J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y C r i t e r i a f o r o p t i m i z a t i o n o f m a s s r e a r i n g o f t h e p a r a s i t o i d C o t e s i a f l a v i p e s i n t h e l a b o r a t o r y K e y w o r d s : Q u a l i t y c o n t r o l , l a r v a l p a r a s i t o i d , m a s s r e a r i n g , b i o l o g i c a l c o n t r o l , s u g a r c a n e . A B S T R A C T : I n t h i s s t u d y , w e a i m e d t o e v a l u a t e c r i t e r i a t h a t s e r v e t o o p t i m i z e t h e m a s s r e a r i n g o f t h e p a r a s i t o i d C o t e s i a f l a v i p e s i n t h e l a b o r a t o r y . T h e f o l l o w i n g s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d : ( 1 ) O p t i m a l d e n s i t y o f t h e t h i r d i n s t a r l a r v a e o f D i a t r a e a s a c c h a r a l i s w a s p a r a s i t i z e d u s i n g a r e a r i n g u n i t , ( 2 ) P a r a s i t i s m c a p a c i t y d u r i n g t h e l i f e s p a n o f C . f l a v i p e s w a s e x a m i n e d , ( 3 ) P u p a e o f C . f l a v i p e s w e r e w e i g h e d , a n d ( 4 ) A d u l t C . f l a v i p e s w e r e f e d w i t h d i f f e r e n t d i e t s . W e f o u n d t h a t a d e n s i t y o f f i v e l a r v a e o f D . s a c c h a r a l i s p a r a s i t i z e d u s i n g a r e a r i n g u n i t i s m o s t s u i t a b l e f o r t h e m a s s p r o d u c t i o n o f C . f l a v i p e s . A f e m a l e C . f l a v i p e s m a y p a r a s i t i z e t h r e e l a r v a e o f D . s a c c h a r a l i s f o r u p t o 4 h a f t e r c o p u l a t i o n , g e n e r a t i n g q u a l i t y i n d i v i d u a l s f o r m a s s r e a r i n g . I t i s i m p r a c t i c a l t o m a s s m a r k e t t h e p a r a s i t o i d C . f l a v i p e s b y w e i g h t , t h e c o r r e c t i s t o c o u n t t h e n u m b e r o f m a s s e s t o f o r m t h e r e l e a s e u n i t . A d i e t o f 2 . 5 % h o n e y a n d 5 % s u c r o s e i s m o s t s u i t a b l e f o r a d u l t s d u r i n g t h e m a s s r e a r i n g o f C . f l a v i p e s . 5 2 9 - 5 3 6 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 5 T h i s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m A u t h o r s : R a m a l h o D G 1 , V i e l S R 2 , V a c a r i A M 1 , D e B o r t o l i S A 1 , L o p e s M M 3 , L a u r e n t i s V L 1 a n d V e i g a A C P 1 . I n s t i t u t i o n : 1 . l a b o r a t o r y o f B i o l o g y a n d I n s e c t R e a r i n g ( L B R I ) , D e p a r t m e n t o f C r o p P r o t e c t i o n , C o l l e g e o f A g r i c u l t u r a l a n d V e t e r i n a r y S c i e n c e s , S a o P a u l o S t a t e U n i v e r s i t y , 1 4 8 8 4 - 9 0 0 J a b o t i c a b a l , S a o P a u l o , B r a z i l . 2 . L o u i s D r e y f u s C o m m o d i t i e s ( S u g a r c a n e M i l l ) , 1 4 8 7 0 - 9 0 4 J a b o t i c a b a l , S a o P a u l o , B r a z i l . 3 . C o l l e g e o f E d u c a t i o n S a o L u i s , 1 4 8 7 0 - 3 7 , J a b o t i c a b a l , S a o P a u l o , B r a z i l . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : V a c a r i A M . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / d o c u m e n t s / R A 0 2 1 5 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 1 3 M a r 2 0 1 2 A c c e p t e d : 0 3 A p r 2 0 1 2 P u b l i s h e d : 2 8 J u l 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : R a m a l h o D G , V i e l S R , V a c a r i A M , D e B o r t o l i S A , L o p e s M M , L a u r e n t i s V L a n d V e i g a A C P . C r i t e r i a f o r o p t i m i z a t i o n o f m a s s r e a r i n g o f t h e p a r a s i t o i d C o t e s i a f l a v i p e s i n t h e l a b o r a t o r y . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 5 ) : 5 2 9 - 5 3 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y O r i g i n a l R e s e a r c h J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l A n I n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h J o u r n a l

I N T R O D U C T I O N S u g a r c a n e c u l t u r e i s p e r f o r m e d i n s e v e r a l B r a z i l i a n s t a t e s , a n d t h e c o u n t r y r a n k s f i r s t i n t h e w o r l d i n t h e p r o d u c t i o n o f s u g a r a n d e t h a n o l ( M a p a , 2 0 1 1 ) . S u s t a i n a b l e a g r i c u l t u r a l p r o d u c t i o n o f s u g a r c a n e i n B r a z i l i s b a s e d o n t h e a b i l i t y t o r e s p o n d t o p e s t s , d i s e a s e s , a n d c l i m a t i c v a r i a t i o n s , w h i l e e n s u r i n g t h e l e a s t p o s s i b l e i m p a c t t o t h e e n v i r o n m e n t t h r o u g h t h e u s e o f i n t e g r a t e d p e s t m a n a g e m e n t ( M a c e d o , 2 0 0 0 ) . B i o l o g i c a l c o n t r o l i s a p r o m i s i n g a l t e r n a t i v e f o r p e s t m a n a g e m e n t . R e g u l a t i n g t h e n u m b e r o f i n d i v i d u a l s i n t h e p e s t p o p u l a t i o n t h r o u g h t h e a c t i o n o f b i o t i c m o r t a l i t y a g e n t s i s a n a t u r a l p r o c e s s . B i o l o g i c a l c o n t r o l o f t h e p e s t D i a t r a e a s a c c h a r a l i s ( F a b r i c i u s ) ( L e p i d o p t e r a : C a m b r i d a e ) b y u s i n g t h e e n d o p a r a s i t o i d C o t e s i a f l a v i p e s ( C a m e r o n ) ( H y m e n o p t e r a : B r a c o n i d a e ) i s t h e l a r g e s t p r o g r a m o f b i o l o g i c a l c o n t r o l i n B r a z i l . T o d a y , t h i s p a r a s i t o i d i s r e l e a s e d i n j u s t o v e r t h r e e m i l l i o n h e c t a r e s , a n d a b o u t 8 0 b i o f a c t o r i e s p r o d u c e t h i s n a t u r a l e n e m y . A l t h o u g h t h e r e a r e r e g i o n a l d i f f e r e n c e s , t h e m a i n p e s t s a r e c o n t r o l l e d b y b i o l o g i c a l m e a n s b y u s i n g i n s e c t s o r p a t h o g e n s ( A l v e s e t a l . , 2 0 0 8 ) . T h u s , s u g a r c a n e c u l t u r e i s o n e o f t h e f e w c r o p c u l t u r e s t h a t h a s f o c u s e d o n s u s t a i n a b l e a g r i c u l t u r a l p r o d u c t i o n s i n c e 1 9 7 0 ( G a l l o e t a l . , 2 0 0 2 ) . D u r i n g l a b o r a t o r y p r o d u c t i o n o f t h e w a s p C . f l a v i p e s , D . s a c c h a r a l i s l a r v a e i s t h e o n l y f o o d u s e d b e c a u s e d u r i n g d e v e l o p m e n t t h e w a s p r e q u i r e s a s u g a r c a n e b o r e r i n o r d e r t o m u l t i p l y ( M a c e d o e t a l . , 1 9 8 3 ) . T o m e e t t h e d e m a n d a n d a p p l i c a t i o n s f o r s u g a r c a n e , m a s s r e a r i n g o f t h e w a s p i s n e c e s s a r y , a n d o n e o f t h e b i g g e s t p r o b l e m s f a c e d d u r i n g t h e l a b o r a t o r y p r o d u c t i o n o f C . f l a v i p e s i s t h e q u a l i t y o f t h e p a r a s i t o i d ( P r e z o t t i a n d P a r r a , 2 0 0 2 ) . T h e l o w q u a l i t y o f t h e p a r a s i t o i d i s r e s p o n s i b l e f o r i t s f a i l u r e i n p r o d u c t i o n a n d n o n - d e m a n d . I t a l s o c o n t r i b u t e s t o p r o d u c e r s ’ r e s i s t a n c e t o u s i n g t h i s p a r a s i t o i d i n t h e f i e l d , g i v e n t h a t t h e g o a l i s t o c o n t r o l t h e t a r g e t p e s t a n d f a i l u r e i m p l i e s a r e d u c t i o n i n d e m a n d , d i s c r e d i t i n g t h e u s e o f b i o l o g i c a l c o n t r o l a n d c o n s e q u e n t l y i n c r e a s i n g t h e u s e o f p e s t i c i d e s . T h e s e r e s u l t s a r e r e f l e c t e d i n i n c r e a s e d e n v i r o n m e n t a l i m p a c t i n B r a z i l , w h i c h h a s b e c o m e t h e l a r g e s t c o n s u m e r o f i n s e c t i c i d e s s i n c e 2 0 0 8 , a c c o r d i n g t o A n v i s a ( 2 0 1 1 ) . I n t h i s s t u d y , w e h a v e e v a l u a t e d t h e c r i t e r i a u s e d t o o p t i m i z e t h e m a s s r e a r i n g o f t h e p a r a s i t o i d C . f l a v i p e s i n t h e l a b o r a t o r y . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S T h e e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n a c l i m a t e - c o n t r o l l e d r o o m a t 2 8 ± 1 ° C , w i t h a r e l a t i v e h u m i d i t y ( R H ) o f 5 0 ± 1 0 % a n d a p h o t o p h a s e f o r 1 2 h . D e n s i t i e s o f D . s a c c h a r a l i s l a r v a e p a r a s i t i z e d b y C . f l a v i p e s p e r r e a r i n g u n i t T h e e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d a t E c o q u a l i t y ® - A g e n t s o f B i o l o g i c a l C o n t r o l i n P i a c a t u , S a o P a u l o , B r a z i l . T h e t h i r d i n s t a r l a r v a e o f D . s a c c h a r a l i s w e r e s u b j e c t e d t o p a r a s i t i s m b y C . f l a v i p e s a n d p l a c e d i n p e t r i d i s h e s ( 6 × 2 c m ) c o n t a i n i n g a n a r t i f i c i a l d i e t , w h e r e t h e y r e m a i n e d u n t i l a m a s s o f p u p a e f o r m e d . T e s t i n g w a s p e r f o r m e d a t d e n s i t i e s o f 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , a n d 8 l a r v a e p e r d i s h ( 1 0 0 r e p l i c a t e s p e r t r e a t m e n t ) . A f t e r t h e p u p a e w e r e f o r m e d , t h e m a s s e s w e r e r e m o v e d , a n d t h e d i s h e s w e r e p l a c e d i n t r a n s p a r e n t 1 0 0 - m L p l a s t i c c u p s w i t h l i d s . W e e v a l u a t e d t h e n u m b e r o f m a s s e s f o r m e d p e r l a r v a e p e r d i s h . P a r a s i t i s m c a p a c i t y o f C . f l a v i p e s f e m a l e s T h e e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d a t E c o q u a l i t y ® - A g e n t s o f B i o l o g i c a l C o n t r o l i n P i a c a t u , S a o P a u l o , B r a z i l . T h i r t y C . f l a v i p e s f e m a l e s w e r e p l a c e d i n i n d i v i d u a l p e t r i d i s h e s ( 6 × 2 c m ) f o r 5 h , w h i c h i s t h e t i m e r e q u i r e d f o r c o u p l i n g ( 3 0 r e p l i c a t e s ) . E v e r y 2 h , t h e f e m a l e s r e c e i v e d t h i r d i n s t a r l a r v a e o f D . s a c c h a r a l i s f o r p a r a s i t i s m . E a c h p a r a s i t i z e d l a r v a w a s i d e n t i f i e d w i t h t h e n u m b e r o f f e m a l e s t h a t o v i p o s i t e d a n d t h e n s t o r e d i n p e t r i d i s h e s ( d i a m e t e r , 6 c m ) c o n t a i n i n g t h e a r t i f i c i a l d i e t . P a r a s i t i s m w a s p e r f o r m e d e v e r y 2 h u n t i l t h e d e a t h o f t h e p a r a s i t o i d . T h e p u p a e m a s s e s o b t a i n e d f r o m R a m a l h o e t a l . , 2 0 1 2 5 3 0 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 5 ) : 5 2 9 - 5 3 6

p a r a s i t i z e d l a r v a e w e r e t r a n s f e r r e d t o 1 0 - m L t u b e s a n d c l o s e d w i t h p e r f o r a t e d p l a s t i c l i d s . T h e n e w l y e m e r g e d p a r a s i t o i d s w e r e f r o z e n a n d s u b s e q u e n t l y s e p a r a t e d b y s e x o n t h e b a s i s o f t h e s e x u a l d i m o r p h i s m o f a n t e n n a s , a s d e s c r i b e d b y W i l k i n s o n , ( 1 9 2 8 ) . W e t h e n c o u n t e d t h e n u m b e r o f m a l e s a n d f e m a l e s t h a t e m e r g e d f r o m e a c h m a s s . W e i g h t o f C . f l a v i p e s p u p a e T h e e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d a t t h e L a b o r a t o r y o f E n t o m o l o g y o f L o u i s D r e y f u s C o m m o d i t i e s M i l l , J a b o t i c a b a l , S a o P a u l o , B r a z i l . T h e e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d i n a r o o m a t 2 8 ± 1 ° C ( R H 4 0 ± 1 0 % ) , w i t h a p h o t o p h a s e f o r 1 2 h . T h e r e w e r e 1 5 0 p u p a e m a s s e s o f C . f l a v i p e s i n p e t r i d i s h e s ( 6 × 2 c m ) . T h e p u p a e m a s s e s w e r e a g e d 0 – 2 4 h w h e n t h e y w e r e w e i g h e d , a n d a f t e r 1 5 d a y s o f p a r a s i t i s m , t h e y w e r e w e i g h e d e v e r y 1 2 h u n t i l t h e a d u l t s e m e r g e d . F i v e p u p a e m a s s e s w e r e w e i g h e d a t 0 , 1 2 , 2 4 , 3 6 , 4 8 , a n d 6 0 h . T h e e x p e r i m e n t a l d e s i g n w a s c o m p l e t e l y r a n d o m i z e d , w i t h s i x t r e a t m e n t s a n d f i v e r e p l i c a t e s . T h i r t y m a s s e s w e r e w e i g h e d a n d w e i g h t l o s s w a s c a l c u l a t e d . F e e d i n g o f C . f l a v i p e s a d u l t s w i t h d i f f e r e n t d i e t s T h e e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d i n a c l i m a t e - c o n t r o l l e d r o o m a t 2 8 ± 1 º C , R H 4 0 ± 1 0 % , a n d a p h o t o p h a s e f o r 1 2 h , a t t h e L a b o r a t o r y o f E n t o m o l o g y o f L o u i s D r e y f u s C o m m o d i t i e s M i l l , J a b o t i c a b a l , S a o P a u l o , B r a z i l . C . f l a v i p e s a d u l t s w e r e f e d d i f f e r e n t d i e t s b e f o r e b e g i n n i n g p a r a s i t i s m o f t h e h o s t D . s a c c h a r a l i s l a r v a e 1 5 d a y s o f a g e w e r e p a r a s i t i z e d b y C . f l a v i p e s a d u l t s f e d w i t h d i e t s p r e v i o u s l y d i l u t e d i n w a t e r t o t h e f o l l o w i n g c o n c e n t r a t i o n s : 2 . 5 % s u c r o s e , 2 . 5 % s u c r o s e + 2 . 5 % y e a s t , 2 . 5 % h o n e y , h o n e y + 2 . 5 % y e a s t 2 . 5 , 5 % s u c r o s e , 5 % s u c r o s e + 2 . 5 y e a s t , 5 % h o n e y , 5 % h o n e y + 2 . 5 % y e a s t , 1 0 % s u c r o s e , 1 0 % s u c r o s e + 2 . 5 % y e a s t , 1 0 % h o n e y , 1 0 % h o n e y + 2 . 5 % y e a s t , 2 . 5 % y e a s t , d i s t i l l e d w a t e r , a n d c o n t r o l ( w i t h o u t d i e t ) . T h e e x p e r i m e n t a l d e s i g n w a s c o m p l e t e l y r a n d o m i z e d , w i t h f i f t e e n t r e a t m e n t s a n d f i v e r e p l i c a t e s . W e w e i g h e d t h e p u p a e m a s s e s , w e i g h t o f 3 0 p u p a e m a s s e s , n u m b e r o f a d u l t s t h a t e m e r g e d f r o m m a s s , a n d s e x r a t i o o f C . f l a v i p e s . D a t a a n a l y s i s T h e d a t a o f d i f f e r e n t d e n s i t i e s o f p a r a s i t i z e d l a r v a e p e r d i s h w e r e p r o c e s s e d u s i n g c l u s t e r a n a l y s i s w i t h t h e p r o g r a m S t a t i s t i c a 7 . 0 ( S t a t s o f t I n c . , 2 0 0 4 ) . C l u s t e r a n a l y s i s w a s u s e d a s a n e x p l o r a t o r y m e t h o d , w h i c h d o e s n o t i n v e s t i g a t e t h e a s s u m p t i o n s o f i n d e p e n d e n c e a n d n o r m a l i t y . D a t a w e i g h i n g o f t h e p u p a e m a s s o f C . f l a v i p e s d u r i n g p u p a l s t a g e a n a l y s i s w a s c o n d u c t e d u s i n g P R O C R E G S A S I n s t i t u t e ( 2 0 0 2 ) b y c o n s i d e r i n g t h e w e i g h t o f 3 0 m a s s e s a n d w e i g h t l o s s a s t h e d e p e n d e n t v a r i a b l e s ( y ) a n d t h e t i m e i n h o u r s a s t h e i n d e p e n d e n t v a r i a b l e ( x ) . T h e c u r v e m o d e l w a s s e l e c t e d o n b a s i s o f t h e s i g n i f i c a n c e o f t h e c o e f f i c i e n t ( P < 0 . 0 5 ) a n d i t s c o n t r i b u t i o n t o b e t t e r b i o l o g i c a l r e p r e s e n t a t i o n . T h e d a t a p a r a s i t i s m c a p a c i t y a n d f e e d i n g o f C . f l a v i p e s a d u l t s w i t h d i f f e r e n t d i e t s w e r e a n a l y z e d u s i n g t h e K o l m o g o r o v a n d B a r t t l e t t e s t s f o r n o r m a l i t y a n d h o m o g e n e i t y o f v a r i a n c e , r e s p e c t i v e l y , a n d n e c e s s a r y c h a n g e s w e r e m a d e t o s a t i s f y t h e r e q u i r e m e n t s o f a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) . A N O V A u s i n g P R O C A N O V A f r o m S A S I n s t i t u t e ( 2 0 0 2 ) w a s p e r f o r m e d , a n d t h e a v e r a g e v a l u e s w e r e c o m p a r e d u s i n g T u k e y ’ s t e s t a t 5 % p r o b a b i l i t y w h e n s i g n i f i c a n t o n t h e b a s i s o f A N O V A . R E S U L T S T h e r e s u l t s f o r t h e p r o d u c t i v i t y o f C . f l a v i p e s o f d i f f e r e n t d e n s i t i e s o f p u p a e m a s s e s s h o w e d t h a t w h e n t h e r e w e r e 3 , 4 , a n d 5 l a r v a e p e r p e t r i d i s h , a h i g h e r n u m b e r o f m a s s e s w a s p r o d u c e d ( F i g . 1 ) . T h e m o s t s u i t a b l e d e n s i t y f o r m a s s p r o d u c t i o n w a s f i v e l a r v a e p e r d i s h , w h i c h w a s d e t e r m i n e d o n t h e b a s i s o f t h e q u a l i t y o f p a r a s i t o i d s p r o d u c e d , p r o d u c t i v i t y ( c a t e r p i l l a r s i n o c u l a t e d / e m p l o y e e / d a y ) , a n d s a v i n g o f t h e s u p p l i e s a n d m a t e r i a l s u s e d . W h e n w e s t u d i e d t h e t i m e o f p a r a s i t i s m a f t e r R a m a l h o e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 5 ) : 5 2 9 - 5 3 6 5 3 1