i p p i n g m e t h o d w i t h t h e s p o r e s o f V . a l b o - a t r u m , V 2 ( 1 x 1 0 7 c o n i d i a m l - 1 ) . F o r t h i s , p l a n t s w e r e r e m o v e d f r o m p o t s a n d t h e s o i l w a s r e m o v e d b y s h a k i n g t h e p l a n t s g e n t l y , f o l l o w e d b y w a s h i n g i n t a p w a t e r . T h e r o o t o f t h e p l a n t s w e r e t h e n p l a c e d i n t h e s p o r e s u s p e n s i o n f o r 1 0 m i n . T h e i n o c u l a t e d p l a n t s w e r e r e p l a n t e d u s i n g t h e s a m e s o i l . D i s t i l l e d w a t e r w a s u s e d f o r t h e c o n t r o l p l a n t s . P r e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f t i s s u e h o m o g e n a t e f o r P O X T e n g r a m s o f f r e s h l u c e r n e l e a v e s w e r e h o m o g e n i z e d a t 4 ° C w i t h 1 0 0 m l o f 5 0 m M N a p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) . T h e h o m o g e n a t e w a s c e n t r i f u g e d a t 1 0 , 0 0 0 g f o r 1 5 m i n a t 4 ° C . T h e s u p e r n a t a n t o b t a i n e d a t t h i s s t a g e w a s d e s i g n a t e d a s c r u d e e x t r a c t . T h e c r u d e e x t r a c t w a s t h e n p a r t i a l l y p u r i f i e d b y a d d i n g s o l i d a m m o n i u m s u l p h a t e ( c a l c u l a t e d t h r o u g h t h e w e b s i t e h t t p : / / w w w . e n c o r b i o . c o m ) t o g i v e 0 - 5 0 % s a t u r a t i o n a n d t h e p r e c i p i t a t e w a s c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 , 0 0 0 g f o r 9 0 m i n a t 4 ° C . T h e p r e c i p i t a t e w a s t h e n s u s p e n d e d i n a b o u t 1 0 m l o f t h e s a m e b u f f e r w h i c h w a s u s e d f o r h o m o g e n i z a t i o n a n d d i a l y z e d o v e r n i g h t a t 4 ° C a g a i n s t 4 0 m M N a p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) t o r e m o v e a m m o n i u m s u l p h a t e a n d o t h e r m i n e r a l s . T h e s u p e r n a t a n t a t t h i s s t a g e w a s d e s i g n a t e d a s p u r i f i e d e n z y m e . T h e a c t i v i t y o f P O X i n t h e s u p e r n a t a n t w a s d e t e r m i n e d b e f o r e a n d a f t e r p a r t i a l p u r i f i c a t i o n . D e t e r m i n a t i o n o f P O X a c t i v i t y P O X a c t i v i t y w a s a s s a y e d w i t h g u a i a c o l a c c o r d i n g t o t h e m o d i f i e d m e t h o d o f M e r i g a e t a l . , ( 2 0 0 4 ) . A 3 m l r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n i n g 1 3 m m o l l - 1 g u a i a c o l , 5 m m o l l - 1 H 2 O 2 , 5 0 m m o l l - 1 N a p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 5 ) a n d 5 0 0 m l o f e n z y m e s o l u t i o n w a s p r e p a r e d . O x i d a t i o n o f g u a i a c o l w a s f o l l o w e d b y t h e i n c r e a s e o f a b s o r b a n c e a t 4 7 0 n m , a f t e r i n i t i a t i n g t h e r e a c t i o n w i t h H 2 O 2 . O n e u n i t o f P O X a c t i v i t y w a s d e f i n e d a s 0 . 0 1 Δ A 4 7 0 p e r m i n . P r e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f t i s s u e h o m o g e n a t e f o r P A L T o a s s e s s t h e e a r l y d e f e n c e r e s p o n s e s o f l u c e r n e l e a v e s , P A L a c t i v i t y w a s m e a s u r e d . T e n g r a m s o f f r e s h l e a v e s w e r e h o m o g e n i z e d a t 4 ° C w i t h 1 0 0 m l o f 5 0 m M T r i s - H C l , p H 8 . 4 , c o n t a i n i n g 4 m M N a 2 E D T A , 1 0 m M m e r c a p t o e t h a n o l , 2 m M a s c o r b i c a c i d a n d 1 m M P M S F ( p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e ) a n d 1 g a c i d - w a s h e d s a n d w i t h a c o l d p e s t l e a n d m o r t a r . T h e h o m o g e n a t e w a s f i l t e r e d t h r o u g h t w o l a y e r s o f w e t M i r a C l o t h ( C a l b i o c h e m ) , a n d t h e r e s u l t i n g f i l t r a t e w a s c e n t r i f u g e d ( 2 0 , 0 0 0 g , f o r 2 0 m i n a t 4 ° C ) . T h e s u p e r n a t a n t w a s t h e n d i a l y z e d o v e r n i g h t M u r a t D i k i l i t a s , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 4 ) : 0 3 5 5 - 3 6 1 3 5 7