J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y T h e c o m b i n e d e f f e c t s o f t e m p e r a t u r e a n d s a l i n i t y o n s u r v i v a l o f l a r v a e a n d j u v e n i l e s o f t r o p i c a l a b a l o n e H a l i o t i s a s i n i n a u n d e r l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s K e y w o r d s : T r o p i c a l a b a l o n e , H . a s i n i n a , t e m p e r a t u r e , s a l i n i t y , s u r v i v a l , e a r l y l i f e s t a g e s . A B S T R A C T : T h i s p a p e r r e p o r t s o n a 3 x 3 f a c t o r i a l d e s i g n e x p e r i m e n t c o n d u c t e d t o e x a m i n e t h e c o m b i n e d e f f e c t s o f t e m p e r a t u r e a n d s a l i n i t y o n s u r v i v a l o f l a r v a e a n d j u v e n i l e s o f t r o p i c a l a b a l o n e H a l i o t i s a s i n i n a u n d e r l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s f o r 9 6 h . T h e t e m p e r a t u r e s u s e d w e r e 2 5 , 3 0 a n d 3 5 ° C a n d t h e s a l i n i t i e s w e r e 2 7 , 3 0 a n d 3 3 p p t . R e s p o n s e s u r f a c e c o n t o u r d i a g r a m s w e r e g e n e r a t e d f r o m t h e s u r v i v a l d a t a t o e s t i m a t e o p t i m a l c o n d i t i o n s . T h e h i g h e s t s u r v i v a l o f n e w l y - h a t c h e d l a r v a e , n e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e a n d f u l l y j u v e n i l e s o f H . a s i n i n a w a s o b t a i n e d a t t h e l o w e s t t e m p e r a t u r e t e s t e d ( 2 5 ° C ) w i t h t h e h i g h e s t s a l i n i t y t e s t e d ( 3 3 p p t ) , w h i l e t h e l o w e s t s u r v i v a l w a s o b t a i n e d a t t h e h i g h e s t t e m p e r a t u r e t e s t e d ( 3 5 ° C ) w i t h t h e l o w e s t s a l i n i t y t e s t e d ( 2 7 p p t ) . T w o - w a y A N O V A s h o w e d t h a t s u r v i v a l o f l a r v a e , n e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e s a n d f u l l y j u v e n i l e s w e r e s i g n i f i c a n t l y a f f e c t e d b y t e m p e r a t u r e a n d s a l i n i t y . A s i g n i f i c a n t i n t e r a c t i o n b e t w e e n b o t h f a c t o r s o c c u r r e d i n n e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e s a n d f u l l y j u v e n i l e s b u t n o t f o r l a r v a e . M u l t i p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s i n d i c a t e d a h i g h e r c o r r e l a t i o n b e t w e e n s a l i n i t y a n d s u r v i v a l o f l a r v a e H . a s i n i n a b u t a h i g h e r c o r r e l a t i o n b e t w e e n t e m p e r a t u r e a n d s u r v i v a l f o r n e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e s a n d f u l l y j u v e n i l e s . T h i s s t u d y i n d i c a t e d t h a t t h e o p t i m a l c o n d i t i o n s f o r m a x i m u m s u r v i v a l o f l a r v a l , n e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e a n d f u l l y j u v e n i l e s w e r e 2 7 - 3 0 ° C a n d 3 1 - 3 3 p p t , 2 6 - 2 9 ° C a n d 2 7 - 3 3 p p t , a n d 2 6 - 2 7 ° C a n d 3 1 - 3 3 p p t , r e s p e c t i v e l y . 5 7 2 - 5 7 9 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 6 T h i s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m A u t h o r s : N i l n a j C h a i t a n a w i s u t i 1 , S i r i n u n N u n i m 2 a n d W a n n a n e e S a n t h a w e e s u k 1 . I n s t i t u t i o n : 1 . A q u a t i c R e s o u r c e s R e s e a r c h I n s t i t u t e , C h u l a l o n g k o r n U n i v e r s i t y , B a n g k o k , T h a i l a n d 1 0 3 3 0 . 2 . D e p a r t m e n t o f E n v i r o n m e n t a l S c i e n c e , G r a d u a t e S c h o o l , C h u l a l o n g k o r n U n i v e r s i t y , B a n g k o k , T h a i l a n d 1 0 3 3 0 . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : N i l n a j C h a i t a n a w i s u t i . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / d o c u m e n t s / R A 0 2 1 8 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 1 4 M a r 2 0 1 2 A c c e p t e d : 0 3 A p r 2 0 1 2 P u b l i s h e d : 1 7 A u g 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : N i l n a j C h a i t a n a w i s u t i , S i r i n u n N u n i m a n d W a n n a n e e S a n t h a w e e s u k . T h e c o m b i n e d e f f e c t s o f t e m p e r a t u r e a n d s a l i n i t y o n s u r v i v a l o f l a r v a e a n d j u v e n i l e s o f t r o p i c a l a b a l o n e H a l i o t i s a s i n i n a u n d e r l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 6 ) : 5 7 2 - 5 7 9 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y O r i g i n a l R e s e a r c h A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l

I N T R O D U C T I O N T h e t r o p i c a l a b a l o n e ( H a l i o t i s a s i n i n a ) i s d i s t r i b u t e d a l o n g t h e E a s t c o a s t o f t h e u p p e r G u l f o f T h a i l a n d , a n d i n t h e A n d a m a n S e a . T r o p i c a l a b a l o n e c u l t u r e i n T h a i l a n d i s p r e s e n t l y t h e v e r y e a r l y s t a g e s o f b a s i c a n d a p p l i e d r e s e a r c h c o n d u c t e d i n s m a l l - s c a l e o p e r a t i o n s . T h e e c o n o m i c v i a b i l i t y o f c o m m e r c i a l t r o p i c a l a b a l o n e f a r m i n g d e p e n d s o n t h e s y s t e m d e s i g n a n d t e c h n i q u e s u s e d f o r g r o w - o u t c u l t u r e . H . a s i n i n a h a s f a s t g r o w t h r a t e s a n d a r e l a t i v e l y h i g h s a l i n i t y t o l e r a n c e i n c o m p a r i s o n t o o t h e r s p e c i e s ( J a r a y a b h a n d a n d P a p h a v a s i t 1 9 9 6 ) . I n g e n e r a l , m a j o r f a c t o r s a f f e c t i n g g r o w t h a n d s u r v i v a l r a t e s o f t h e e a r l y l i f e s t a g e a n d m a t u r e o f v a r i o u s a q u a t i c a n i m a l s a r e t e m p e r a t u r e a n d s a l i n i t y . T e m p e r a t u r e a n d s a l i n i t y a r e c o n s i d e r e d t o b e t h e m o s t i m p o r t a n t p h y s i c a l f a c t o r s i n f l u e n c i n g m a r i n e o r g a n i s m s , a n d t h e b i o l o g i c a l e f f e c t s o f t h e s e f a c t o r s a r e c o m p l e x a n d w i d e r a n g i n g . T e m p e r a t u r e i s o n e o f t h e m o s t c r i t i c a l e x t e r n a l f a c t o r s o f d e v e l o p m e n t i n t h e e a r l y l i f e s t a g e s o f s h e l l f i s h . T h e r e a r e t w o w a y s i n w h i c h t e m p e r a t u r e a f f e c t s o n t o g e n y . F i r s t l y , t e m p e r a t u r e , i f w i t h i n a v i a b l e r a n g e , s t r o n g l y a f f e c t s t h e r a t e o f o n t o g e n y . A t e m p e r a t u r e b e y o n d t h i s r a n g e i s l e t h a l f o r t h e s p e c i e s . S e c o n d l y , t e m p e r a t u r e a f f e c t s t h e h a t c h r a t e , i n c u b a t i o n p e r i o d , t h e s i z e o f t h e n e w l y h a t c h e d l a r v a e , l a r v a l y o l k a b s o r p t i o n a n d u t i l i z a t i o n , l a r v a l f e e d i n g b e h a v i o r , l a r v a l s u r v i v a l a n d l a r v a l g r o w t h ( S h i e t a l . , 2 0 1 0 ) . I n a d d i t i o n , s a l i n i t y c o u l d m o d i f y t h e e f f e c t s o f t e m p e r a t u r e a n d a l t e r t h e t e m p e r a t u r e r a n g e o f m a n y b i o l o g i c a l p r o c e s s e s . I n t u r n , t e m p e r a t u r e c a n a l s o m o d i f y t h e e f f e c t s o f s a l i n i t y ( A l b u q u e r q u e e t a l . , 2 0 0 9 ) . T e m p e r a t u r e a n d s a l i n i t y a f f e c t l a r v a l a n d j u v e n i l e g r o w t h a n d s u r v i v a l o f m a n y m a r i n e i n v e r t e b r a t e s . T h e c o m b i n e d e f f e c t s o f t e m p e r a t u r e a n d s a l i n i t y o n t h e s u r v i v a l o f m a r i n e a n i m a l s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d i n m a n y m a r i n e m o l l u s k s s u c h a s b i v a l v e s ( T a y l o r e t a l . , 2 0 0 4 , R o b e r t e t a l . , 1 9 8 8 , T e t t e l b a c h a n d R h o d e , 1 9 8 1 ) a n d g a s t r o p o d s ( L u e t a l . , 2 0 0 4 , D a v i s , 2 0 0 0 , C h e n a n d C h e n 2 0 0 0 , Z h e n g e t a l . , 2 0 0 0 ) . H o w e v e r , t h e r e i s n o i n f o r m a t i o n o n t h e e f f e c t s o f e n v i r o n m e n t a l p a r a m e t e r s , s u c h a s t e m p e r a t u r e , s a l i n i t y o n s u r v i v a l o f e a r l y l i f e s t a g e s f o r t r o p i c a l a b a l o n e H . a s i n i n a p a r t i c u l a r l y t h e c o m b i n e d e f f e c t s o f t e m p e r a t u r e a n d s a l i n i t y . D e t e r m i n a t i o n o f t h e o p t i m a l s a l i n i t y a n d t e m p e r a t u r e f o r l a r v a e a n d j u v e n i l e c u l t u r e o f H a l i o t i s a s i n i n a i s a n i m p o r t a n t s t e p i n d e v e l o p i n g m o r e e f f i c i e n t l a r g e - s c a l e h a t c h e r y c u l t u r e t e c h n i q u e s f o r t h i s s p e c i e s . I n a d d i t i o n , r e s u l t o f t h i s s t u d y p r o v i d e s g r e a t e r p r e c i s i o n f o r a s s e s s i n g t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n d i f f e r e n t f a c t o r s f o r s u r v i v a l o f v a r i o u s l i f e s t a g e s f o r t h i s s p e c i e s u n d e r n a t u r a l c o n d i t i o n s p a r t i c u l a r l y t h e e f f e c t s o f c l i m a t e c h a n g e . T h e o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y i s t o e x a m i n e t h e c o m b i n e d e f f e c t s o f t e m p e r a t u r e a n d s a l i n i t y o n s u r v i v a l o f l a r v a e a n d j u v e n i l e s o f t r o p i c a l a b a l o n e H a l i o t i s a s i n i n a u n d e r l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S T h i s l a b o r a t o r y e x p e r i m e n t w a s d e s i g n e d t o t e s t t h e c o m b i n e d e f f e c t s o f t h r e e t e m p e r a t u r e s ( 2 5 , 3 0 a n d 3 5 ° C ) a n d t h r e e s a l i n i t i e s ( 2 7 , 3 0 a n d 3 3 p p t ) o n s u r v i v a l f o r n e w l y - h a t c h e d l a r v a e , n e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e s a n d f u l l y j u v e n i l e s o f H . a s i n i n a . T h e e x p e r i m e n t w a s a 3 x 3 f a c t o r i a l d e s i g n , w i t h a l l n i n e t e m p e r a t u r e s a n d s a l i n i t y c o m b i n a t i o n s w e r e t e s t e d . T h e s t u d y w a s c o n d u c t e d d u r i n g s u m m e r s e a s o n f r o m F e b r u a r y t o A p r i l 2 0 1 1 i n w h i c h t e m p e r a t u r e s r a n g e d 2 8 - 2 9 ° C a n d i t w a s t h e s p a w n i n g s e a s o n f o r H . a s i n i n a . A l l t e m p e r a t u r e a n d s a l i n i t y c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t s f o r n e w l y - h a t c h e d l a r v a e , n e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e s a n d f u l l y j u v e n i l e s w e r e n o t r u n s i m u l t a n e o u s l y ( n e w l y - h a t c h e d l a r v a e i n F e b r u a r y , n e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e s i n M a r c h a n d f u l l y j u v e n i l e s i n A p r i l ) . S e a w a t e r b r o u g h t f r o m t h e s h o r e , a n d f i l t e r e d t h r o u g h a s e r i e s o f f i l t e r n e t d o w n t o 0 . 5 µ m w a s u s e d i n a l l c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t s . A m b i e n t s e a w a t e r w a s l o w e r e d t o s a l i n i t y o f 2 7 p p t b y d i l u t i o n w i t h d e - i o n i s e d w a t e r , a n d i t w a s i n c r e a s e d s a l i n i t y o f 3 3 p p t b y c o n c e n t r a t i o n u s i n g a i r e v a p o r a t i n g . T r e a t m e n t w a t e r w a s C h a i t a n a w i s u t i e t a l . , 2 0 1 2 5 7 3 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 6 ) : 5 7 2 - 5 7 9

m a d e i n t h e c o n t a i n e r s f o r 2 4 h r s i n a d v a n c e t o a l l o w t h o r o u g h l y m i x i n g o f s e a w a t e r a n d t h e t e m p e r a t u r e s t o a d j u s t t o t r e a t m e n t c o n d i t i o n s . S a l i n i t y a n d t e m p e r a t u r e w e r e m o n i t o r e d e v e r y 6 h r s . S a l i n i t y w a s m a i n t a i n e d w i t h i n + 0 . 5 p p t a n d w a t e r t e m p e r a t u r e w a s m a i n t a i n e d w i t h i n + 0 . 2 ° C u s i n g t h e r m o s t a t i c a l l y c o n t r o l l e d w a t e r b a t h s . G e n t l y a e r a t i o n w a s p r o v i d e d i n t h e c o n t a i n e r d u r i n g t h e e x p e r i m e n t a n d a n o r m a l p h o t o p e r i o d o f 1 2 L : 1 2 D w a s a d o p t e d t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t . T h e r e w e r e n o w a t e r e x c h a n g e d u r i n g e x p e r i m e n t f o r a l l t r e a t m e n t s . S a l i n i t y a n d t e m p e r a t u r e i n a l l e x p e r i m e n t a l u n i t s w e r e m e a s u r e d e v e r y s i x h o u r s u s i n g a p o r t a b l e r e f r a c t o - s a l i n o m e t e r a n d a m e r c u r y t h e r m o m e t e r , r e s p e c t i v e l y . A l l e x p e r i m e n t a l c o n t a i n e r s w e r e c o v e r e d w i t h a l u m i n u m f o i l t o p r e v e n t e v a p o r a t i o n a n d c o n s e q u e n t s a l i n i t y i n c r e a s e . T h i s s t u d y w a s c o n d u c t e d a t t h e h a t c h e r y o f R e s e a r c h U n i t f o r A b a l o n e C u l t i v a t i o n , A q u a t i c R e s o u r c e s R e s e a r c h I n s t i t u t e , C h u l a l o n g k o r n U n i v e r s i t y . T h e n e w l y - h a t c h e d l a r v a e , n e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e s a n d f u l l y j u v e n i l e s H . a s i n i n a u s e d f o r a l l c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e s a m e b a t c h o f s p a w n i n g . O n e m a l e a n d f e m a l e m a t u r e b r e e d e r w a s s e l e c t e d f o r i n d u c e d s p a w n i n g u s i n g d r y m e t h o d ( J a r a y a b h a n d a n d P a p h a v a s i t 1 9 9 6 ) . T h e l a r v a e w e r e t h e n i n c u b a t e d t o r e a c h t h e d e s i r e d l i f e s t a g e f o r t h e e x p e r i m e n t . T h e m e a n s i z e ( + S D ) a n d a g e o f n e w l y - h a t c h e d l a r v a e , n e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e s a n d f u l l y j u v e n i l e s H . a s i n i n a u s e d i n t h i s e x p e r i m e n t w e r e 1 2 0 0 + 0 . 0 4 µ m i n s h e l l l e n g t h ( 1 d a y s a f t e r f e r t i l i z a t i o n ) , 2 . 2 0 + 0 . 0 6 m m i n s h e l l l e n g t h ( 4 5 d a y s a f t e r f e r t i l i z a t i o n ) a n d 5 . 1 0 + 0 . 1 2 m m i n s h e l l l e n g t h ( 5 0 d a y s a f t e r s e t t l e m e n t ) , r e s p e c t i v e l y . T h e m o s t a c t i v e a n d h e a l t h y a n i m a l s o f e a c h l i f e s t a g e w e r e c h o s e n f o r t h e c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t s . A s a m p l e o f 1 0 0 n e w l y - h a t c h e d l a r v a e , 5 0 n e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e s a n d 5 0 f u l l y j u v e n i l e s w e r e i n i t i a l l y s t o c k e d i n e a c h e x p e r i m e n t a l u n i t s o f 1 0 0 0 - m L t r a n s p a r e n t , g l a s s c o n t a i n e r . T h i s s t o c k i n g d e n s i t y i s l o w e r t h a n t h a t u s e d i n s t a n d a r d a q u a c u l t u r e p r a c t i c e f o r t h i s s p e c i e s s o t h a t s t o c k i n g d e n s i t y w a s n o t a l i m i t i n g f a c t o r f o r s u r v i v a l ( J a r a y a b h a n d a n d P a p h a v a s i t 1 9 9 6 ) . I n t h i s s t u d y , t h e a n i m a l s w e r e s u d d e n l y e x p o s e d t o e a c h t e m p e r a t u r e a n d s a l i n i t y c o m b i n a t i o n . T h e r e w e r e t h r e e r e p l i c a t e c o n t a i n e r s f o r e a c h c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t . N o f o o d w a s s e r v e d t o t h e l a r v a e d u r i n g t h e e x p e r i m e n t b u t t h e n e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e s a n d f u l l y j u v e n i l e s w e r e f e d a t o n c e d a i l y w i t h c u l t i v a t e d b e n t h i c d i a t o m m a i n l y ( N a v i c u l a s p . ) a n d c o m m e r c i a l s h r i m p ( P e n a e u s m o n o d o n ) p e l l e t , r e s p e c t i v e l y s o t h a t f o o d a v a i l a b i l i t y w a s n o t a l i m i t i n g C h a i t a n a w i s u t i e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 6 ) : 5 7 2 - 5 7 9 5 7 4 T a b l e 1 . P e r c e n t a g e s u r v i v a l r a t e o f l a r v a e , n e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e s a n d f u l l y j u v e n i l e s H . a s i n i n a t h r o u g h 9 6 h u n d e r d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e a n d s a l i n i t y c o m b i n a t i o n s T e m p e r a t u r e ( ° C ) S a l i n i t y ( ‰ ) L a r v a e L a r v a e 2 5 2 7 2 9 . 9 4 + 3 . 3 3 3 0 5 0 . 0 9 + 8 . 5 9 3 3 6 2 . 2 0 + 2 . 9 0 3 0 2 7 3 0 . 4 1 + 9 . 0 9 3 0 5 6 . 1 6 + 0 . 8 1 3 3 5 9 . 3 0 + 1 . 9 7 3 5 2 7 1 8 . 8 1 + 1 . 4 0 3 0 2 3 . 8 9 + 2 . 8 9 3 3 4 1 . 9 4 + 3 . 1 2 N e w l y - s e t t l e d j u v e n i l e s 2 5 2 7 9 4 . 6 7 + 1 . 1 5 3 0 9 4 . 6 7 + 1 . 1 5 3 3 9 7 . 3 3 + 1 . 1 5 3 0 2 7 9 4 . 6 7 + 1 . 1 5 3 0 9 3 . 3 3 + 1 . 1 5 3 3 9 3 . 3 3 + 3 . 0 6 3 5 2 7 1 0 . 0 0 + 5 . 2 9 3 0 2 4 . 0 0 + 1 2 . 1 7 3 3 4 8 . 6 7 + 4 . 1 6 F u l l y j u v e n i l e s 2 5 2 7 8 3 . 3 4 + 3 . 3 4 e 3 0 9 1 . 1 2 + 6 . 9 4 c 3 3 9 8 . 8 9 + 1 . 9 2 a 3 0 2 7 5 8 . 8 9 + 7 . 7 0 f 3 0 8 5 . 5 6 + 3 . 0 5 d 3 3 9 3 . 5 6 + 3 . 6 7 b 3 5 2 7 1 . 1 1 + 1 . 9 3 i 3 0 1 2 . 2 2 + 6 . 9 4 h 3 3 3 4 . 4 5 + 5 . 0 9 g M e a n i n t h e s a m e c o l u m n w i t h d i f f e r e n t s u p e r s c r i p t l e t t e r s a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( P < 0 . 0 5 )