J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y E f f e c t o f d r o u g h t s t r e s s o n p r o t e i n a n d p r o l i n e m e t a b o l i s m i n s e v e n t r a d i t i o n a l r i c e ( O r y z a s a t i v a L i n n . ) g e n o t y p e s o f A s s a m , I n d i a . K e y w o r d s : A b i o t i c s t r e s s e s , p r o l i n e , p r o t e i n , o s m o l y t e , g e n o t y p i c c o e f f i c i e n t o f v a r i a b i l - i t y , h e r i t a b i l i t y , t r a d i t i o n a l r i c e c u l t i v a r . A B S T R A C T : A b i o t i c s t r e s s e s c a n d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y a f f e c t t h e p h y s i o l o g i c a l s t a t u s o f a n o r g a n i s m b y a l t e r i n g i t s m e t a b o l i s m , g r o w t h , a n d d e v e l o p m e n t . M a n y p l a n t s p e c i e s n a t u r a l l y a c c u m u l a t e p r o l i n e a n d p r o t e i n a s m a j o r o r g a n i c o s m o l y t e s w h e n s u b j e c t e d t o d i f f e r e n t a b i o t i c s t r e s s e s . T h e s e c o m p o u n d s a r e t h o u g h t t o p l a y a d a p t i v e r o l e s i n m e d i a t i n g o s m o t i c a d j u s t m e n t a n d p r o t e c t i n g s u b c e l l u l a r s t r u c t u r e s i n s t r e s s e d p l a n t s . D i f f e r e n t a p p r o a c h e s h a v e b e e n c o n t e m p l a t e d t o i n c r e a s e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f p r o l i n e l i k e c o m p o u n d s i n p l a n t s g r o w n u n d e r s t r e s s c o n d i t i o n s t o i n c r e a s e t h e i r s t r e s s t o l e r a n c e . S e v e n d i f f e r e n t t r a d i t i o n a l r i c e v a r i e t i e s o f A s s a m w e r e e v a l u a t e d f o r t h e i r r e s p o n s e t o o s m o l y t e p r o d u c t i o n u n d e r p h y s i o l o g i c a l d r o u g h t c o n d i t i o n t h r o u g h s i m u l a t i o n a t t h r e e l e v e l s o f o s m o t i c s t r e s s o f 0 . 1 5 b a r , 0 . 2 5 b a r a n d 0 . 5 6 b a r o f p h y s i o l o g i c a l d r o u g h t i n i t i a t e d b y p o l y e t h y l e n e g l y c o l ( P E G 6 0 0 0 ) . A l o n g w i t h t h e e v a l u a t i o n f o r o s m o l y t e r e s p o n s e t h e d i f f e r e n t c o m p o n e n t s o f g e n o t y p i c v a r i a t i o n f o r s i x d i f f e r e n t d r o u g h t - s u s t a i n i n g c h a r a c t e r s i n t h e s e v e n r i c e v a r i e t i e s w e r e a l s o s u b s t a n t i a t e d . T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t p l a n t h e i g h t a n d s e e d n u m b e r h a v e s i g n i f i c a n t g e n o t y p i c c o e f f i c i e n t o f v a r i a b i l i t y ( G C V ) a n d h e r i t a b i l i t y . V e r i t i e s l i k e L a o d u b i , L e s e r i h a l i , B e r i a b h a n g a a n d B o r a h w e r e s c r e e n e d o u t a s t h e b e s t d r o u g h t s u s t a i n i n g v a r i e t y . 2 0 6 - 2 1 4 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 3 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : C h u t i a J , B o r a h S P , T a n t i B . I n s t i t u t i o n : 1 . D e p a r t m e n t o f B o t a n y , D a r r a n g C o l l e g e , T e z p u r - 7 8 4 0 0 1 A s s a m . 2 . D e p a r t m e n t o f B o t a n y , G a u h a t i U n i v e r s i t y , G u w a h a t i - 7 8 1 0 1 4 A s s a m . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : C h u t i a J . E m a i l : c j n a n @ r e d i f f m a i l . c o m . P h o n e N o : + 9 1 - 9 4 3 5 0 - 8 2 2 6 1 . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 2 0 8 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 3 M a r 2 0 1 2 / A c c e p t e d : 1 5 M a r 2 0 1 2 / P u b l i s h e d : 0 7 A p r 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : C h u t i a J , B o r a h S P , T a n t i B . E f f e c t o f d r o u g h t s t r e s s o n p r o t e i n a n d p r o l i n e m e t a b o l i s m i n s e v e n t r a d i t i o n a l r i c e ( O r y z a s a t i v a L i n n . ) g e n o t y p e s o f A s s a m , I n d i a . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 3 ) : 2 0 6 - 2 1 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h

I N T R O D U C T I O N R i c e g e n o t y p e s a r e k n o w n t o v a r y w i d e l y i n t h e i r r e s p o n s e s t o a b i o t i c s t r e s s e s . A b o u t f o r t y - t w o b i o t i c a n d a b i o t i c s t r e s s e s a f f e c t r i c e p r o d u c t i o n ( S a r k a r e t a l . 2 0 0 6 ) . R e c e n t s t u d i e s i n d i c a t e t h i s i n p a r t d u e t o t h e c o m p l e x i t y o f i n t e r a c t i o n s b e t w e e n s t r e s s f a c t o r s a n d v a r i o u s m o l e c u l a r , b i o c h e m i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l p h e n o m e n a a f f e c t i n g p l a n t g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t ( Z h u 2 0 0 2 ) . A l t e r a t i o n s i n i n t e r n a l w a t e r r e l a t i o n s a r e g e n e r a l l y e v a l u a t e d b y i n v e s t i g a t i n g t h e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n w a t e r p o t e n t i a l o r i t s s o l u t e a n d t u r g o r c o m p o n e n t s a n d r e l a t i v e w a t e r c o n t e n t ( C u t l e r e t a l . 1 9 8 0 ) . S i m u l a t i o n o f d r o u g h t s t r e s s b y p o l y e t h y l e n e g l y c o l ( P E G ) i n d e e d i n d u c e d d r o u g h t s t r e s s o n t h e p l a n t s ( J i a n g e t a l . 1 9 9 5 ) s i g n i f i c a n t d e v i a t i o n f r o m t h e c o n t r o l c o n t i n u e s t o i n c r e a s e w i t h t h e i n c r e a s i n g s o l u t e p o t e n t i a l ( Ψ s ) ( R a n j b a r f o r d o e i e t a l . 2 0 0 0 ) . P E G - 6 0 0 0 h a s l o n g b e e n u t i l i z e d a s a r e l i a b l e m a r k e r u n d e r l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s f o r t e s t i n g t h e d r o u g h t t o l e r a n t g e n o t y p e s . T h i s i s b e c a u s e p o l y e t h y l e n e g l y c o l a c t s a s a n o n - p e n e t r a t i n g o s m o t i c a g e n t r e s u l t i n g i n t o i n c r e a s i n g s o l u t e p o t e n t i a l ( Ψ s ) a n d b l o c k a g e o f a b s o r p t i o n o f w a t e r b y t h e r o o t s y s t e m ( C h e z e n e t a l . 1 9 9 5 a n d J i a n g e t a l . 1 9 9 5 ) . T h e r e f o r e , P E G s o l u t i o n s a r e o f t e n u s e d t o i n d u c e w a t e r s t r e s s i n h i g h e r p l a n t s ( A s h r a f a n d O ’ L e a r y 1 9 9 6 ) . D r o u g h t s c r e e n i n g u s i n g s o m e s e e d t e c h n o l o g i c a l p a r a m e t e r s h a s b e e n f o u n d t o b e q u i t e u s e f u l i n a n u m b e r o f c r o p s ( S i n g h a n d A f r i a 1 9 8 8 ) u n d e r l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s . T h i s t e c h n i q u e c a n b e f u r t h e r e x t e n d e d t o t e s t d r o u g h t t o l e r a n c e i n o t h e r g e n o t y p e s , ( K a r a n S i n g h e t a l . 2 0 0 1 ) . R e s p o n s e t o w a t e r s t r e s s i n p l a n t s a t t h e m o l e c u l a r l e v e l u n d o u b t e d l y c o n s t i t u t e s a n a r e a o f m a j o r i n t e r e s t f o r a c o m p l e t e u n d e r s t a n d i n g o f t h e p r o c e s s . T h e m a j o r s t r a t e g y f o r g a i n i n g s u c h u n d e r s t a n d i n g i s t h r o u g h t h e a p p r o a c h o f p r o t e o m i c s . D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f g e n e s u n d e r w a t e r s t r e s s c o n d i t i o n s c a n r e v e a l a p i c t u r e a s t o w h a t a r e t h e b i o c h e m i c a l p a t h w a y s t h a t a r e i n s t r u m e n t a l i n e n a b l i n g t h e c e l l s t o e l i c i t t h e r i g h t r e s p o n s e ( H o l m b e r g a n d B u l o w 1 9 9 8 , K a s u g a e t a l . 1 9 9 9 , S e r r a n o e t a l . 1 9 9 9 , H a s e g a w a e t a l . 2 0 0 0 , Z h u 2 0 0 1 a , P r a b h a v a t h i e t a l . 2 0 0 2 , R o n t e i n e t a l . 2 0 0 2 ) . W h i l e t h e r e a r e s e v e r a l r e p o r t s o f e x p r e s s i o n o f a n u m b e r o f g e n e s o n l y u n d e r w a t e r s t r e s s , a m u c h m o r e c o m p r e h e n s i v e a p p r o a c h i s t o p r o f i l e t h e t o t a l p r o t e i n c o n t e n t s a n d k i n d s o f p r o t e i n u n d e r n o r m a l a n d s t r e s s e d c o n d i t i o n s . I t h a s a l s o b e e n s e e n t h a t m a n y p l a n t s p e c i e s n a t u r a l l y a c c u m u l a t e p r o t e i n a n d p r o l i n e a s m a j o r o r g a n i c o s m o l y t e s w h e n s u b j e c t e d t o d i f f e r e n t a b i o t i c s t r e s s e s . T h e s e c o m p o u n d s a r e t h o u g h t t o p l a y a d a p t i v e r o l e i n m e d i a t i n g o s m o t i c a d j u s t m e n t a n d p r o t e c t i n g s u b c e l l u l a r s t r u c t u r e s i n s t r e s s e d p l a n t s . H o w e v e r , n o t a l l p l a n t s a c c u m u l a t e p r o t e i n o r p r o l i n e i n s u f f i c i e n t a m o u n t t o h e l p a v e r t i n g a d v e r s e e f f e c t s o f a b i o t i c s t r e s s e s . I t h a s a l s o b e e n o b s e r v e d t h a t s o m e s t r e s s p r o t e i n s a r e s y n t h e s i z e d d u r i n g t h e d e h y d r a t i o n s t r e s s ( S i n g h 2 0 0 3 , A s h r a f e t a l . 2 0 0 7 ) . T h u s , d i f f e r e n t a p p r o a c h e s h a v e b e e n c o n t e m p l a t e d t o i n c r e a s e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s e c o m p o u n d s i n p l a n t s g r o w n u n d e r s t r e s s c o n d i t i o n s t o i n c r e a s e t h e i r s t r e s s t o l e r a n c e . T h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n t h u s i s a i m e d a t e l u c i d a t i n g t h e d r o u g h t s u s t a i n i n g c h a r a c t e r o f s o m e t r a d i t i o n a l r i c e c u l t i v a r s o f A s s a m t o d r o u g h t s t r e s s b a s e d o n s o m e o f t h e i n v e s t i g a t i o n s c o n d u c t e d p r e v i o u s l y b y o t h e r s . S i n c e b r e e d e r s a r e s t i l l l o o k i n g f o r t r a i t s t h a t a r e s u i t a b l e f o r s c r e e n i n g r i c e g e r m p l a s m f o r c h a r a c t e r s a f f e c t i n g p l a n t w a t e r r e l a t i o n s u n d e r d r o u g h t c o n d i t i o n s ( J h a e t a l . 1 9 9 7 ) . T h e l a c k o f a r e l i a b l e m e t h o d f o r i d e n t i f y i n g s t r e s s t o l e r a n t g e n o t y p e s a n d t h e m a g n i t u d e o f f a c t o r s i n v o l v e d i n t o l e r a n c e t o w a t e r s t r e s s m a k e s i t d i f f i c u l t t o c h o o s e t r a i t s c o n f e r r i n g a n a d v a n t a g e u n d e r s u c h s t r e s s e d c o n d i t i o n s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S : T h e p r e s e n t s t u d y , i n i t i a l l y 1 2 v e r i t i e s w e r e c o n s i d e r e d v i z . , B e n g u n g u t i , B e r i a b h a n g a , B o r a h , J a h i n g a , K e s a m a n i , K o l a j o h a , L a o d u b i , L e s e r i h a l i , C h u t i a e t a l . , 2 0 1 2 2 0 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 3 ) : 2 0 6 - 2 1 4

P a t t e s a r i , R a n g a d a r i a , S a k u a k u m a l a n d S o l p u n a . A f t e r i n i t i a l s t u d i e s r e l a t e d t o g e r m i n a t i o n i n d e x ( G I ) i n P E G i n i t i a t e d d r o u g h t a n d t h e w h o l e p l a n t b e h a v i o u r u n d e r t h r e e w a t e r r e g i m e s t h e n s u b s e q u e n t l y o n l y s e v e n t r a d i t i o n a l v a r i e t i e s v i z . L a o d u b i , B o r a h , J a h i n g a , B e r i a b h a n g a , P a t t e s a r i , L e s e r i h a l i a n d K o l a j o h a o f A s s a m , I n d i a , w e r e s c r e e n e d f o r t h e i r r e s p o n s e t o o s m o l y t e p r o d u c t i o n u n d e r p h y s i o l o g i c a l d r o u g h t c o n d i t i o n s i m u l a t e d b y P E G 6 0 0 0 . T h r e e l e v e l s o f o s m o t i c p o t e n t i a l ( Ψ π ) o f 0 . 1 5 b a r , 0 . 2 5 b a r a n d 0 . 5 6 b a r i n d u c e d b y P E G - 6 0 0 0 w e r e u s e d f o r s i m u l a t i o n o f p h y s i o l o g i c a l d r o u g h t . S e e d s o f t h e e x p e r i m e n t a l r i c e v a r i e t i e s w e r e t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t s o l u t i o n s o f P E G - 6 0 0 0 . A f t e r t h e P E G - 6 0 0 0 t r e a t m e n t , t h e g e r m i n a t i o n i n d e x w a s d e t e r m i n e d a n d t h e s e e d l i n g s w e r e s u b s e q u e n t l y g r o w n u n d e r t h r e e d i f f e r e n t w a t e r r e g i m e s - ( i ) n o r m a l i r r i g a t e d c o n d i t i o n c o n s i d e r e d a s n o n - s t r e s s ( c o n t r o l ) , ( i i ) u n i r r i g a t e d w a t e r s t r e s s u p l a n d c o n d i t i o n a n d ( i i i ) u n i r r i g a t e d w a t e r s t r e s s p o t t e d c o n d i t i o n . T h e e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d i n a r a n d o m i z e d b l o c k d e s i g n ( R B D ) w i t h t h r e e r e p l i c a t i o n s . H u n d r e d h e a l t h y s e e d s e a c h o f t h e 7 d i f f e r e n t c u l t i v a r s w a s p r e s o a k e d i n d i s t i l l e d w a t e r f o r 1 2 h r s . F o r t y e i g h t p a i r s o f c l e a n a n d s t e r i l i z e d p e t r i p l a t e s w e r e u s e d f o r t h e e x p e r i m e n t . I n e a c h r e p l i c a t i o n t h e r e w e r e 1 6 p e t r i p l a t e s . T h e p r e s o a k e d s e e d s w e r e f i r s t a i r - d r i e d t o e l i m i n a t e t h e s u r f a c e w a t e r . T h e y w e r e t h e n p l a c e d o v e r b l o t t i n g p a p e r i n t h e p e t r i - p l a t e s a n d w e r e a l l o w e d t o g e r m i n a t e a s e p t i c a l l y u n d e r t h r e e d i f f e r e n t o s m o t i c p o t e n t i a l s i . e . , 0 . 1 5 b a r , 0 . 2 5 b a r a n d 0 . 5 6 b a r u s i n g a p p r o p r i a t e c o n c e n t r a t i o n o f P E G - 6 0 0 0 ( R a n j b a r f o r d o e i e t a l . 2 0 0 0 ) . D e i o n i s e d w a t e r w a s u s e d f o r t h e c o n t r o l a n d a p p l i e d s i m i l a r l y . A t r e g u l a r i n t e r v a l s o f 1 2 h r s , 5 - 6 d r o p s o f d i f f e r e n t s o l u t i o n s o f P E G - 6 0 0 0 w e r e a d m i n i s t e r e d t o t h e s e e d s i n t h e p e t r i p l a t e s . T h e t r e a t e d a n d c o n t r o l l e d s e e d s w e r e a l l o w e d t o g e r m i n a t e i n a B O D i n c u b a t o r a t 2 5 + 2 0 C f o r s e v e n d a y s . T h e l i d o f t h e p e t r i - p l a t e s w e r e o p e n e d a n d r e p l a c e d f o r e x c h a n g e o f f r e s h a i r t o t h e g r o w i n g s e e d l i n g s a t r e g u l a r i n t e r v a l s . T h e s e e d s s o a k e d i n P E G - 6 0 0 0 s o l u t i o n s w e r e k e p t u n d e r o b s e r v a t i o n f o r 7 d a y s a n d t h e g e r m i n a t i o n i n d e x w a s c a l c u l a t e d o u t . T h e n u m b e r o f g e r m i n a t i n g s e e d s w e r e c o u n t e d a n d c o n t i n u e d u p t o s e v e n d a y s a t a r e g u l a r i n t e r v a l o f 2 4 h r s . C o l l e c t e d d a t a w e r e a n a l y z e d f o r d e t e r m i n i n g t h e ( i ) s e e d g e r m i n a t i o n i n d e x , ( i i ) l e a f p r o t e i n c o n t e n t a n d ( i i i ) l e a f p r o l i n e c o n t e n t . T h e g e r m i n a t i o n i n d e x ( G I ) w a s c a l c u l a t e d b y u s i n g t h e f o r m u l a a s s u g g e s t e d b y t h e A s s o c i a t i o n o f O f f i c i a l S e e d A n a l y s i s ( A O S A 1 9 8 3 ) . F o r e s t i m a t i o n o f p r o t e i n a n d p r o l i n e c o n t e n t , y o u n g l e a v e s f r o m 2 0 d a y s o l d s e e d l i n g s g r o w n u n d e r o s m o t i c p o t e n t i a l s o f - 0 . 1 5 b a r , 0 . 2 5 b a r a n d 0 . 5 6 b a r w e r e t a k e n . T h e p r o l i n e c o n t e n t w a s a s s a y e d b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y B a t e s e t a l . ( 1 9 7 3 ) a n d C h i n a r d e t a l . ( 1 9 5 2 ) . F o r t h e e x p e r i m e n t , 0 . 5 g m o f f r e s h l y c o l l e c t e d l e a v e s w e r e h o m o g e n i z e d i n 1 0 m l o f 3 % a q u e o u s s u l p h o s a l i c y l i c a c i d . C o n t r o l s a m p l e w a s c o n s i s t e d o f l e a v e s f r o m s e e d l i n g s g r o w n i n d e i o n i z e d w a t e r a l o n e . T h e h o m o g e n a t e w a s f i l t e r e d t h r o u g h W h a t m a n N o . 2 f i l t e r p a p e r . 2 m l o f t h e f i l t r a t e w a s t a k e n i n a t e s t t u b e a n d 2 m l o f g l a c i a l a c e t i c a c i d w a s a d d e d t o i t . T o t h e m i x t u r e f r e s h l y p r e p a r e d 2 m l o f a c i d n i n h y d r i n w a s a d d e d . T h e f i n a l s o l u t i o n w a s s u b j e c t e d t o h e a t f o r 1 h r i n a b o i l i n g w a t e r b a t h . A f t e r o n e h o u r o f b o i l i n g t h e r e a c t i o n w a s t e r m i n a t e d b y p l a c i n g t h e t e s t t u b e i n a n i c e b a t h . N o w t o t h e t e s t t u b e 4 m l o f t o l u e n e w a s a d d e d a n d s t i r r e d f o r 2 0 – 3 0 s e c o n d s . S u b s e q u e n t l y , t h e t o l u e n e l a y e r w a s s e p a r a t e d a n d t h e f i n a l m i x t u r e w a s a g a i n w a r m e d t o r o o m t e m p e r a t u r e a n d t h e r e d c o l o u r ( s l i g h t l y r e d c o l o u r ) w a s m e a s u r e d a t 5 2 0 n m . A s t a n d a r d c u r v e w a s p r e p a r e d u s i n g 0 . 1 , 0 . 2 , 0 . 3 , 0 . 4 a n d 0 . 5 µ m o l o f p u r e p r o l i n e a n d u s e d f o r c o n v e r s i o n o f a b s o r b a n c e v a l u e s i n t o p r o l i n e c o n t e n t . P r o t e i n c o n t e n t i n t h e l e a f s a m p l e s w a s d e t e r m i n e d b y C h u t i a e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 ( 3 ) : 2 0 6 - 2 1 4 2 0 8 G I = N o . o f g e r m i n a t e d S e e d s + N o . o f g e r m i n a t e d S e e d s + - - + N o . o f g e r m i n a t e d S e e d s D a y s o f f i r s t c o u n t D a y s o f S e c o n d c o u n t D a y s o f f i n a l c o u n t