J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y C h a r a c t e r i z a t i o n o f c a r o t e n o i d p i g m e n t s i n a m p h i b i a n , R h a c o p h o r o u s b i p u n c t a t u s K e y w o r d s : C a r o t e n o i d s , p i g m e n t a t i o n , ß c a r o t e n e , l u t e i n . A B S T R A C T : P i g m e n t a t i o n h a s a t t r a c t e d h u m a n b e i n g s f r o m t i m e i m m e m o r i a l . V a r i o u s p i g m e n t a t i o n s a n d t h e i r o r i e n t a t i o n a r e a m a t t e r o f c u r i o s i t y r e g a r d i n g t h e i r o c c u r r e n c e , m e t a b o l i s m a s w e l l a s f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s . S e v e r a l i s s u e s h a s b e e n d i s c u s s e d a n d r e f e r r e d a s c i t e d b y e a r l i e r w o r k e r s o n t h e d i v e r s i t y o f p i s c i a n a n d a m p h i b i a n s p e c i e s s h o w i n g m a g n i f i c e n t c o l o u r a t i o n , t h e i r c h e m i s t r y , p h y s i o l o g y a s w e l l a s m e t a b o l i c t r a n s f o r m a t i o n a n d m o r e , e s p e c i a l l y o n t h e e x i s t e n c e o f d i f f e r e n t r e t i n o i d m o l e c u l e s . A n i m a l s u s e d i f f e r e n t t y p e s o f p i g m e n t s t o a c q u i r e t h e i r c o l o u r f u l o r n a m e n t s . K n o w i n g t h e t y p e s o f p i g m e n t s t h a t g e n e r a t e a n i m a l c o l o u r s o f t e n p r o v i d e v a l u a b l e i n f o r m a t i o n a b o u t t h e c o s t s o f d e v e l o p i n g b r i g h t c o l o r a t i o n a s w e l l a s t h e b e n e f i t s o f u s i n g t h e s e s i g n a l s i n s o c i a l o r s e x u a l c o n t e x t s . W i t h i n t h e v a r i o u s c l a s s e s o f n a t u r a l p i g m e n t s , t h e c a r o t e n o i d s a r e t h e m o s t w i d e s p r e a d a n d s t r u c t u r a l l y d i v e r s e p i g m e n t i n g a g e n t s . M a n y a n i m a l s u s e c a r o t e n o i d p i g m e n t s t o c o l o u r t h e i r i n t e g u m e n t r e d , o r a n g e , o r y e l l o w ( F o x , 1 9 7 6 ) . C a r o t e n o i d s a r e a f a m i l y o f o v e r 6 0 0 n a t u r a l l i p i d - s o l u b l e p i g m e n t s t h a t a r e p r o d u c e d w i t h i n m i c r o a l g a e , p h y t o p l a n k t o n , a n d h i g h e r p l a n t s . T h u s t o s t u d y t h e c a r o t e n o i d p r o f i l e , R . b i p u n c t a t u s , a s m a l l b r i l l i a n t l y c o l o u r e d t r e e f r o g , w a s s e l e c t e d a n d c o l l e c t e d . T h e c a r o t e n o i d s p r o f i l e f r o m t h e e n t i r e s k i n w a s a n a l y s e d t h r o u g h H P L C . C a r o t e n o i d s s u c h a s a s t a x a n t h i n , β - c a r o t e n e , c r y p t o x a n t h i n , l u t e i n , z e a x a n t h i n w e r e p r e s e n t i n t h e a m p h i b i a n s p e c i e s o f t h e p r e s e n t s t u d y . 1 1 4 - 1 1 8 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 2 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : P i n k y B a r u a h a n d G o s w a m i U C . I n s t i t u t i o n : D e p t . o f Z o o l o g y , G u w a h a t i c o l l e g e G a u h a t i U n i v e r s i t y . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : P i n k y B a r u a h . E m a i l : p i n k y . b a r u a h @ g m a i l . c o m . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 1 9 5 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 3 1 J a n 2 0 1 2 / A c c e p t e d : 0 6 F e b 2 0 1 2 / P u b l i s h e d : 2 0 F e b 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : P i n k y B a r u a h a n d G o s w a i U C . C h a r a c t e r i z a t i o n o f c a r o t e n o i d p i g m e n t s i n a m p h i b i a n , R h a c o p h o r o u s b i p u n c t a t u s . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 1 1 4 - 1 1 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h

I N T R O D U C T I O N M a n y a n i m a l s u s e c a r o t e n o i d p i g m e n t s t o c o l o u r t h e i r i n t e g u m e n t r e d , o r a n g e , o r y e l l o w ( F o x , 1 9 7 6 ) . T h e s e c a r o t e n o i d - b a s e d c o l o u r s a r e o f t e n m o r e p r o n o u n c e d i n m a l e s a n d s e r v e a s i m p o r t a n t s e x u a l l y s e l e c t e d t r a i t s t h a t s i g n a l m a t e q u a l i t y ( O l s o n a n d O w e n s , 1 9 9 8 ; H i l l 1 9 9 9 ; M ø l l e r , e t a l . , 2 0 0 0 ; M c G r a w , H i l l , S t r a d i , P a r k e r , 2 0 0 1 , 2 0 0 2 ) . E v o l u t i o n a r y b i o l o g i s t s h a v e e x p r e s s e d r e c e n t i n t e r e s t i n i d e n t i f y i n g t h e c a r o t e n o i d - d e r i v e d n a t u r e o f a n i m a l c o l o u r s , a s k n o w i n g t h e s p e c i f i c t y p e o f o r n a m e n t a l c o l o u r i s i m p o r t a n t f o r d e t e r m i n i n g t h e s i g n a l l i n g i n f o r m a t i o n c o n t a i n e d w i t h i n s h o w y s e x u a l d i s p l a y s ( O w e n s a n d H a r t l e y , 1 9 9 9 ; M c G r a w a n d H i l l , 2 0 0 0 , 2 0 0 1 ; G r e t h e r , e t a l . , 2 0 0 1 ) . C a r o t e n o i d s a r e p i g m e n t s t h a t a r e f o u n d i n p l a n t s a n d m i c r o - o r g a n i s m s b u t a r e n o t s y n t h e s i z e d i n a n i m a l s . T h e y a r e s y n t h e s i z e d t h r o u g h t h e i s o p r e n o i d p a t h w a y w h i c h a l s o p r o d u c e s s u c h d i v e r s e c o m p o u n d s a s e s s e n t i a l f a t t y a c i d s , s t e r o i d s , s t e r o l s , v i t a m i n s A , D , E , a n d K . W i t h i n t h e v a r i o u s c l a s s e s o f n a t u r a l p i g m e n t s , t h e c a r o t e n o i d s a r e t h e m o s t w i d e s p r e a d a n d s t r u c t u r a l l y d i v e r s e p i g m e n t i n g a g e n t s . T h e y a r e r e s p o n s i b l e , i n c o m b i n a t i o n w i t h p r o t e i n s , f o r m a n y o f t h e b r i l l i a n t y e l l o w t o r e d c o l o u r s i n p l a n t s a n d t h e w i d e r a n g e o f b l u e , g r e e n , p u r p l e , b r o w n a n d r e d d i s h c o l o u r s o f f i s h a n d c r u s t a c e a n s . T h u s , b i o c h e m i c a l t e s t s a r e n e e d e d t o u n e q u i v o c a l l y i d e n t i f y p i g m e n t s a s c a r o t e n o i d s i n a n i m a l t i s s u e s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S C o l l e c t i o n o f s p e c i m e n : R h a c o p h o r u s b i p u n c t a t u s w e r e c o l l e c t e d f r o m M i z o r a m . T h e s p e c i m e n s w e r e b r o u g h t l i v e i n g l a s s b o t t l e s w i t h p e r f o r a t e d l i d s . S o l v e n t s a n d c h e m i c a l s : L i g h t p e t r o l e u m e t h e r ( b . p . 4 0 - 6 0 o C ) , D i e t h y l e t h e r , C h l o r o f o r m , A b s o l u t e e t h a n o l , A n h y d r o u s s o d i u m s u l p h a t e , A l u m i n i u m o x i d e a c t i v e n e u t r a l L R f o r c h r o m a t o g r a p h i c a b s o r p t i o n a n a l y s i s , w e r e p r o c u r e d f r o m B D H , L a b o r a t o r y C h e m i c a l s D i v i s i o n , G l a x o L a b o r a t o r i e s ( I n d i a ) P v t . L t d . A l u m i n a w a s d e a c t i v a t e d , p r i o r t o u s e , b y a d d i n g t h e r e q u i s i t e a m o u n t o f w a t e r ( u s u a l l y 5 - 8 % v / w ) i n a g l a s s m o r t a r . I t w a s t h e n m i x e d t h o r o u g h l y . D i f f e r e n t a u t h e n t i c r e t i n o i d s s a m p l e s , s u c h a s r e t i n o l , d e h y d r o r e t i n o l , r e t i n y l p r o p i o n a t e β - c a r o t e n e , l u t e i n , c r y p t o x a n t h i n , a s t a x a n t h i n , β - a p o c a r o t e n a l s a n d C A E E s a m p l e s w e r e s u p p l i e d b y F . H o f f m a n L a R o c h e , B a s e l , S w i t z e r l a n d . U V - v i s s p e c t r u m : T h e U V - v i s i b l e s p e c t r a w e r e r e c o r d e d i n a B e c k m a n D K - 2 s p e c t r o p h o t o m e t e r . β - c a r o t e n e , l u t e i n , a n h y d r o l u t e i n a n d 3 - d e h y d r o r e t i n o l w e r e a s s a y e d o n t h e b a s i s o f t h e f o l l o w i n g E 1 % / 1 c m v a l u e s : 2 5 0 0 , 2 2 0 0 , 2 0 3 1 a n d 1 4 5 5 r e s p e c t i v e l y ( a l l a t t h e p o i n t o f m a x i m u m a b s o r p t i o n ) . T h e c a r o t e n o i d s e x t r a c t e d w e r e e s t i m a t e d u s i n g H P L C t e c h n i q u e . T h e H P L C s y s t e m i n c l u d e s ( w a t e r ) w i t h c o l u m n 3 0 0 m m × 3 . 9 m m N o v a - P a k C 1 8 ( 4 m m ) a n d a G u a r d - P a k p r e c o l u m n m o d u l e ( w a t e r 5 ) w e r e u s e d . S t a n d a r d r e t i n o i d s s a m p l e s ( 5 . 0 m g ) w e r e d i s s o l v e d i n 1 0 0 m l t o l u n e : m e t h a n o l . S t a n d a r d r e t i n o i d s s a m p l e s ( 5 . 0 m g ) w e r e d i s s o l v e d i n 1 0 0 m l t o l u n e : m e t h a n o l ( 1 : 1 ) c o n t a i n i n g 5 0 0 m g B H T ( b u t y l a t e d h y d r o x y t o l u n e ) / l i t r e f o r p r o d u c i n g 5 0 m / m l s t a n d a r d s . T h e s e s t a n d a r d s t o c k s o l u t i o n s c o u l d b e p r e s e r v e d a t - 2 0 ° C f o r 4 m o n t h s . H P L C g r a d e s o l v e n t s , a c e t o n i t r i l e : d i c h l o r o m e t h a n e : m e t h a n o l : w a t e r : p r o p i o n i c a c i d ( 7 1 : 2 2 : 4 : 2 : 1 , v / v ) w e r e u s e d a s m o b i l e p h a s e w i t h t h e f l o w r a t e o f 1 . 0 m l / m i n u t e i n t h e f i r s t 1 0 m i n u t e r u n , d e t e c t i o n o f c a r o t e n o i d p i g m e n t s w a s p e r f o r m e d a t 4 5 0 n m a n d r e t i n o l i n 3 5 2 a n d 3 2 6 n m . R E S U L T S R . b i p u n c t a t u s i s a s m a l l t r e e f r o g w i t h a p o i n t e d s n o u t a n d b o d y l e n g t h o f a b o u t 3 7 - 6 0 m m w h e n a d u l t , f e m a l e s b e i n g l a r g e r t h a n m a l e s . I t s b a c k i s i n t e n s e l y g r e e n t o v i o l e t - b r o w n i n l i v i n g a n i m a l s . T h e a r m s a n d B a r u a h e t a l . , 2 0 1 2 1 1 5 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 1 1 4 - 1 1 8

l e g s h a v e v e r y f a i n t d a r k e r b a n d s . T h e s i d e s , b e l l y a n d t o e s a r e b r i l l i a n t y e l l o w . B e h i n d t h e a r m s , t h e r e i s a l m o s t a l w a y s a c o n s p i c u o u s l a r g e b l a c k s p o t o n t h e f l a n k s ; t o w a r d s t h e h i n d l e g s t h e r e m a y b e a n o t h e r o n e o r t w o s u c h s p o t s , b u t v e r y r a r e l y t h e f l a n k s p o t s a r e e n t i r e l y a b s e n t . T h e w e l l - d e v e l o p e d w e b b i n g o f t h e t o e s i s b r i g h t o r a n g e - r e d a n d u n s p o t t e d . T h e e y e s a r e d u l l g r e e n , s o m e t i m e s w i t h a y e l l o w r i m . E x t r a c t i o n a n d e s t i m a t i o n o f c a r o t e n o i d s f r o m R h a c o p h o r o u s b i p u n c t a t u s T h e c a r o t e n o i d s p i g m e n t s a r e e x t r a c t e d f r o m t h e d o r s a l a n d v e n t r a l s k i n s e p a r a t e l y . T h e p i g m e n t s c o n t a i n i n g t h e l i p i d s w e r e e x t r a c t e d f r o m f r e s h l y k i l l e d s p e c i m e n . T h e s k i n s w e r e g r o u n d e d w i t h a n h y d r o u s s o d i u m s u l p h a t e s e p a r a t e l y . L i p i d s o l v e n t s s u c h a s a c e t o n e , l i g h t p e t r o l e u m , b e n z e n e , d i e t h y l e t h e r , e t c . w e r e u s e d f o r t h e e x t r a c t i o n o f v a r i o u s p i g m e n t s . T h e e x t r a c t i o n s c o n t a i n i n g t h e c a r o t e n o i d s w e r e p o o l e d t o g e t h e r a n d e v a p o r a t e d a n d w e r e e s t i m a t e d f r o m t h e i r U V - v i s i b l e a b s o r p t i o n m a x i m a a n d f r o m t h e E 1 % / 1 c m v a l u e o f t h e r e s p e c t i v e c o m p o u n d s . T h e e s t e r s w e r e s a p o n i f i e d w i t h m e t h a n o l i c K O H ( 1 0 % ) u n d e r r e f l u x e d c o n d i t i o n s a n d w e r e l a t e r e x t r a c t e d w i t h l i g h t p e t r o l e u m ( 4 0 - 6 0 0 C ) . A l k a l i w a s r e m o v e d a f t e r 5 - 7 w a s h i n g s w i t h d i s t i l l e d w a t e r . I t w a s a g a i n e x t r a c t e d w i t h l i g h t p e t r o l e u m 4 0 - 6 0 0 C a n d d r i e d o v e r a n h y d r o u s N a 2 S O 4 a n d m e a s u r e d f o r a l c o h o l i c f o r m . T h e d i f f e r e n t c a r o t e n o i d s a n d v i t a m i n A a n a l o g u e s w e r e e s t i m a t e d . T h e a u t h e n t i c c a r o t e n o i d s s a m p l e s w e r e p r e p a r e d a n d a s t a n d a r d H P L C c h r o m a t o g r a m f o r e a c h c a r o t e n o i d w a s s t a n d a r d i z e d a s s h o w n i n t h e F i g u r e 1 . T h e d e t a i l s o f t h e s o l v e n t s u s e d a n d t h e e l u t i o n p r o f i l e s h a v e b e e n d e s c r i b e d e a r l i e r . C a r o t e n o i d s p r o f i l e s i n a d u l t R h a c o p h o r o u s b i p u n c t a t u s : T h e m a g n i f i c e n t m u l t i c o l o r e d s k i n o f R h a c o p h o r o u s b i p u n c t a t u s i s o f g r e a t a t t r a c t i o n f o r n a t u r a l i s t s . T h e g r e e n c o l o u r e d d o r s a l s k i n s a n d y e l l o w v e n t r a l s k i n s g i v e r i s e t o s e v e r a l q u e s t i o n s o n t h e m o d e o f d e p o s i t i o n o f c a r o t e n o i d s a s w e l l a s i t s m e t a b o l i s m . I n t h e p r e s e n t s t u d i e s 2 s a m p l e s ( 2 5 , 2 8 g w t . , m a l e s ) w e r e c o l l e c t e d f r o m M i z o r a m a n d b o t h d o r s a l a s w e l l a s v e n t r a l r e g i o n s w e r e d i s s e c t e d o u t a n d t h e i r l i p i d c o n t e n t s w e r e e x t r a c t e d a s d e s c r i b e d . T h e c a r o t e n o i d s p r o f i l e a n d t h e c h r o m a t o g r a m s h a v e b e e n s h o w n t h e T a b l e 1 , a n d i n f i g u r e s ( F i g . 2 a n d 3 ) . D I S C U S S I O N S I n a m p h i b i a n s , c a r o t e n o i d s ( i n c l u d i n g b o t h β - c a r o t e n e a n d l u t e i n ) a r e w i d e l y d i s t r i b u t e d i n t h e b o d y . T h e a m p h i b i a n s p e c i e s c a n b e s t u d i e d t h r o u g h t h e l i f e c y c l e , a s e m b r y o s , a s t a d p o l e s a n d a s i m m a t u r e a n d m a t u r e f r o g s ; t h e r e i s a m a r k e d s e a s o n a l c y c l e i n b o t h B a r u a h e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 1 1 4 - 1 1 8 1 1 6 F i g . 1 : C h r o m a t o g r a m o f t h e s t a n d a r d c a r o t e n o i d s ( 2 . 0 µ g . m l - l ) . L i s t o f c a r o t e n o i d s f r o m i n v e s t i g a t e d s p e c i m e n s : ( 1 ) A s t a x a n t h i n ; ( 2 ) I s o z e a x a n t h i n ; ( 3 ) P h o e n i c o x a n t h i n ; ( 4 ) Z e a x a n t h i n ; ( 5 ) C A E E ; ( 6 ) C r y p t o x a n t h i n ; L u t e i n ; ( 8 ) E c h i n e n o n e ; ( 9 ) α - c a r o t e n e ; ( 1 0 ) β - c a r o t e n e . C a r o t e n o i d s D o r s a l s k i n s V e n t r a l s k i n s A m o u n t ( µ g / 1 0 0 g ) A m o u n t ( µ g / 1 0 0 g ) A s t a x a n t h i n 3 5 ± 2 . 5 2 5 ± 1 . 5 β - c a r o t e n e 6 0 ± 1 . 5 4 0 ± 0 . 5 C r y p t o x a n t h i n 6 5 ± 3 . 5 7 0 ± 0 . 5 L u t e i n 7 5 ± 5 . 5 7 8 ± 0 . 5 Z e a x a n t h i n 5 5 ± 2 . 5 3 0 ± 1 . 5 O t h e r s 1 1 0 ± 1 0 . 5 8 5 ± 0 . 5 C A E E 9 7 ± 1 . 5 9 4 ± 1 . 5 T a b l e 1 : C a r o t e n o i d s p r o f i l e s ( µ g / 1 0 0 g ) o f s k i n s o f R h a c o p h o r o u s b i p u n c t a t u s . T h e v a l u e s a r e t h e m e a n o f 2 s a m p l e s a r e g i v e n i n t h e t a b l e .