J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y E f f i c i e n t c a l l o g e n e s i s a n d S h o o t o r g a n o g e n e s i s f r o m n o d a l e x p l a n t s o f R o s a h y b r i d a L . ( L o v e l y g i r l ) K e y w o r d s : R o s a h y b r i d a ; C a l l o g e n e s i s , s h o o t o r g a n o g e n e s i s , 6 - B e n z y l a d e n i n e . A B S T R A C T : T h e c a l l o g e n i c a n d s h o o t o r g a n o g e n i c p o t e n t i a l o f o r n a m e n t a l p l a n t , R o s a h y b r i d a w e r e i n v e s t i g a t e d . C a l l u s i n d u c t i o n a n d s h o o t r e g e n e r a t i o n w e r e i n d u c e d f r o m n o d a l e x p l a n t s o f g a r d e n p l a n t s i n c u b a t e d o n M u r a s h i g e a n d S k o o g ( M S ) - m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f P l a n t G r o w t h R e g u l a t o r s ( P G R s ) . T h e b e s t c a l l u s i n d u c t i o n ( 8 0 - 8 5 % ) w a s o b s e r v e d o n e x p l a n t s i n c u b a t e d o n M S - m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 2 . 0 m g l - 1 6 - b e n z y l a d e n i n e ( B A ) a n d 1 . 5 m g l - 1 B A a l o n g w i t h 0 . 5 m g l - 1 α - N a p h t h a l e n e a c e t i c a c i d ( N A A ) o r 0 . 5 m g l - 1 2 , 4 d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i c a c i d ( 2 , 4 D ) a f t e r f o u r w e e k s o f c u l t u r e . W h e n M S - m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 1 . 5 m g l - 1 B A a l o n e i n d u c e d 9 0 % s h o o t o r g a n o g e n e s i s a f t e r 3 0 - d a y s f o l l o w i n g c u l t u r e . 2 . 0 m g l - 1 B A i n c o m b i n a t i o n w i t h 1 . 0 m g l - 1 K i n ( K i n e t i n ) a l s o i n d u c e d 9 0 % s h o o t i n g . M o r e o v e r , w h e n s h o o t s w e r e t r a n s f e r r e d t o a n e l o n g a t i o n m e d i u m , t h e l o n g e s t s h o o t s ( 3 . 9 c m ) w e r e o b s e r v e d w i t h s i m i l a r c o m p o s i t i o n o f P G R s . T h e r e g e n e r a t e d s h o o t s w e r e i n o c u l a t e d o n r o o t i n g m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f I n d o l e B u t y r i c A c i d ( I B A ) , N A A a n d I n d o l e A c e t i c a c i d ( I A A ) b u t n o r o o t i n g w a s o b s e r v e d . 2 9 6 - 3 0 2 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 4 T h i s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : N i g h a t S e e m a 1 , K i r a n Y a s m i n K h a n 1 , M o h a m m a d Z a k a r i a 2 , H i n a F a z a l 3 . I n s t i t u t i o n : 1 . D e p a r t m e n t o f P l a n t S c i e n c e s , Q u a i d - i - A z a m U n i v e r s i t y , I s l a m a b a d P a k i s t a n . 2 . P o s t G r a d u a t e C o l l e g e , M a r d a n . P a k i s t a n . 3 . P a k i s t a n C o u n c i l o f S c i e n t i f i c a n d I n d u s t r i a l R e s e a r c h ( P C S I R ) P e s h a w a r c o m p l e x , P a k i s t a n . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : N i g h a t S e e m a . E m a i l : s e e m a z a k a r i a @ g m a i l . c o m . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / d o c u m e n t s / R A 0 2 1 9 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 1 6 M a r 2 0 1 2 A c c e p t e d : 0 3 A p r 2 0 1 2 P u b l i s h e d : 2 3 M a y 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : N i g h a t S e e m a , K i r a n Y a s m i n K h a n , M o h a m m a d Z a k a r i a , H i n a F a z a l . E f f i c i e n t c a l l o g e n e s i s a n d S h o o t o r g a n o g e n e s i s f r o m n o d a l e x p l a n t s o f R o s a h y b r i d a L . ( L o v e l y g i r l ) . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 4 ) : 2 9 6 - 3 0 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y O r i g i n a l R e s e a r c h A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l

I N T R O D U C T I O N R o s a h y b r i d a L . ( L o v e l y g i r l ) b e l o n g s t o t h e f a m i l y R o s a c e a e a n d i s o n e o f t h e p o p u l a r o r n a m e n t a l p l a n t s w o r l d w i d e . R o s a h y b r i d a ( R . h y b r i d a ) i s a l s o c a l l e d q u e e n o f f l o w e r s d u e t o i t s b e a u t y a n d f r a g r a n c e ( S h a b b i r e t a l . , 2 0 0 9 ) . M o r e t h a n 2 0 , 0 0 0 c u l t i v a r s w e r e p r o d u c e d f r o m e i g h t w i l d s p e c i e s i n t h e g e n u s R o s a . T h e c u t f l o w e r s o f R . h y b r i d a a r e u s e d i n s o c i a l e v e n t s , r e l i g i o u s r i t u a l s , i n m e d i c i n e s a n d a l s o u s e d f o r t h e p r o d u c t i o n o f i m p o r t a n t s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s V i t a m i n s C a n d e s s e n t i a l o i l s ( K i m e t a l . , 2 0 0 3 ; S h a b b i r e t a l . , 2 0 0 9 ) . A c c o r d i n g t o t h e l i t e r a t u r e c i t e d , R . h y b r i d a i s e a s i l y p r o p a g a t e d t h r o u g h c u t t i n g , g r a f t i n g a n d l a y e r i n g a s e x u a l l y b u t d o n o t g i v e t r u e - t o - t y p e p l a n t s . O t h e r l i m i t i n g f a c t o r s i n t h e c o n v e n t i o n a l p r o p a g a t i o n o f R . h y b r i d a a r e s l o w m u l t i p l i c a t i o n r a t e a n d s u s c e p t i b i l i t y t o b a c t e r i a l a n d f u n g a l d i s e a s e s . F u r t h e r m o r e , g e r m p l a s m c o n s e r v a t i o n i n s e e d b a n k i s n o t p r a g m a t i c d u e t o h e t e r o z y g o u s n a t u r e i n d u c e d t h r o u g h c u t t i n g s ( N a i r a n d G u p t a , 2 0 0 6 ; K h o s r a v i e t a l . , 2 0 0 7 ; R a z a v i z a d e h a n d E h s a n p o u r , 2 0 0 8 ) . I n o r d e r t o f a c i l i t a t e m u l t i p l i c a t i o n r a t e a n d t o g e t d i s e a s e f r e e p l a n t , a n e f f i c i e n t p r o t o c o l i s n e e d e d f o r i n v i t r o r e g e n e r a t i o n o f R . h y b r i d a . I n v i t r o r e g e n e r a t i o n i s a p o t e n t i a l s o u r c e f o r m a s s p r o p a g a t i o n o f o r n a m e n t a l a n d m e d i c i n a l l y i m p o r t a n t p l a n t s ( A h m a d e t a l . , 2 0 1 0 ; A b b a s i e t a l . , 2 0 1 0 ) . R a z a v i z a d e h a n d E h s a n p o u r ( 2 0 0 8 ) r e p o r t e d t h a t i n v i t r o r e g e n e r a t i o n e n h a n c e m u l t i p l i c a t i o n r a t e , d i s e a s e f r e e p l a n t s , n o n s e a s o n a l p r o d u c t i o n a n d g e r m p l a s m c o n s e r v a t i o n i n R . h y b r i d a . T h e o v e r a l l o b j e c t i v e o f c u r r e n t r e s e a r c h w a s t o d e v e l o p a n e f f i c i e n t r e g e n e r a t i o n p r o t o c o l f o r R . h y b r i d a f r o m n o d a l e x p l a n t s t o p r o d u c e g e n e t i c a l l y p u r e , h e a l t h y a n d v i g o r o u s p l a n t s i n r e l a t i v e l y s h o r t s p a n o f t i m e . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S N o d a l e x p l a n t s w e r e c o l l e c t e d f r o m 6 0 - d a y s - o l d g a r d e n p l a n t o f R . h y b r i d a . B e f o r e u s e , t h e e x p l a n t s w e r e g i v e n a q u i c k r i n s e i n 7 0 % e t h a n o l f o r 2 m i n , t h e n i m m e r s i o n i n 0 . 1 % m e r c u r i c h y p o c h l o r i d e f o r 1 m i n , f o l l o w e d b y t h r e e r i n s e s w i t h s t e r i l e - d i s t i l l e d w a t e r . T h e a s e p t i c e x p l a n t s w e r e c u t a n d c u l t u r e d o n M S b a s a l m e d i u m ( M u r a s h i g e a n d S k o o g , 1 9 6 2 ) s u p p l e m e n t e d w i t h / w i t h o u t B A P , 2 , 4 - D , N A A , K i n e t i n o r I B A , s e p a r a t e l y o r i n c o m b i n a t i o n . T h e p h a s e s o f c a l l u s i n d u c t i o n , s h o o t i n g , s h o o t e l o n g a t i o n a n d s h o o t m u l t i p l i c a t i o n w e r e s u b - c u l t u r e d / c a r r i e d o u t i n s i m i l a r m e d i u m . D a t a o n r e s p o n s e o f e x p l a n t s , n u m b e r o f s h o o t s p e r e x p l a n t s w e r e c o l l e c t e d a f t e r d a y - 1 5 a n d 4 0 , r e s p e c t i v e l y , a n d r e g e n e r a t e d s h o o t s w e r e e x c i s e d a n d s u b - c u l t u r e d o n s i m i l a r m e d i u m a f t e r d a y - 4 0 . A l l c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d i n c o n t r o l l e d e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s w i t h a 1 6 - h p h o t o p e r i o d u n d e r c o o l f l u o r e s c e n t w h i t e l i g h t ( ~ 5 0 µ m o l m - 2 s - 1 ) . T h e d e s i g n o f a l l e x p e r i m e n t s w a s a c o m p l e t e r a n d o m i z e d b l o c k , a n d e a c h e x p e r i m e n t c o n s i s t e d o f 2 - 3 e x p l a n t s p e r f l a s k a n d e i g h t r e p l i c a t e c u l t u r e f l a s k s p e r p l a n t g r o w t h r e g u l a t o r t r e a t m e n t . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N C a l l o g e n e s i s i s c o n s i d e r e d a s a s i g n i f i c a n t f e a t u r e o f i n d i r e c t o r g a n o g e n e s i s a n d f o r r e s e a r c h o n b i o l o g i c a l l y a c t i v e m o l e c u l e s i n o r n a m e n t a l a n d m e d i c i n a l s p e c i e s ( A b b a s i e t a l . , 2 0 1 0 ) . I n v e s t i g a t i o n s o f i n v i t r o r e g e n e r a t i o n w e r e a c c o m p l i s h e d w i t h c a l l u s i n d u c t i o n , m a i n t e n a n c e o f c a l l i , s h o o t o r g a n o g e n e s i s a n d s h o o t m u l t i p l i c a t i o n . T h e e f f e c t s o f v a r i o u s P G R s s u c h a s B A , 2 , 4 - D a n d N A A a l o n e o r B A i n c o m b i n a t i o n w i t h 1 m g l - 1 2 , 4 - D o r 1 m g l - 1 N A A o n i n d i r e c t o r g a n o g e n e s i s w e r e e v a l u a t e d ( F i g u r e 1 A - 1 I ) . N o d a l e x p l a n t s o f R . h y b r i d a u s e d i n p r e s e n t s t u d y r e s p o n d e d t o a l l P G R s u s e d ( F i g u r e 3 ) . B e s t c a l l u s i n d u c t i o n w a s r e c o r d e d o n M S m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 2 . 0 m g l - 1 B A ( 8 5 % ) a n d 1 . 5 m g l - 1 B A w i t h 0 . 5 m g l - 1 2 , 4 - D ( 8 0 % ; F i g u r e 1 A - 1 I ) . C a l l u s i n d u c t i o n r e c o r d e d f o r 2 , 4 - D ( 2 5 % ) a n d N A A ( 3 0 % ) i n c o m b i n a t i o n w i t h B A w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n o t h e r P G R s , a n d n o c a l l u s w a s o b s e r v e d o n S e e m a e t a l . , 2 0 1 2 2 9 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 4 ) : 2 9 6 - 3 0 2

S e e m a e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 4 ) : 2 9 6 - 3 0 2 2 9 8 M S 0 m e d i u m . H o w e v e r , a d d i t i o n o f 2 , 4 - D ( 0 . 5 t o 1 . 0 m g l - 1 ) o r N A A ( 0 . 5 t o 1 . 0 m g l - 1 ) t o t h e m e d i u m c o n t a i n i n g B A ( 0 . 5 t o 2 . 0 m g l - 1 ) e n h a n c e d c a l l u s i n d u c t i o n ( 7 0 - 8 5 % ) t o c o m p a r a t i v e l e v e l s o f 3 . 0 m g l - 1 B A a n d 0 . 5 m g l - 1 B A w i t h 0 . 5 m g l - 1 2 , 4 - D o r 0 . 1 N A A m g l - 1 ( F i g u r e 3 ) . A b b a s i e t a l . , ( 2 0 1 0 ) r e p o r t e d i n r e c e n t s t u d y t h a t a d d i t i o n o f N A A i n m e d i u m c o n t a i n i n g B A / G A 3 e n h a n c e d c a l l u s i n d u c t i o n d u r i n g i n v i t r o r e g e n e r a t i o n o f S i l y b u m m a r i a n u m . F r o m t h e c u r r e n t e x p e r i m e n t i t w a s o b s e r v e d t h a t t h e m e d i u m c o n t a i n i n g C y t o k i n i n s i n c o m b i n a t i o n w i t h a u x i n s e n h a n c e d c a l l u s i n d u c t i o n . A s i m i l a r r e p o r t w a s a l s o o b s e r v e d b y A h m a d e t a l . , ( 2 0 1 0 ) t h a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n o f B A p r o m o t e c a l l o g e n e s i s i n i m p o r t a n t m e d i c i n a l p l a n t P i p e r n i g r u m L . T h e r e w a s d i s t i n c t d i f f e r e n c e i n a p p e a r a n c e o f c a l l u s m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h d i f f e r e n t p h y t o h o r m o n e s . A u x i n a n d C y t o k i n i n s h a v e c h i e f e f f e c t s o n c a l l u s i n d u c t i o n a n d r e g e n e r a t i o n , v a r y i n g t h e i r c o n c e n t r a t i o n i n t h e m e d i u m , c a u s e d i f f e r e n c e s i n a m o u n t , r a t e a n d g r o w t h p a t t e r n o f e x p l a n t s . D a t a o n s h o o t r e g e n e r a t i o n w e r e r e c o r d e d a f t e r 4 - 5 w e e k s o f s u b c u l t u r e ( F i g u r e 4 ) . T h e h i g h e s t s h o o t i n g ( 9 0 % ) w a s r e c o r d e d f o r l e a f e x p l a n t s c u l t u r e d o n m e d i u m c o n t a i n i n g 1 . 5 m g l - 1 B A a l o n e a n d 2 . 0 m g l - 1 B A a l o n g w i t h 1 . 0 m g l - 1 o f K i n e t i n . M o d e r a t e c o n c e n t r a t i o n s o f B A h a v e s h o w n h i g h e s t s h o o t i n g B C H G A D E F I F i g . 1 . E f f i c i e n t C a l l o g e n e s i s i n R . h y b r i d a L . ( A - I ) C a l l u s f o r m a t i o n a f t e r d a y - 1 5 o f c u l t u r e o n M S m e d i u m i n c o r p o r a t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f B A i n c o m b i n a t i o n w i t h 2 , 4 - D a n d N A A . B e s t c a l l o g e n i c r e s p o n s e w a s r e c o r d e d o n 2 . 0 m g L - 1 o f B A a l o n g w i t h 0 . 5 m g L - 1 o f N A A .

r e s p o n s e , h o w e v e r h i g h e r c o n c e n t r a t i o n h a s s h o w n i n h i b i t o r y a c t i o n . I n t h e c u r r e n t e x p e r i m e n t i t w a s a l s o o b s e r v e d t h a t t h e m e d i u m c o n t a i n i n g B A a n d K i n e t i n a l o n g w i t h S A ( A d e n i n e S u l p h a t e ) i n h i b i t s h o o t i n g . F o r t h e c o m b i n a t i o n c o n t a i n i n g 0 . 5 m g l - 1 o f B A a n d K i n e t i n a l o n g w i t h 0 . 5 m g l - 1 I S A i n d u c e d m a x i m u m 3 0 % s h o o t i n g i n n o d a l e x p l a n t s . A l s o t h e a d d i t i o n o f 2 , 4 - D a n d S A i n m e d i u m a l r e a d y c o n t a i n i n g B A s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d % s h o o t i n d u c t i o n . T h e s e f i n d i n g s w e r e s i m i l a r t o t h e o b s e r v a t i o n s o f K a n c h a n a p o o m e t a l . , ( 2 0 1 0 ) . N o n e t h e l e s s , B A w a s m o r e e f f e c t i v e t h a n o t h e r P G R s u s e d i n c u r r e n t r e p o r t . H o w e v e r , R a z a v i z a d e h a n d E h s a n p o u r ( 2 0 0 8 ) f i n d 7 0 % s h o o t i n g w a s i n d u c e d i n t h e m e d i u m c o n t a i n i n g c o m b i n a t i o n o f T D Z a n d B A . S h a b b i r e t a l . , ( 2 0 0 9 ) c o n c l u d e d f r o m h i s w o r k t h a t c o m b i n a t i o n o f B A a n d K i n i s e f f e c t i v e i n i n v i t r o s h o o t f o r m a t i o n f r o m a p i c a l m e r i s t e m o f R . h y b r i d a . B e s t s h o o t i n g o f 8 5 % h a s b e e n p r o d u c e d w h e n t h e m e d i u m w a s s u p p l e m e n t e d w i t h 3 m g l - 1 o f B A . T h e f i n d i n g s o f T a n g e t a l . , ( 2 0 1 0 ) w a s a l s o i n a g r e e m e n t w i t h o u r d a t a t h a t c o m b i n a t i o n o f B A a n d N A A i n d u c e d 9 7 % r e g e n e r a t i o n i n L i l i u m l e u c a n t h u m . S e e m a e t a l . , 2 0 1 2 2 9 9 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 4 ) : 2 9 6 - 3 0 2 A B C F E D G H I F i g . 2 . D i r e c t a n d i n d i r e c t s h o o t o r g a n o g e n e s i s i n R . h y b r i d a L . ( A - D ) C a l l u s s u b c u l t u r e o n m e d i u m c o n t a i n i n g d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f B A a l o n e o r e i t h e r i n c o m b i n a t i o n w i t h K i n a n d S A . B e s t r e s p o n s e o f i n d i r e c t s h o o t o r g a n o g e n e s i s w a s r e c o r d e d a f t e r s u b c u l t u r e o n m e d i u m c o n t a i n i n g 2 . 0 m g L - 1 o f B A . ( E - I ) D i r e c t s h o o t o r g a n o g e n e s i s f r o m n o d a l e x p l a n t s w a s r e c o r d e d o n 2 . 0 m g L - 1 o f B A i n c o m b i n a t i o n w i t h 1 . 0 m g L - 1 o f N A A .