J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y M o r p h o l o g i c a l a l t e r a t i o n s c a u s e d b y D i f l u b e n z u r o n i n A n o p h e l e s d a r l i n g i r o o t ( D i p t e r a , C u l i c i d a e ) . K e y w o r d s : C h e m i c a l c o n t r o l , I G R , l a r v i c i d e , m o s q u i t o , l a r v a . A B S T R A C T : T h e m o r p h o l o g i c a l a l t e r a t i o n s c a u s e d b y D i f l u b e n z u r o n , L C 5 0 = 0 . 0 0 6 p p m , i n l a r v a e , p u p a e , a n d a d u l t s o f A n o p h e l e s d a r l i n g i ( R o o t 1 9 2 6 ) w e r e s i s t e m a t i z e d . T h e t h i r d s t a g e l a r v a e s h o w e d e l o n g a t i o n o f t h e c e r v i x 1 8 - 2 0 h o u r s a f t e r e x p o s u r e t o t h e i n s e c t i c i d e . E c d y s i s i n t h e s e l a r v a e s t a r t e d a f t e r 4 0 h o u r s : m o r t a l i t y b e g a n , w i t h t i s s u e e x t r a v a s a t i o n a n d d i f f i c u l t i e s t o d i s c a r d t h e e x u v i a . T h e f o u r t h s t a g e l a r v a e s h o w e d t i s s u e e x t r a v a s a t i o n i n t h e b e g i n n i n g o f t h e f o r m a t i o n o f t h e p u p a r i u m . T h e m o u t h p a r t s o f t h e l a r v a e t h a t c o m p l e t e d t h e p u p a r i u m w e r e e x p o s e d , l i g h t - c o l o r e d , a n d p r e s e n t e d c l e f t s o n t h e i n t e g u m e n t . M a n y o f t h o s e t h a t w e r e a b l e t o p e r f o r m e c d y s i s t o a d u l t c o u l d n o t e s c a p e t h e e x u v i a , a n d d i e d b o u n d b y t h e l e g s , t a r s i , a n d a b d o m e n . 2 1 5 - 2 2 1 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 3 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : C o s t a F M , T a d e i W P . I n s t i t u t i o n : I n s t i t u t o N a c i o n a l d e P e s q u i s a s d a A m a z ô n i a - I N P A / C P C S . L a b o r a t ó r i o d e M a l á r i a e D e n g u e . A v e n i d a A n d r é A r a ú j o , 2 9 3 6 P e t r ó p o l i s C E P 6 9 0 8 3 - 0 0 0 M a n a u s , A m a z o n a s , B r a s i l . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : C o s t a F M . E m a i l : f a b i o l o g o c o s t a @ g m a i l . c o m P h o n e N o : 5 5 - 9 2 - 3 6 4 2 - 3 4 3 5 . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 2 0 4 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 2 7 F e b 2 0 1 2 / A c c e p t e d : 0 9 M a r 2 0 1 2 / P u b l i s h e d : 1 2 A p r 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : C o s t a F M , T a d e i W P . M o r p h o l o g i c a l a l t e r a t i o n s c a u s e d b y D i f l u b e n z u r o n i n A n o p h e l e s d a r l i n g i R o o t ( D i p t e r a , C u l i c i d a e ) . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 2 1 5 - 2 2 1 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h

I N T R O D U C T I O N T h e m o s q u i t o s p e c i e s A n o p h e l e s d a r l i n g i ( R o o t 1 9 2 6 ) i s v e r y i m p o r t a n t i n p u b l i c h e a l t h b e c a u s e i t i s t h e m a i n v e c t o r o f t h e p l a s m o d i a t h a t c a u s e h u m a n m a l a r i a i n B r a z i l . A l t h o u g h i t i s e s s e n t i a l l y a w i l d s p e c i e s , i t p r o l i f e r a t e s r a p i d l y i n e n v i r o n m e n t s t h a t a r e b e i n g a l t e r e d b y m a n t o e x p l o r e n a t u r a l r e s o u r c e s , s u c h a s f o r r o a d o p e n i n g , d a m c o n s t r u c t i o n , a q u a c u l t u r e t a n k s , a m o n g o t h e r s , w h e r e b r e e d i n g g r o u n d s a n d h u m a n b l o o d s o u r c e s a r e a v a i l a b l e ( T a d e i e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h e c o n t r o l o f t h i s v e c t o r i s t h e m a i n m e a s u r e t o p r e v e n t t h e i n c i d e n c e o f h u m a n m a l a r i a . C u r r e n t l y , v e c t o r c o n t r o l h a s b e e n r e s t r i c t e d b a s i c a l l y t o t w o f o r m s : 1 ) B i o l o g i c a l c o n t r o l , b y m e a n s o f e n t o m o p a t h o g e n i c b a c t e r i a o f t h e s p e c i e s B a c i l l u s s p h a e r i c u s ( N e i d e 1 9 0 4 ) , f o r l a r v a l f o r m s , w h i c h i s q u i t e e x p e n s i v e ; 2 ) C h e m i c a l c o n t r o l , w i t h p y r e t h r o i d s , f o r a d u l t f o r m s ( T a d e i , 2 0 0 1 ) , a p p l i e d r e s i d u a l l y o n w a l l s o r s p a c i a l l y b y t h e r m o n e b u l i z a t i o n . I n m o s t p l a c e s , c h e m i c a l c o n t r o l h a s b e e n t h e o n l y c o n t r o l m e a s u r e u n d e r t a k e n . I t i s k n o w n t h a t t h e e x c e s s i v e a n d c o n t i n u o u s u s e o f o n l y o n e c o n t r o l m e a s u r e c o n t r i b u t e s s t r o n g l y t o t r i g g e r r e s i s t a n c e p r o c e s s e s i n p o p u l a t i o n s o f e x p o s e d m o s q u i t o e s . F o r t h i s r e a s o n , c o n s t a n t r e s e a r c h i s n e c e s s a r y a i m i n g a t f i n d i n g n e w c h e m i c a l a g e n t s c a p a b l e o f s a f e l y d e s t r o y i n g p o p u l a t i o n s o f v e c t o r m o s q u i t o e s , b u t i t i s c r u c i a l t o u n d e r s t a n d b e f o r e t h e m o d e o f a c t i o n o f t h o s e a g e n t s a n d t h e r e s p o n s e s o f t h e d i f f e r e n t s p e c i e s e x p o s e d . I n s e c t G r o w t h R e g u l a t o r s ( I G R ) a r e k n o w n a s t h i r d g e n e r a t i o n i n s e c t i c i d e s ( C o n s o l i a n d L o u r e n ç o - d e - O l i v e i r a , 1 9 9 4 ) . T h e y a r e c o m p o u n d s o f h e t e r e g e n e o u s c h e m i c a l n a t u r e w i t h t h e c a p a c i t y t o i n t e r f e r e w i t h c e r t a i n e n z y m e s a n d h o r m o n e s t h a t r e g u l a t e t h e d e v e l o p m e n t o f t h e i m m a t u r e s t a g e s o f i n s e c t s . D i f l u b e n z u r o n i s a n I G R a n d a p o w e r f u l i n h i b i t o r o f c h i t i n s y n t h e s i s t h a t c a u s e s s e v e r e a l t e r a t i o n s i n i n s e c t e c d y s i s ( M u l l a e t a l . , 1 9 7 4 ) . B a s i c a l l y , i t a c t s o n t h e i n t e g u m e n t , l e a d i n g t o c u t i c l e d e f o r m a t i o n s a n d t o t h e i n c a p a c i t y t o d i s c a r d t h e e x u v i a a t e c d y s i s . T h e r e f o r e , i m m a t u r e s t a g e s a r e t h e m o s t s e n s i t i v e t o t h i s i n s e c t i c i d e , b e c a u s e o f t h e i r s u c c e s s i v e e c d y s e s t h a t t h e y u n d e r g o u n t i l r e a c h i n g t h e a d u l t s t a g e ( E i s l e r , 1 9 9 2 ) . A l t h o u g h t h e a c t i o n m o d e o f t h i s c o m p o u n d i s a l r e a d y k n o w n i n s o m e i n s e c t s , t h e r e s p o n s e o f e a c h s p e c i e s i s a n i m p o r t a n t i n f o r m a t i o n c o n t r i b u t i n g t o v e c t o r c o n t r o l p u b l i c p o l i c i e s c o n c e r n i n g t h e l a r v i c i d a l u s e o f D i f l u b e n z u r o n . T h e r e f o r e , t h e o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y w a s t o d e s c r i b e t h e m o r p h o l o g i c a l a l t e r a t i o n s c a u s e d b y D i f l u b e n z u r o n i n l a r v a e , p u p a e , a n d a d u l t s o f A . d a r l i n g i . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S O b t a i n i n g t h e m o s q u i t o e s i n t h e f i e l d a n d r e a r i n g t h e m i n t h e l a b o r a t o r y F e m a l e s o f A . d a r l i n g i w e r e c o l l e c t e d i n t w o l o c a l i t i e s i n t h e p e r i p h e r y o f M a n a u s , A m a z o n a s S t a t e , B r a z i l : P u r a q u e q u a r a ( 3 ° 3 ’ 8 . 6 3 ’ ’ S ; 5 9 ° 5 3 ’ 3 7 . 5 2 ’ ’ W ) a n d B r a s i l e i r i n h o ( 3 º 2 ’ 1 0 . 4 7 ’ ’ S ; 5 9 º 5 2 ’ 1 7 . 2 2 ’ ’ W ) . T h e f e m a l e s w e r e c a p t u r e d w i t h a n e n t o m o l o g i c a l a s p i r a t o r , t h e b a i t b e i n g t h e a u t h o r s w i t h t h e b o d y a d e q u a t e l y p r o t e c t e d b y p e r s o n a l p r o t e c t i v e e q u i p m e n t - P P E . T h e c o l l e c t e d f e m a l e s w e r e k e p t i n 3 5 0 m l c a p a c i t y w a x e d p a p e r c u p s , c o v e r e d w i t h t u l l e . N e x t , t h e y w e r e t a k e n t o t h e l a b o r a t o r y , w h e r e t h e y w e r e f e d d o m e s t i c d u c k b l o o d a n d 1 0 % g l u c o s e s o l u t i o n . U p o n f e e d i n g , t h e y w e r e i n d i v i d u a l l y t r a n s f e r r e d t o p l a s t i c c u p s c o n t a i n i n g m o i s t f i l t e r p a p e r , t h a t s e r v e d a s s u b s t r a t e f o r o v i p o s i t i o n . O n c e t h e e g g s e c l o d e d , t h e l a r v a e w e r e r a i s e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y S c a r p a s s a a n d T a d e i ( 1 9 9 0 ) u n t i l t h e y r e a c h e d t h e o p t i m a l a g e f o r b i o a s s y s . B i o a s s a y s T w o e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d , o n e w i t h l a r v a e a t t h e e n d o f t h e t h i r d s t a g e , a n o t h e r w i t h l a r v a e a t t h e e n d o f t h e f o u r t h s t a g e . E a c h e x p e r i m e n t w a s r e p e a t e d t h r e e t i m e s , e a c h w i t h 2 0 l a r v a e i n c u p s c o n t a i n i n g 5 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e r , f o o d , a n d L C 5 0 = 0 . 0 0 6 p p m D i f l u b e n z u r o n o b t a i n e d p r e v i o u s l y f r o m t h e e x p e r i m e n t s o f C o s t a a n d T a d e i ( 2 0 1 1 ) . I n t h e C o s t a a n d T a d e i , 2 0 1 2 2 1 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 2 1 5 - 2 2 1

e x p e r i m e n t w i t h f o u r t h s t a g e l a r v a e , t h e c u p s w e r e c o v e r e d w i t h t u l l e t o k e e p c o n f i n e d t h e a d u l t s t h a t p o s s i b l y e m e r g e d . B o t h t h e e x p e r i m e n t s w e r e a c c o m p a n i e d b y c o n t r o l g r o u p s t h a t w e r e s u b j e c t e d t o t h e s a m e c o n d i t i o n s , w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e e x p o s u r e t o t h e i n s e c t i c i d e . R e a d i n g s w e r e t a k e n e v e r y h o u r u n t i l 7 2 h o u r s a f t e r t h e b e g i n n i n g o f t h e e x p e r i m e n t , w h e r e t h e b e h a v i o r o f t h e m o s q u i t o e s i n t h e e x p e r i m e n t s w e r e o b s e r v e d , w i t h t h e a d d i t i o n a l a i m o f c o l l e c t i n g i n d i v i d u a l s i m m e d i a t e l y a f t e r d e a t h o r e m e r g e n c e . A l l d e a d i n d i v i d u a l s w e r e f i x e d i n a n a d e q u a t e s o l u t i o n , a n d l a t e r o b s e r v e d w i t h a s t e r e o s c o p i c m i c r o s c o p e a n d p h o t o g r a p h e d w i t h a c o u p l e d d i g i t a l c a m e r a . S o m e a d u l t s w e r e p h o t o g r a p h e d i n t h e e x p e r i m e n t c u p a t t h e m o m e n t o f e m e r g e n c e . E x t e r n a l m o r p h o l o g i c a l a l t e r a t i o n s w e r e o b s e r v e d i n t h e h e a d , t h o r a x , c e p h a l o t h o r a x ( p u p a e ) , a p e n d a g e s ( a d u l t s ) , a n d a b d o m e n o f t h e m o s q u i t o e s , a n d r e c o r d e d i n a n o t e b o o k . R E S U L T S T h i r d s t a g e l a r v a e I n t h e f i r s t 1 8 t o 2 0 h o u r s a f t e r t h e b e g i n n i n g o f t h e e x p e r i m e n t , w e o b s e r v e d t h e e l o n g a t i o n o f t h e c e r v i c a l r e g i o n ( F i g u r e s 1 , A a n d B ) , w h i c h c o n n e c t s t h e c e p h a l i c r e g i o n w i t h t h e t h o r a x . W i t h t h i s e l o n g a t i o n , t h e m u s c l e s h a d a g r e a t e r d i f f i c u l t y t o s u s t a i n t h e w e i g h t o f t h e c e p h a l i c r e g i o n , w h i c h w a s c o n s i d e r a b l y s c l e r o t i z e d . T h e l a r v a k e p t t h e t h o r a x a n d a b d o m e n i n t h e n a t u r a l p o s i t i o n ( p a r a l l e l t o t h e w a t e r c o l u m n ) , b u t h a d d i f f i c u l t i e s t o m a i n t a i n i t s h e a d i n t h i s p o s i t i o n , k e e p i n g i t t u r n e d t o t h e b o t t o m o f t h e c u p . T h e m o u t h p a r t s ’ m o v e m e n t s w e r e n o t i n t e r r u p t e d , a n d t h e l a r v a e k e p t f e e d i n g n o r m a l l y . A l t e r a t i o n s i n t h e s p i r a c u l a r p l a t e o r i n c o l o r b e f o r e o r d u r i n g d e a t h w e r e n o t o b s e r v e d . A p p r o x i m a t e l y 4 0 h o u r s s i n c e e x p o s u r e t o t h e i n s e c t i c i d e , s o m e l a r v a e i n i t i a t e d t h e p r o c e s s o f e c d y s i s . A t t h i s m o m e n t , t h e o p e n i n g o f t h e e c d y s i a l l i n e ( F i g u r e s 1 , B a n d C ) i n t h e h e a d w a s n o r m a l i n a l l t h e i n d i v i d u a l s t h a t d i e d i n t h i s p r o c e s s . T h e r e w a s a g r a d a t i o n i n t h e a t t e m p t t o p e r f o r m t h e a p o l y s i s o f t h e e x u v i a . S o m e l a r v a e d i e d i m m e d i a t e l y i n t h e b e g i n n i n g o f t h e p r o c e s s w i t h t h e o b s t r u c t i o n o f t h e n e w i n t e g u m e n t a n d t i s s u e e x t r a v a s a t i o n , w h i c h p r e v e n t e d t h e m t o e s c a p e f r o m t h e h e a d e x u v i a . I n o t h e r l a r v a e , t h e h e a d e s c a p e w a s o b s e r v e d ; h o w e v e r , t h e y d i e d w i t h t h e e x t r a v a s a t i o n o f t i s s u e s o f t h e t h o r a c i c r e g i o n . I n t h e s e l a t t e r , t h e t h o r a c i c r e g i o n ’ s i n t e g u m e n t w a s q u i t e t h i n a n d m a r k e d l y d i l a t e d . F i n a l l y , a t h i r d e v e n t o c c u r r e d w h e r e t h e l a r v a e w e r e a b l e t o c o m p l e t e t h e a p o l y s i s , b u t t h e t w o l a s t a b d o m i n a l s e g m e n t s r e m a i n e d a t t a c h e d t o t h e e x u v i a . T h e l a r v a e t r i e d t o p e r f o r m s w i m m i n g m o v e m e n t s f r o m t h e s u r f a c e t o t h e b o t t o m o f t h e c u p t o c o m p l e t e t h e a p o l y s i s o f t h e e x u v i a , b u t d i d s o s l o w l y , a n d e v e n t u a l l y d i e d a t t a c h e d t o t h e e x u v i a a t t h e b o t t o m o f t h e c u p . I n t h e c o n t r o l g r o u p , t h e l a r v a e d e v e l o p e d a n d f e d n o r m a l l y u n t i l t h e e n d o f t h e e x p e r i m e n t . C o s t a a n d T a d e i , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 2 1 5 - 2 2 1 2 1 7 F i g u r e 1 . M o r p h o l o g i c a l a l t e r a t i o n s o b s e r v e d i n t h i r d s t a g e l a r v a e o f A n o p h e l e s d a r l i n g i e x p o s e d t o D i f l u b e n z u r o n . A : b e g i n n i n g o f e c d y s i s . D e t a i l o f t h e s y m p t o m o f e l o n g a t i o n o f t h e c e r v i c a l r e g i o n ; B : b e g i n n i n g o f a p o l y s i s o f t h e c e p h a l i c r e g i o n ; C : e x t r a v a s a t i o n o f t i s s u e o f t h e c e p h a l i c r e g i o n . c e : c e r v i x ; e l : e c d y s i a l l i n e ; t e : t i s s u e e x t r a v a s a t i o n .