J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y G r o w t h r e s p o n s e s o f p e t r o l e u m r e f i n e r y e f f l u e n t b a c t e r i a t o p h e n o l K e y w o r d s : G r o w t h r e s p o n s e s , p h e n o l - u t i l i z i n g b a c t e r i a , r e f i n e r y e f f l u e n t . A B S T R A C T : S t u d i e s o f t h e f u n g a l a n d b a c t e r i a l p o p u l a t i o n o f p e t r o l e u m r e f i n e r y e f f l u e n t s a m p l e s w e r e c a r r i e d o u t b y m i c r o b i a l e n u m e r a t i o n a n d d e t e r m i n a t i o n o f g r o w t h r e s p o n s e s o f b a c t e r i a l i s o l a t e s i n i n c r e a s i n g d o s e s ( 0 - 1 5 m M ) o f p h e n o l i n m i n e r a l s a l t - p h e n o l a g a r . T h e t o t a l a e r o b i c h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a l c o u n t r a n g e d f r o m ( 2 . 0 5 ± 0 . 4 ) x 1 0 7 t o ( 2 . 5 2 ± 0 . 5 ) x 1 0 8 C F U / m l , t o t a l p h e n o l - u t i l i z i n g b a c t e r i a r a n g e d f r o m ( 1 . 1 8 ± 0 . 3 ) x 1 0 6 t o ( 1 . 0 2 ± 0 . 3 ) x 1 0 7 C F U / m l a n d t h e t o t a l f u n g a l c o u n t r a n g e d f r o m ( 3 . 1 ± 1 . 3 ) x 1 0 3 t o ( 3 . 9 ± 0 . 5 ) x 1 0 4 C F U / m l i n t h e e f f l u e n t s a m p l e s . B a c i l l u s s p . R W W , A e r o m o n a s s p . R B D , E s c h e r i c h i a c o l i O P W W a n d S t a p h y l o c o c c u s s p . D P w e r e i s o l a t e d f r o m t h e s a m p l e s . G r o w t h r e s p o n s e s o f t h e i s o l a t e s o n i n c r e a s i n g d o s e s o f p h e n o l i n m i n e r a l s a l t - p h e n o l a g a r s h o w e d t h a t B a c i l l u s s p . R W W a n d E s c h e r i c h i a c o l i O P W W h a d h i g h e s t g r o w t h o n 0 . 5 m M ( 4 7 . 0 6 m g / l ) w h i l e A e r o m o n a s s p . R B D a n d S t a p h y l o c o c c u s s p . D P h a d t h e i r h i g h e s t g r o w t h o n 1 . 0 m M ( 9 4 . 1 1 m g / l ) . B a c i l l u s s p . R W W a n d E s c h e r i c h i a c o l i O P W W s h o w e d l e a s t g r o w t h o n 1 5 . 0 m M ( 1 , 4 1 2 m g / m l ) o f p h e n o l . E s c h e r i c h i a c o l i O P W W e x h i b i t e d h i g h e s t g r o w t h i n m i n e r a l s a l t b r o t h c o n t a i n i n g 1 1 . 0 m M o f p h e n o l w i t h O D 5 4 0 n m o f 0 . 3 2 4 i n 1 4 4 h r e s u l t i n g i n t h e f a s t e s t u t i l i z a t i o n o f p h e n o l f o r g r o w t h . T h e h i g h e s t s p e c i f i c g r o w t h r a t e o f 0 . 0 1 3 h - 1 a t 1 1 m M ( 1 , 0 3 5 m g / l ) o f p h e n o l w a s o b t a i n e d f o r B a c i l l u s s p . R W W a n d E s c h e r i c h i a c o l i . S t a p h y l o c o c c u s s p . D P h a d t h e l o w e s t s p e c i f i c g r o w t h r a t e o f 0 . 0 1 1 h - 1 a t 1 1 m M o f p h e n o l . T h e s e b a c t e r i a l s t r a i n s c o u l d b e c o n s i d e r e d p h e n o l - r e s i s t a n t a n d a r e p o t e n t i a l l y a p p l i c a b l e i n t h e r e m o v a l o f p h e n o l i c c o m p o u n d s f r o m c o n t a m i n a t e d e n v i r o n m e n t a l m e d i a . 1 6 7 - 1 7 7 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 3 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : N w a n y a n w u C E , N w e k e C O a n d O r j i J C . I n s t i t u t i o n : D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , F e d e r a l U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y , P . M . B . 1 5 2 6 , O w e r r i , N i g e r i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : N w a n y a n w u C E E m a i l : c n w a n y a n w u 2 0 0 0 @ y a h o o . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 1 8 5 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 9 J a n 2 0 1 2 / A c c e p t e d : 1 8 J a n 2 0 1 2 / P u b l i s h e d : 1 3 M a r 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : N w a n y a n w u C E , N w e k e C O a n d O r j i J C . G r o w t h r e s p o n s e s o f p e t r o l e u m r e f i n e r y e f f l u e n t b a c t e r i a t o p h e n o l . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 6 7 - 1 7 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h

I N T R O D U C T I O N T h e u t i l i z a t i o n o f c h e m i c a l s a s c a r b o n o r e n e r g y s o u r c e s b y l i v i n g c e l l s i s b a s i c t o a l l f o r m s o f l i f e . A d a p t a t i o n o f l i v i n g c e l l s o v e r t h e c e n t u r i e s t o c o n s u m e t h e n a t u r a l b i o c h e m i c a l s f o u n d o n e a r t h i s t h e g e n e r a l l y a c c e p t e d n a r r a t i v e , b u t t h e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t o r g a n i c s p e c i e s w h i c h a r e p r o d u c e d b y m a n h a v e l e d t o e n v i r o n m e n t a l p r o b l e m s d u e t o t h e r e s i s t a n c e o r c o m p l e t e r e c a l c i t r a n c e t o m i n e r a l i z a t i o n b y a n y l i v i n g s p e c i e s ( H i l l e t a l , 1 9 9 6 ; K h l e i f a t , 2 0 0 6 ) . P h e n o l a n d i t s d e r i v a t i v e s a r e c o m m o n c o n s t i t u e n t s o f i n d u s t r i a l e f f l u e n t s s u c h a s p h a r m a c e u t i c a l , i n d u s t r i a l r e s i n m a n u f a c t u r i n g , p h a r m a c e u t i c a l i n d u s t r i e s , p l a s t i c , c o k e o v e n p l a n t s , p e t r o c h e m i c a l a n d p e t r o l e u m r e f i n e r i e s ( C h a r e s t e t a l . , 1 9 9 9 ; R u i z - O r d a z e t a l . , 2 0 0 1 ; J i n d r o v a e t a l . , 2 0 0 2 ; R i g o a n d A l e g r e , 2 0 0 4 ) . P h e n o l i s t o x i c t o a l l f o r m s o f l i f e e v e n a t l o w c o n c e n t r a t i o n s a n d c a u s e s t a s t e a n d o d o u r p r o b l e m s i n d r i n k i n g w a t e r ( B o s z c z y k - M a l e s z a k e t a l . , 2 0 0 2 ; M o n k i e d j e e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e t o x i c a c t i o n o f p h e n o l i s a l w a y s a s s o c i a t e d w i t h t h e l o s s o f c y t o p l a s m i c m e m b r a n e i n t e g r i t y . A s a r e s u l t o f p h e n o l m e m b r a n e - d a m a g i n g p r o p e r t i e s o n m i c r o o r g a n i s m s , c y t o p l a s m i c m e m b r a n e i n t e g r i t y i s l o s t w h i c h i n t u r n r e s u l t s i n t h e d i s r u p t i o n o f e n e r g y t r a n s d u c t i o n , d i s t u r b a n c e o f m e m b r a n e b a r r i e r f u n c t i o n , i n h i b i t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n f u n c t i o n a n d s u b s e q u e n t c e l l d e a t h ( K e w e l o e t a l . , 1 9 9 0 ; H e i p i e p e r e t a l . , 1 9 9 1 ; Y a p e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e h i g h - v o l u m e u s e o f p h e n o l s w o r l d w i d e a n d t h e i r p o t e n t i a l t o x i c i t y h a s l e d t o t h e i n c l u s i o n o f p h e n o l s o n t h e l i s t o f p r i o r i t y p o l l u t a n t s ( V e e r e s h e t a l . , 2 0 0 5 ) . O w i n g t o t h e i m p o r t a n c e o f m i c r o b i a l a c t i v i t i e s i n b i o g e o c h e m i c a l c y c l i n g , s e v e r a l b i o l o g i c a l p a r a m e t e r s h a v e b e e n u s e d t o e v a l u a t e t h e t o x i c e f f e c t o f p h e n o l o n b a c t e r i a l p o p u l a t i o n w h i c h i n c l u d e s c h a n g e s i n c e l l n u m b e r s , b i o m a s s m e a s u r e m e n t , s p e c i f i c a n d n o n s p e c i f i c e n z y m a t i c a c t i v i t i e s ( K u o a n d G e n t h n e r , 1 9 9 6 ; N w a n y a n w u a n d A b u , 2 0 1 0 , N w e k e a n d O k p o k w a s i l i , 2 0 1 0 a , b ; 2 0 1 1 ) . I n d u s t r i a l e f f l u e n t d i s c h a r g e s h a v e l e d t o t h e p o l l u t i o n o f a q u a t i c a n d t e r r e s t r i a l e n v i r o n m e n t s o v e r t h e y e a r s . M a n y m e s o p h i l i c m i c r o b i a l s p e c i e s h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n t h e d e g r a d a t i o n o f p h e n o l l e a d i n g t o a s u c c e s s f u l b i o r e m e d i a t i o n o f p h e n o l - c o n t a m i n a t e d e n v i r o n m e n t s . I m p r o v e m e n t o f m i c r o b i a l e f f i c i e n c y h a s b e e n d i r e c t e d t o w a r d s t h e u t i l i z a t i o n o f m i c r o b i a l s e e d i n g a s a m e a n s o f c o n t r o l l i n g i n d u s t r i a l e f f l u e n t d i s c h a r g e s ( I d i s e e t a l . , 2 0 1 0 ) . B i o d e g r a d a t i o n e n a b l e s o r g a n i c p o l l u t a n t s t o b e c o n v e r t e d f r o m h a r m f u l o r g a n i c s u b s t a n c e s i n t o h a r m l e s s i n o r g a n i c s u b s t a n c e s . T h e a b i l i t y o f m i c r o o r g a n i s m s t o d e g r a d e p h e n o l a n d t h e r a t e o f p h e n o l d e g r a d a t i o n i s g o v e r n e d b y c e r t a i n f a c t o r s s u c h a s o x y g e n t e n s i o n , t e m p e r a t u r e , p H , a n d m i c r o b i a l a b u n d a n c e a s w e l l a s n u t r i e n t a v a i l a b i l i t y ( Z h a o a n d Z h u , 1 9 9 7 ) . T h e t y p e a n d n u m b e r o f m i c r o b i a l s p e c i e s i n v o l v e d i n d e g r a d a t i o n m a y i n f l u e n c e t h e r a t e a n d e x t e n t o f t h e p r o c e s s ( A t l a s , 1 9 8 1 ; L e a h y a n d C o l w e l l , 1 9 9 0 ) . D e s p i t e t h e p r e s e n c e o f m i c r o o r g a n i s m s c a p a b l e o f d e g r a d i n g t h e a r o m a t i c c o m p o u n d s , t h e c o n c e n t r a t i o n a n d t y p e o f t h e p o l l u t a n t l i m i t t h e b i o d e g r a d a t i o n o f t h e i n h e r e n t c o m p o u n d s . I f t h e o r g a n i c p o l l u t a n t i s n o t a v a i l a b l e t o t h e m i c r o o r g a n i s m s a n d t h e a p p r o p r i a t e e n z y m e s d o n o t c o m e i n c o n t a c t w i t h t h e s u b s t r a t e i n t h e p r o p e r w a y , d e g r a d a t i o n w i l l n o t o c c u r ( A t l a s , 1 9 8 1 ) . B i o d e g r a d a t i o n o f p h e n o l a n d o t h e r p o l l u t a n t s i n t h e n a t u r a l e c o s y s t e m t h o u g h c o m p l e x h a s g r e a t l y e n h a n c e d t h e r e m o v a l o f h a r m f u l i o n s a n d s o l i d s f r o m t h e e n v i r o n m e n t b y t r a n s f o r m a t i o n i n t o r e a d i l y u s a b l e a n d l e s s / n o n t o x i c m a t e r i a l s b y m i c r o o r g a n i s m s ( T a n a k a e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h i s r e s e a r c h e v a l u a t e d t h e g r o w t h r e s p o n s e s o f b a c t e r i a i s o l a t e d f r o m p e t r o l e u m r e f i n e r y w a s t e w a t e r s t o v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f p h e n o l . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S S a m p l e c o l l e c t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n P h y s i c o c h e m i c a l l y t r e a t e d r a w e f f l u e n t ( a d d i t i o n o f a d d i t i v e s , f l o c c u l a t i o n , s e d i m e n t a t i o n a n d f i l t r a t i o n ) ( R W W ) , b i o l o g i c a l l y t r e a t e d e f f l u e n t [ R o t a r y B i o D i s k , N w a n y a n w u e t a l . , 2 0 1 2 1 6 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 6 7 - 1 7 7

( R B D ) ] , o b s e r v a t i o n p o n d t r e a t e d e f f l u e n t [ O x i d a t i o n p o n d , ( O P W W ) ] a n d D i s c h a r g e P i p e e f f l u e n t ( D P ) s a m p l e s o f P o r t H a r c o u r t p e t r o l e u m r e f i n e r y w e r e c o l l e c t e d i n s t e r i l e p o l y e t h y l e n e c o n t a i n e r s . T h e c o n t a i n e r s w e r e r i n s e d t h r i c e w i t h t h e e f f l u e n t s a m p l e s a t t h e p o i n t o f c o l l e c t i o n . T o a v o i d d e t e r i o r a t i o n , t h e s a m p l e s w e r e t a k e n t o t h e l a b o r a t o r y i n i c e b o x w i t h i n s i x h o u r s o f c o l l e c t i o n f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f p H , T o t a l H y d r o c a r b o n ( T H C ) , e l e c t r i c a l c o n d u c t i v i t y , B i o l o g i c a l O x y g e n D e m a n d ( B O D ) , C h e m i c a l O x y g e n D e m a n d ( C O D ) , P h o s p h a t e ( P O 4 ) , S u l p h a t e ( S O 4 ) , p h e n o l ( C 6 H 5 O H ) , L e a d ( P b ) , Z i n c ( Z n ) , a n d C o p p e r ( C u ) f o l l o w i n g s t a n d a r d p r o c e d u r e s ( A P H A , 1 9 8 5 ) . E n u m e r a t i o n o f m i c r o o r g a n i s m s A e r o b i c h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a , p h e n o l - u t i l i z i n g b a c t e r i a a n d f u n g a l p o p u l a t i o n s i n t h e s a m p l e s w e r e e n u m e r a t e d o n n u t r i e n t a g a r , m i n e r a l s a l t - p h e n o l a g a r ( H i l l a n d R o b i n s o n , 1 9 7 5 ) a n d p o t a t o d e x t r o s e a g a r p l a t e s r e s p e c t i v e l y . I n e a c h m e d i u m , 0 . 1 m l a l i q u o t o f s a m p l e d i l u t i o n s w e r e s p r e a d - i n o c u l a t e d o n t o t h e a g a r s u r f a c e a n d i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 8 ± 2 o C ) f o r 2 4 , 7 2 a n d 1 2 0 h f o r a e r o b i c h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a , p h e n o l - u t i l i z i n g b a c t e r i a a n d f u n g i r e s p e c t i v e l y . T h e d i s c r e t e b a c t e r i a l c o l o n i e s t h a t g r e w p r o f u s e l y o n t h e m i n e r a l s a l t - p h e n o l a g a r r e p r e s e n t i n g t h e p r e p o n d e r a n t m o r p h o t y p e s i n t h e i r r e s p e c t i v e s o u r c e s w e r e p u r i f i e d o n f r e s h l y p r e p a r e d n u t r i e n t a g a r ( L a b M ) a n d s t o r e d i n n u t r i e n t a g a r s l a n t a t 4 o C . C h a r a c t e r i z a t i o n s o f p h e n o l - u t i l i z i n g b a c t e r i a w e r e d o n e u s i n g s t a n d a r d m i c r o b i o l o g i c a l m e t h o d s . I d e n t i f i c a t i o n t o t h e g e n u s l e v e l f o l l o w e d t h e s c h e m e s o f H o l t e t a l ( 1 9 9 4 ) . T h e i s o l a t e s w e r e d e s i g n a t e d a c c o r d i n g t o t h e i r s o u r c e s ( R W W f o r R a w W a s t e W a t e r , R B D f o r R o t a r y B i o D i s k , O P W W f o r O b s e r v a t i o n W a s t e W a t e r a n d D P f o r D i s c h a r g e P i p e ) . P r e p a r a t i o n o f i n o c u l u m a n d c u l t u r e c o n d i t i o n T h e p h e n o l - u t i l i z i n g b a c t e r i a l s t r a i n s u s e d f o r t h e a s s a y w e r e g r o w n i n 1 0 0 m l o f s t e r i l e n u t r i e n t b r o t h m e d i a ( H I M E D I A ) c o n t a i n e d i n 2 5 0 m l E r l e n m e y e r f l a s k s . T h e f l a s k s w e r e i n c u b a t e d o n a r o t a r y s h a k e r i n c u b a t o r o p e r a t i n g a t 1 5 0 r p m f o r 2 4 h a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 8 ± 2 o C ) . C e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 4 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n u t e s . H a r v e s t e d c e l l s w e r e w a s h e d t w i c e i n s t e r i l e d e i o n i z e d d i s t i l l e d w a t e r a n d r e s u s p e n d e d i n t h e s a m e m e d i u m . T h e c e l l s u s p e n s i o n s w e r e s t a n d a r d i z e d i n a s p e c t r o p h o t o m e t e r t o a n o p t i c a l d e n s i t y o f 0 . 5 a t 5 4 0 n m . A s s a y f o r t h e e f f e c t o f p h e n o l o n t h e g r o w t h o f b a c t e r i a i n B H a g a r T h e p h e n o l - u t i l i z i n g b a c t e r i a l i s o l a t e s w e r e u s e d f o r t h i s a s s a y . A l i q u o t s o f s t o c k s o l u t i o n o f p h e n o l ( 2 0 m M ) w e r e d i l u t e d w i t h B u s h n e l l a n d H a a s ( B H ) b r o t h m e d i u m ( c o n t a i n i n g p e r l i t r e : K 2 H P O 4 , 1 . 0 g ; K H 2 P O 4 , 1 . 0 g ; N H 4 N O 3 , 1 . 0 g ; M g S O 4 . 7 H 2 O , 0 . 2 ; C a C l 2 . 2 H 2 O , 0 . 0 2 ; F e C l 3 . 6 H 2 O , 0 . 0 8 5 g ) i n 2 5 0 m l E r l e n m e y e r f l a s k s t o o b t a i n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f p h e n o l ( 0 - 1 5 m M ) . T h i s w a s f o l l o w e d b y t h e a d d i t i o n o f 2 % a g a r i n t o t h e f l a s k s . T h e f l a s k s w e r e s t e r i l i z e d b y a u t o c l a v i n g a t 1 2 1 o C f o r 1 5 m i n a f t e r w h i c h t h e c o n t e n t s w e r e p o u r e d i n t o s t e r i l e p l a t e s s e t u p i n t r i p l i c a t e s . T h e p l a t e s w e r e a l l o w e d t o s o l i d i f y a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d w e r e , t h e n d r i e d i n t h e o v e n a t a t e m p e r a t u r e o f 8 0 0 C . C o n t r o l f l a s k s t h a t r e c e i v e d t h e s a m e t r e a t m e n t e x c e p t p h e n o l w a s s e t u p . A n a l i q u o t ( 0 . 1 m l ) o f t h e s t a n d a r d i z e d i n o c u l u m d e c i m a l l y d i l u t e d i n p h y s i o l o g i c a l s a l i n e ( 0 . 8 5 % w / v N a C l ) w e r e s p r e a d o n t h e a g a r s u r f a c e . A l l i n o c u l a t e d , p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a e r o b i c a l l y a t 2 8 ± 2 0 C f o r 7 2 h , a f t e r w h i c h c o l o n i e s w e r e c o u n t e d . G r o w t h a n d p h e n o l u t i l i z a t i o n a s s a y L i q u i d c u l t u r e s w e r e c o n d u c t e d i n o r d e r t o e x a m i n e m o r e p a r a m e t e r s s u c h a s p h e n o l c o n c e n t r a t i o n a n d g r o w t h o f t h e b a c t e r i a l s t r a i n s . H u n d r e d m i l l i l i t r e ( 1 0 0 m l ) o f B H m e d i u m w a s p l a c e d i n a d u p l i c a t e s e t o f 2 5 0 m l E r l e n m e y e r f l a s k s . T h e f l a s k s w e r e s u p p l e m e n t e d w i t h a l i q u o t o f p h e n o l ( 2 0 m M ) t o b r i n g t h e f i n a l p h e n o l c o n c e n t r a t i o n s i n t h e f l a s k s t o 2 , 5 , 8 a n d 1 1 m M . T h e f l a s k s w e r e s t e r i l i z e d b y a u t o c l a v i n g , i n o c u l a t e d w i t h t h e t e s t o r g a n i s m s u p o n c o o l i n g a n d i n c u b a t e d a t 3 0 o C i n a n N w a n y a n w u e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 6 7 - 1 7 7 1 6 9

i n c u b a t o r . A t s p e c i f i c t i m e , s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n t o d e t e r m i n e c e l l g r o w t h a n d r e m a i n i n g p h e n o l . C o n t r o l s i n c l u d e d c e l l s i n B H m e d i u m w i t h o u t p h e n o l a n d t h e m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h p h e n o l b u t w i t h o u t c e l l s . T h i s i s t o a s s e s s f o r e n d o g e n o u s r e s p i r a t i o n o f t h e c u l t u r e s a s w e l l a s t o m e a s u r e a b i o t i c l o s s o f p h e n o l d u r i n g t h e t e s t p e r i o d . A t s p e c i f i c i n t e r v a l s o f t i m e s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d a n d m e a s u r e d f o r c e l l g r o w t h a n d p h e n o l d e g r a d a t i o n . T h e c e l l g r o w t h w a s d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e O p t i c a l D e n s i t y ( O D ) a t 5 4 0 n m u s i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r . T h e c o n c e n t r a t i o n o f p h e n o l i n t h e m e d i u m w a s d e t e r m i n e d b y t h e m e t h o d o f F o l s o m e t a l . ( 1 9 9 0 ) . F o r e a c h i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f p h e n o l , s p e c i f i c g r o w t h r a t e ( µ , h - 1 ) w a s e s t i m a t e d u s i n g e q u a t i o n 1 . W h e r e X 1 a n d X 2 a r e t h e c e l l b i o m a s s ( c e l l d e n s i t y ) o b t a i n e d a t t i m e t 1 a n d t 2 . P h e n o l d e g r a d a t i o n r a t e ( Q s , m g / l . h ) w a s d e t e r m i n e d f r o m t h e m a x i m u m s l o p e i n p l o t o f p h e n o l c o n c e n t r a t i o n ( m g / l ) v e r s u s t i m e o f i n c u b a t i o n a s d e s c r i b e d b y A f z a l e t a l . ( 2 0 0 7 ) . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s T h e s t a t i s t i c a l a n a l y s i s w a s a c h i e v e d u s i n g M i c r o s o f t E x c e l 2 0 0 3 . B i o d e g r a d a t i o n r a t e o f p h e n o l f o r e a c h b a c t e r i u m w a s c o m p a r e d p a i r w i s e u s i n g s t u d e n t s t - t e s t w i t h 5 % s i g n i f i c a n c e l e v e l R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N T h e p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s a n d t h e m i c r o b i a l c o u n t s o f t h e p e t r o l e u m r e f i n e r y e f f l u e n t s a m p l e s a r e s h o w n i n T a b l e s 1 a n d 2 r e s p e c t i v e l y . T h e s a m p l e s a r e s l i g h t l y a l k a l i n e ( p H 7 . 6 4 8 . 8 7 ) . T h e m i c r o b i o l o g i c a l a n a l y s i s o f o i l r e f i n e r y e f f l u e n t s i n d i c a t e d t h a t t h e e f f l u e n t s a r e a g o o d h a b i t a t f o r b a c t e r i a a n d f u n g i . T h e i s o l a t i o n o f v a r i o u s b a c t e r i a l g e n e r a f r o m t h e e f f l u e n t s t h a t a r e a b l e t o u t i l i z e p h e n o l a s c a r b o n a n d e n e r g y s o u r c e s s h o w e d t h a t t h e y a r e p o t e n t i a l p h e n o l d e g r a d e r s p r e s e n t i n s u c h s p e c i f i c h a b i t a t s ( K o p y t k o a n d J a c o m e , 2 0 0 8 ) . T o t a l v i a b l e c o u n t s o f a e r o b i c h e t e r o t r o p h i c p o p u l a t i o n w e r e h i g h e s t i n R B D a n d l o w e s t i n R W W w i t h m i c r o b i a l l o a d o f ( 2 . 5 2 ± 0 . 5 ) x 1 0 8 a n d ( 2 . 0 5 ± 0 . 4 ) x 1 0 7 C F U / m l r e s p e c t i v e l y . T h e d i f f e r e n c e i n m i c r o b i a l l o a d o f t h e e f f l u e n t s m a y b e a t t r i b u t e d t o d i f f e r e n c e s i n p h e n o l i c c o n t e n t . T h e u t i l i z a t i o n o f p h e n o l i n t h e r o t a r y b i o d i s k m a y h a v e r e s u l t e d i n t h e i n c r e a s e d n u m b e r o f b a c t e r i a l c e l l s . T h e n u t r i e n t c o n t e n t o f t h e e f f l u e n t s a m p l e s m e a s u r e d a s B i o l o g i c a l O x y g e n D e m a n d ( B O D ) , C h e m i c a l O x y g e n D e m a n d ( C O D ) , p h o s p h a t e a n d n i t r a t e m a y a l s o b e a c o n t r i b u t i n g f a c t o r i n t h e m i c r o b i a l p o p u l a t i o n o b t a i n e d ( G a n a p a t h i s e l v a m e t a l . , 2 0 1 1 ) . T o t a l p h e n o l - u t i l i z i n g b a c t e r i a w e r e f o u n d t o b e h i g h e s t i n D P a n d l o w e s t i n O P W W w i t h t o t a l l o a d o f ( 1 . 0 2 ± 0 . 3 ) x 1 0 7 a n d ( 1 . 1 8 ± 0 . 3 ) x 1 0 6 C F U / m l r e s p e c t i v e l y w h i l e t o t a l f u n g a l l o a d w a s f o u n d t o b e h i g h e s t i n R B D a n d l o w e s t i n D P w i t h t o t a l l o a d o f ( 3 . 9 ± 0 . 5 ) x 1 0 4 a n d ( 3 . 1 ± 1 . 3 ) x 1 0 3 C F U / m l r e s p e c t i v e l y . T h e b a c t e r i a l i s o l a t e s f r o m t h e p e t r o l e u m r e f i n e r y e f f l u e n t s a m p l e s w e r e i d e n t i f i e d a n d d e s i g n a t e d a s B a c i l l u s s p . R W W , A e r o m o n a s s p . R B D , E s c h e r i c h i a c o l i O P W W a n d S t a p h y l o c o c c u s s p . D P c o m p r i s i n g t w o 1 1 2 1 2 t t X X I n N w a n y a n w u e t a l . , 2 0 1 2 1 7 0 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 6 7 - 1 7 7 P a r a m e t e r / u n i t S a m p l e s o u r c e a R W W R B D O P W W D P p H 7 . 6 4 8 . 1 8 7 . 4 5 8 . 8 7 T e m p e r a t u r e o C 2 6 . 4 2 6 . 1 2 6 . 8 2 6 . 7 E l e c t . C o n d u c . ( µ s c m - 1 ) 8 4 5 4 4 3 9 2 6 6 4 3 T H C ( m g / l ) 1 7 . 5 1 5 . 0 2 1 . 0 1 6 . 0 B O D ( m g / l ) 3 2 . 0 8 . 0 1 2 . 8 1 2 . 8 C O D ( m g / l ) 1 1 2 . 0 7 6 . 0 1 1 4 . 0 8 4 . 0 P O 4 ( m g / l ) 0 . 2 2 0 . 1 4 0 . 1 3 0 . 1 2 N O 3 ( m g / l ) 2 . 6 0 1 . 2 0 1 . 8 0 1 . 2 0 P h e n o l ( m g / l ) 7 1 . 2 1 3 . 6 1 0 . 1 9 , 4 P b ( m g / l ) < 0 . 0 1 < 0 . 0 1 < 0 . 0 1 < 0 . 0 1 Z n ( m g / l ) 0 . 1 3 0 . 0 2 0 . 0 6 0 . 0 8 C u ( m g / l ) < 0 . 0 1 < 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 1 T a b l e 1 : P h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f p e t r o l e u m r e f i n e r y e f f l u e n t s a m p l e s a R W W = R a w W a s t e w a t e r , R B D = R o t a r y B i o d i s k , O P W W = O b s e r v a t i o n P o n d W a s t e w a t e r , D P = D i s c h a r g e P i p e

e a c h o f G r a m n e g a t i v e a n d G r a m p o s i t i v e o r g a n i s m s t h a t e x h i b i t a g r e a t d e a l o f m e t a b o l i c v e r s a t i l i t y . T h e t o x i c i t y o f p h e n o l t o t h e i s o l a t e w a s a s s e s s e d u s i n g p o p u l a t i o n g r o w t h o n p h e n o l - a m e n d e d m i n e r a l s a l t m e d i u m . F i g u r e 1 s h o w e d t h e e f f e c t o f p h e n o l o n t h e p o p u l a t i o n o f t h e t e s t i s o l a t e s g r o w i n g o n i n c r e a s i n g d o s e s o f p h e n o l r a n g i n g f r o m 0 . 0 5 t o 1 5 . 0 m M ( 4 . 7 1 - 1 , 4 1 1 . 7 m g / l ) . A t 0 . 5 m M ( 4 7 . 0 6 m g / l ) p h e n o l , B a c i l l u s s p . R W W a n d E s c h e r i c h i a c o l i O P W W h a v e t h e i r h i g h e s t g r o w t h w i t h t o t a l v i a b l e c o u n t s o f ( 7 . 1 ± 0 . 5 ) x 1 0 6 a n d ( 7 . 9 ± 0 . 2 ) x 1 0 6 C F U / m l r e s p e c t i v e l y w h i l e A e r o m o n a s s p . R B D a n d S t a p h y l o c o c c u s s p . D P h a v e t h e i r h i g h e s t g r o w t h a t p h e n o l c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 0 m M ( 9 4 . 1 1 m g / l ) w i t h a t o t a l v i a b l e c o u n t s o f ( 7 . 5 ± 0 . 3 ) x 1 0 6 a n d ( 7 . 3 ± 0 . 4 ) x 1 0 6 C F U / m l r e s p e c t i v e l y . T h i s i m p l i e s a d o s e - d e p e n d e n t p o p u l a t i o n g r o w t h r e s p o n s e o f t h e i s o l a t e s t o t h e c o n c e n t r a t i o n s o f p h e n o l i n t h e g r o w t h m e d i u m a s c o m p a r e d t o t h e c o n t r o l s w i t h g r o w t h p o p u l a t i o n v a l u e s o f ( 2 . 1 ± 0 . 4 ) x 1 0 5 , ( 5 . 7 ± 0 . 2 ) x 1 0 5 , ( 3 . 3 ± 0 . 3 ) x 1 0 5 a n d ( 3 . 3 ± 0 . 5 ) x 1 0 5 C F U / m l f o r B a c i l l u s s p . R W W , A e r o m o n a s s p . R B D , E s c h e r i c h i a c o l i . O P W W a n d S t a p h y l o c o c c u s s p . D P r e s p e c t i v e l y . T h e g r o w t h o f b a c t e r i a i n t h e c o n t r o l m e d i u m ( w i t h o u t p h e n o l ) m a y b e a s a r e s u l t o f o r g a n i c i m p u r i t i e s p r e s e n t i n t h e m e d i u m N w a n y a n w u e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 6 7 - 1 7 7 1 7 1 S a m p l e s o u r c e a C o u n t ( C F U / m l ) T o t a l a e r o b i c h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a T o t a l p h e n o l - u t i l i z i n g b a c t e r i a T o t a l f u n g i R W W ( 2 . 0 5 ± 0 . 4 ) x 1 0 7 ( 1 . 2 4 ± 0 . 4 ) x 1 0 6 ( 4 . 1 ± 1 . 2 ) x 1 0 3 R B D ( 2 . 5 2 ± 0 . 5 ) x 1 0 8 ( 1 . 3 1 ± 0 . 3 ) x 1 0 6 ( 3 . 9 ± 0 . 5 ) x 1 0 4 O P W W ( 2 . 7 6 ± 0 . 3 ) x 1 0 7 ( 1 . 1 8 ± 0 . 3 ) x 1 0 6 ( 3 . 6 ± 0 . 5 ) x 1 0 3 D P ( 2 . 5 0 ± 1 . 2 ) x 1 0 8 ( 1 . 0 2 ± 0 . 3 ) x 1 0 7 ( 3 . 1 ± 1 . 3 ) x 1 0 3 T a b l e 2 : M i c r o b i a l l o a d o f p e t r o l e u m r e f i n e r y e f f l u e n t s a m p l e s a R W W = R a w W a s t e w a t e r , R B D = R o t a r y B i o d i s k , O P W W = O b s e r v a t i o n P o n d W a s t e w a t e r , D P = D i s c h a r g e P i p e T o t a l v i a b l e c o u n t ( C F U / m l x 1 0 6 ) P h e n o l ( m M ) F i g u r e 1 : G r o w t h o f B a c i l l u s s p . R W W ( a ) ; A e r o m o n a s s p . R B D ( b ) ; E s c h e r i c h i a c o l i . O P W W ( c ) a n d S t a p h y l o c o c c u s s p . D P ( d ) o n B u s h n e l l - H a a s a g a r m e d i u m a m e n d e d w i t h i n c r e a s i n g d o s e s o f p h e n o l .

c o m p o n e n t s , w h i c h a r e u t i l i z e d b y t h e o r g a n i s m s a s c a r b o n a n d e n e r g y s o u r c e . T h e t o t a l v i a b l e c o u n t s o f t h e o r g a n i s m s p r o g r e s s i v e l y d e c r e a s e d a s t h e p h e n o l c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e s . A t 1 5 . 0 m M ( 1 , 4 1 1 . 7 m g / l ) B a c i l l u s s p . R W W a n d E s c h e r i c h i a c o l i O P W W w e r e h i g h l y i n h i b i t e d w h i l e A e r o m o n a s s p . R B D a n d S t a p h y l o c o c c u s s p . D P s h o w e d l i t t l e p o p u l a t i o n g r o w t h o f ( 1 . 0 ± 0 . 0 1 ) x 1 0 5 a n d ( 2 . 0 ± 0 . 1 ) x 1 0 5 C F U / m l r e s p e c t i v e l y . T h e i n h i b i t o r y n a t u r e o f p h e n o l a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s i s w e l l k n o w n , a n d h a s b e e n r e p o r t e d b y m a n y a u t h o r s ( K o t t u r i e t a l . , 1 9 9 1 ; M a r g e s i n e t a l . , 2 0 0 4 ; K h l e i f a t , 2 0 0 6 ; O k p o k w a s i l i a n d N w e k e , 2 0 0 6 ) . A l t h o u g h p h e n o l w a s t o x i c t o t h e o r g a n i s m s , t h e y c o u l d u t i l i z e i t a s s o u r c e o f c a r b o n a n d e n e r g y a t l o w c o n c e n t r a t i o n s . T h e g r o w t h p a t t e r n s o f t h e p h e n o l - u t i l i z i n g b a c t e r i a i n B H m e d i u m c o n t a i n i n g d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f p h e n o l p r e s e n t s a n i n t e r e s t i n g o b s e r v a t i o n . T h e r e s u l t s c o n f o r m t o t h e w o r k o f M a r r o t e t a l . ( 2 0 0 8 ) t h a t r e p o r t e d m i c r o b i a l r e s p o n s e s t o p h e n o l a t l o w e r c o n c e n t r a t i o n s , d e p i c t i n g a n i n c r e a s e i n m i c r o b i a l b i o m a s s . D e p r e s s i o n o f g r o w t h o f B a c i l l u s s p . R W W a n d E s c h e r i c h i a c o l i O P W W a t 1 5 m M ( 1 , 4 1 1 . 7 m g / l ) m a y b e d u e t o i n a c t i v a t i o n o f e n z y m e s b y p h e n o l t o x i c i t y a t s u c h h i g h c o n c e n t r a t i o n l e a d i n g t o i n c o m p l e t e u t i l i z a t i o n o f p h e n o l i n t h e m e d i u m ( A c u ñ a - A r g ü e l l e s e t a l . , 2 0 0 3 ; R u i z - O r d a z e t a l . , 1 9 9 8 ) . A l s o , s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t l o w e r d o s e s o f p h e n o l a r e m o r e r e a d i l y u t i l i z e d t h a n h i g h e r d o s e s . T h i s c o r r o b o r a t e w i t h t h e h i g h g r o w t h r e s p o n s e s a t l o w d o s e s ( 0 . 5 a n d 1 . 0 m M r e s p e c t i v e l y ) o f p h e n o l . S t i m u l a t i o n o f d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y a t l o w d o s e o f p h e n o l w a s r e p o r t e d f o r B a c i l l u s a n d P s e u d o m o n a s s p e c i e s i s o l a t e d f r o m p e t r o l e u m r e f i n e r y w a s t e w a t e r ( N w e k e a n d O k p o k w a s i l i , 2 0 1 0 a , b ) . S t i m u l a t i o n o f d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y i n s o m e b a c t e r i a b y p h e n o l c o u l d i n d i c a t e t h e u s e o f p h e n o l a s a g r o w t h s u b s t r a t e . S i m i l a r s t i m u l a t i o n a n d i n h i b i t i o n o f d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y i n s o i l A c i n e t o b a c t e r s p e c i e s b y p h e n o l d e r i v a t i v e s a t l o w a n d h i g h c o n c e n t r a t i o n s r e s p e c t i v e l y w a s r e p o r t e d b y O k o l o e t a l . ( 2 0 0 7 ) . T h e p r o g r e s s i v e i n h i b i t i o n o f d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n o f p h e n o l s i s i n l i n e w i t h t h e w e l l d o c u m e n t e d i n h i b i t o r y n a t u r e o f p h e n o l s a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s e v e n f o r o r g a n i s m s w h i c h c a n u s e p h e n o l s a s g r o w t h s u b s t r a t e s ( A c u ñ a - A r g ü e l l e s e t a l . , 2 0 0 3 ; R u i z - O r d a z e t a l . , 1 9 9 8 ) . G r o w t h o f t h e o r g a n i s m s i n B H m e d i u m N w a n y a n w u e t a l . , 2 0 1 2 1 7 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 6 7 - 1 7 7 P h e n o l ( m M ) T i m e ( h ) F i g u r e 2 : B i o d e g r a d a t i o n o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f p h e n o l i n m i n e r a l s a l t m e d i u m b y t h e b a c t e r i a l s t r a i n s . V a l u e s a r e m e a n o f d u p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n .

s u p p l e m e n t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f p h e n o l w a s s t u d i e d . P h e n o l u t i l i z a t i o n w a s w e l l c o r r e l a t e d w i t h g r o w t h . U t i l i z a t i o n a n d g r o w t h o f t h e b a c t e r i a l s t r a i n s i n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f p h e n o l a r e s h o w n i n F i g u r e s 2 a n d 3 r e s p e c t i v e l y . P h e n o l w a s c o m p l e t e l y u t i l i z e d b y t h e i s o l a t e s w i t h i n 1 8 0 h . T w o m i l l i m o l a r [ ( 2 . 0 m M ( 1 8 8 . 2 m g / l ) ] o f p h e n o l w a s u t i l i z e d c o m p l e t e l y w i t h i n 6 0 h b y B a c i l l u s s p . R W W a n d E s c h e r i c h i a c o l i . O P W W w h i l e s a m e c o n c e n t r a t i o n o f p h e n o l w a s u t i l i z e d c o m p l e t e l y w i t h i n 7 2 h b y A e r o m o n a s s p . R B D a n d S t a p h y l o c o c c u s s p . D P . S t a p h y l o c o c c u s s p . D P c o m p l e t e l y d e g r a d e d 1 1 . 0 m M ( 1 , 0 3 5 . 2 m g / l ) i n 1 8 0 h ( F i g u r e 2 ) . T i m e - d e p e n d e n t d e g r a d a t i o n o f o r g a n i c c o m p o u n d s h a s b e e n r e p o r t e d t o b e l i n k e d w i t h c o n c e n t r a t i o n o f t h e o r g a n i c c o m p o u n d a s o b s e r v e d b y m a n y a u t h o r s ( C o l w e l l a n d W a l k e r , 1 9 7 7 ; K o t r e s h a a n d V i d y a s a g a r , 2 0 0 8 ) . T h i s l o n g e r p e r i o d o f u t i l i z a t i o n o f p h e n o l b y t h e o r g a n i s m s m a y b e a t t r i b u t e d t o n o n - a c c l i m a t i o n o f t h e b a c t e r i a l s t r a i n s t o i n c r e a s i n g d o s e s o f p h e n o l o r s u b s t r a t e i n h i b i t i o n e f f e c t o f p h e n o l a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s . T h i s c o r r o b o r a t e s t h e o b s e r v a t i o n o f S a t s a n g e e a n d G h o s h ( 1 9 9 0 ) t h a t n o n a c c l i m a t e d o r g a n i s m s t a k e l o n g e r p e r i o d t h a n a c c l i m a t e d o n e s t o d e g r a d e o r g a n i c c o m p o u n d s . A l s o , J o s e p h a n d J o s e p h ( 1 9 9 9 ) r e p o r t e d t h a t p h e n o l t o x i c i t y d e p e n d s o n t h e s e n s i t i v i t y a s w e l l a s p r e - e x p o s u r e o f o r g a n i s m t o t h e t o x i c a n t . A t h i g h c o n c e n t r a t i o n s , p h e n o l h a s b e e n o b s e r v e d t o i n h i b i t m i c r o b i a l g r o w t h e v e n t o o r g a n i s m s t h a t u t i l i z e i t a s s o l e s o u r c e o f c a r b o n a n d e n e r g y . T h i s i s i n l i n e w i t h t h e r e p o r t s o f C o l l i n s a n d D a u g u l i s ( 1 9 9 7 ) a n d N w a n y a n w u a n d A b u ( 2 0 1 1 ) w h o o b s e r v e d t h e t o x i c e f f e c t o f p h e n o l a t t h e m e m b r a n e l e v e l , t h e r e b y d i s r u p t i n g t h e a c t i v i t y o f e n z y m e s i n p h e n o l - u t i l i z i n g b a c t e r i a . T h e b i o m a s s c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e o f t h e p u r e c u l t u r e s e x p r e s s e d a s o p t i c a l d e n s i t y ( O D 5 4 0 n m ) a t d i f f e r e n t i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o f p h e n o l i s s h o w n i n F i g u r e 3 . I t w a s o b s e r v e d t h a t t h e l a g p h a s e s o f g r o w t h o f t h e b a c t e r i a l i s o l a t e s w e r e b e l o w 1 2 h . H i g h e s t c e l l d e n s i t i e s ( O D 5 4 0 n m ) r e c o r d e d w e r e 0 . 3 4 1 a t 1 1 m M a n d 0 . 1 8 2 a t 2 m M p h e n o l f o r E s c h e r i c h i a c o l i O P W W . T h i s r e s u l t e d i n t h e f a s t e r c o n v e r s i o n r a t e s o f p h e n o l f o r t h e N w a n y a n w u e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 6 7 - 1 7 7 1 7 3 F i g u r e 3 : G r o w t h o f t h e b a c t e r i a l s t r a i n s o n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f p h e n o l i n m i n e r a l s a l t m e d i u m . V a l u e s a r e m e a n o f d u p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n . O p t i c a l d e n s i t y ( O D 5 4 0 n m ) T i m e ( h )

b a c t e r i a l g r o w t h c o m p a r e d t o o t h e r p u r e c u l t u r e s . T h o u g h , t h e o t h e r p u r e c u l t u r e s s h o w e d r o b u s t a b s o r b a n c e o f c e l l g r o w t h i n a l l p h e n o l c o n c e n t r a t i o n s i n d i c a t i n g t h a t t h e c u l t u r e s a r e c a p a b l e o f u t i l i z i n g p h e n o l m u c h e f f i c i e n t l y . S p e c i f i c g r o w t h r a t e s ( µ ) f o r e a c h i n i t i a l p h e n o l c o n c e n t r a t i o n ( S o ) w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e p l o t o f l n ( X ) v e r s u s t i m e i n l o g a r i t h m i c p h a s e . T h e s l o p e o f t h e l i n e a r l o g a r i t h m i c p l o t s o f o p t i c a l d e n s i t y d u r i n g t h e e x p o n e n t i a l p h a s e g i v e s t h e s p e c i f i c g r o w t h r a t e . S p e c i f i c g r o w t h r a t e o f a l l t h e b a c t e r i a l s t r a i n s i n c r e a s e d r a p i d l y a t p h e n o l c o n c e n t r a t i o n o f 2 . 0 m M ( 1 8 8 . 2 2 m g / l ) a n d t h e n p r o g r e s s i v e l y d e c r e a s e s w i t h i n c r e a s e i n s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s u g g e s t i n g p h e n o l t o x i c i t y t o t h e o r g a n i s m s ( F i g u r e 4 ) . T h e h i g h e s t s p e c i f i c g r o w t h r a t e s o b t a i n e d a t p h e n o l c o n c e n t r a t i o n o f 1 1 . 0 m M ( 1 0 3 5 . 2 1 m g / l ) w a s 0 . 0 1 3 h - 1 f o r B a c i l l u s s p . R W W a n d E s c h e r i c h i a c o l i O P W W w h i l e t h e l o w e s t s p e c i f i c g r o w t h r a t e o f 0 . 0 1 1 h - 1 a t 1 1 . 0 m M w a s o b s e r v e d i n S t a p h y l o c o c c u s s p . D P . T h e E s c h e r i c h i a c o l i , A e r o m o n a s , B a c i l l u s a n d S t a p h y l o c o c c u s s p e c i e s g r e w r e l a t i v e l y a t s l o w r a t e . T h e m e a n m a x i m u m s p e c i f i c g r o w t h o f A c i n e t o b a c t e r s p e c i e s i n p h e n o l w a s r e p o r t e d t o b e 0 . 8 3 h - 1 ( H a o e t a l . , 2 0 0 2 ) . E w i n g e l l a a m e r i c a n a d e g r a d i n g 3 0 0 m g / l p h e n o l g r e w a t m a x i m u m s p e c i f i c g r o w t h r a t e o f 0 . 3 2 a n d 0 . 2 9 h 1 f o r s t a r v e d a n d n o n - s t a r v e d c e l l s r e s p e c t i v e l y ( K h l e i f a t , 2 0 0 6 ) . A p h e n o l - d e g r a d i n g A l c a l i g e n e s f a e c a l i s g r e w a t m a x i m u m s p e c i f i c g r o w t h r a t e o f 0 . 1 5 h - 1 ( B a i e t a l . , 2 0 0 7 ) . S i m i l a r l y , m i x e d m i c r o b i a l c o n s o r t i u m g r e w a t m a x i m u m s p e c i f i c g r o w t h o f 0 . 3 7 h - 1 ( S a r a v a n a n e t a l . , 2 0 0 8 ) , 0 . 1 4 3 h - 1 ( N u h o g l u a n d Y a l c i n , 2 0 0 5 ) a n d 0 . 3 1 h - 1 ( B a j a j e t a l . , 2 0 0 9 ) . H o w e v e r , t h e g r o w t h r a t e s o f E s c h e r i c h i a c o l i , A e r o m o n a s , B a c i l l u s a n d S t a p h y l o c o c c u s s p e c i e s a r e s i m i l a r t o t h a t o f P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a a n d P s e u d o m o n a s p s e u d o m a l l e i d e g r a d i n g p h e n o l i n s a l i n e s o l u t i o n s ( A f z a l e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h e r a t e o f p h e n o l d e g r a d a t i o n o f t h e o r g a n i s m s d u r i n g t h e i r g r o w t h i n p h e n o l m e d i u m a r e s h o w n i n T a b l e 3 , T h e h i g h e s t r a t e o f p h e n o l d e g r a d a t i o n ( 9 . 1 6 m g / l . h ) a t 1 1 m M ( 1 0 3 5 m g / l ) w a s o b s e r v e d w i t h E s c h e r i c h i a c o l i O P W W . T h e d e g r a d a t i o n r a t e s a t 1 1 m M w e r e h i g h e r t h a n t h e d e g r a d a t i o n r a t e s a t 2 m M . T h i s i n d i c a t e s s t r o n g p o t e n t i a l o f t h e s e o r g a n i s m s t o d e g r a d e p h e n o l . T h e s l o w r a t e o f g r o w t h a n d b i o d e g r a d a t i o n m a y b e a t t r i b u t e d t o t h e l a c k o f a c c l i m a t i o n o r d e c r e a s e i n t h e e f f e c t i v e r e a c t i v i t y o f t h e e n z y m e s y s t e m w i t h i n t h e c e l l . S i m i l a r r e p o r t h a d b e e n o b s e r v e d b y Y a p e t a l . , ( 1 9 9 9 ) i n t h e i r w o r k u s i n g C o m a m o n a s t e s t o s t e r o n i s t r a i n P 1 5 t o e l i m i n a t e p h e n o l . T h e y r e p o r t e d t h a t t h e l o w d e g r a d a t i o n r a t e o f p h e n o l b y t h e o r g a n i s m w a s i n o r d e r t o c o u n t e r a c t t h e a d v e r s e e f f e c t s o f p h e n o l i n h i b i t i o n . T h e t - t e s t s h o w e d t h a t t h e N w a n y a n w u e t a l . , 2 0 1 2 1 7 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 6 7 - 1 7 7 P h e n o l ( m M ) , S o S p e c i f i c g r o w t h r a t e ( h - 1 ) F i g u r e 4 : S p e c i f i c g r o w t h r a t e o f t h e b a c t e r i a u n d e r d i f f e r e n t i n i t i a l p h e n o l c o n c e n t r a t i o n s B a c t e r i a B i o d e g r a d a t i o n r a t e ( m g / l . h ) P h e n o l c o n c e n t r a t i o n ( m g / l ) a 1 8 8 ( 2 ) 4 7 1 ( 5 ) 7 5 3 ( 8 ) 1 0 3 5 ( 1 1 ) B a c i l l u s s p . R W W 4 . 4 9 6 . 1 8 1 1 . 6 3 8 . 2 2 A e r o m o n a s s p . R B D 5 . 8 8 6 . 2 3 7 . 3 0 8 . 4 7 E s c h e r i c h i a c o l i O P W W 5 . 2 5 6 . 8 8 8 . 3 2 9 . 1 6 S t a p h y l o c o c c u s s p . D P 3 . 6 1 5 . 6 3 6 . 0 6 6 . 3 3 T a b l e 3 : B i o d e g r a d a t i o n r a t e ( Q s ) o f r e f i n e r y e f f l u e n t b a c t r i a u n d e r d i f f e r e n t i n i t i a l p h e n o l c o n c e n t r a t i o n s v a l u e s i n p a r e n t h e s i s r e p r e s e n t p h e n o l c o n c e n t r a t i o n i n m M

b i o d e g r a d a t i o n r a t e v a r i e d s i g n i f i c a n t l y ( p < 0 . 0 5 ) a m o n g t h e t e s t o r g a n i s m s . H o w e v e r t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e b i o d e g r a d a t i o n r a t e s o f A e r o m o n a s s p . R B D a n d S t a p h y l o c o c c u s s p . D P a s w e l l a s E s c h e r i c h i a s p O P W W a n d S t a p h y l o c o c c u s s p . D P . A l t h o u g h , t h e y g r e w a t l o w r a t e , t h e o r g a n i s m s d e m o n s t r a t e d s t r o n g p o t e n t i a l t o u t i l i z e a n d d e g r a d e p h e n o l a t h i g h p h e n o l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 1 . 0 m M ( 1 , 0 3 5 . 2 m g / l ) . T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e s e s t r a i n s h a v e r e m a r k a b l e p o t e n t i a l f o r a p p l i c a t i o n i n t h e t r e a t m e n t o f p h e n o l i c w a s t e w a t e r a n d i n t h e b i o r e m e d i a t i o n o f p h e n o l - c o n t a m i n a t e d m e d i a . R E F E R E N C E A c u ñ a - A r g ü e l l e s M E , O l g u i n - L o r a P , R a z o - F l o r e s E . 2 0 0 3 . T o x i c i t y a n d k i n e t i c p a r a m e t e r s o f t h e a e r o b i c b i o d e g r a d a t i o n o f p h e n o l s a n d a l k y l p h e n o l s b y a m i x e d c u l t u r e . B i o t e c h n o l . L e t t . , 2 5 : 5 5 9 - 5 6 4 . A f z a l M , I q b a l S , R a u f S a n d K h a l i d Z M . 2 0 0 7 . C h a r a c t e r i s t i c s o f p h e n o l b i o d e g r a d a t i o n i n s a l i n e s o l u t i o n s b y m o n o c u l t u r e s o f P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a a n d P s e u d o m o n a s p s e u d o m a l l e i . J . H a z a r d . M a t . , 1 4 9 : 6 0 - 6 6 . A P H A . 1 9 8 5 . S t a n d a r d M e t h o d s f o r t h e E x a m i n a t i o n o f W a t e r a n d W a s t e w a t e r , 1 6 t h e d i t i o n . A m e r i c a n P u b l i c H e a l t h A s s o c i a t i o n , A m e r i c a n w a t e r w o r k s A s s o c i a t i o n a n d W a t e r P o l l u t i o n c o n t r o l F e d e r a t i o n , W a s h i n g t o n , D . C . A t l a s R M . 1 9 8 1 . M i c r o b i a l d e g r a d a t i o n o f p e t r o l e u m h y d r o c a r b o n s : a n e n v i r o n m e n t a l p e r s p e c t i v e . M i c r o b i o l . R e v . , 4 5 : 1 8 0 - 2 0 9 . B a j a j M , G a l l a r t C , a n d W i n t e r J . 2 0 0 9 . P h e n o l d e g r a d a t i o n k i n e t i c s o f a n a e r o b i c m i x e d c u l t u r e . B i o c h e m E n g . J . , 4 6 ( 2 ) : 2 0 5 - 2 0 9 . B a i J , W e n J - P , L i H - M a n d J i a n g Y . 2 0 0 7 . K i n e t i c s m o d e l l i n g o f g r o w t h a n d b i o d e g r a d a t i o n o f p h e n o l a n d m - c r e s o l u s i n g A l c a l i g e n e s f a e c a l i s . P r o c . B i o c h e m . , 4 2 : 5 1 0 - 5 1 7 . B o s z c z y k M a l e s z a k H , C h o r a z y M , B i e s z k i e w i c z E , K a c i e s z c z e n k o J . 2 0 0 2 . P h e n o l u t i l i z a t i o n b y f u n g i i s o l a t e d f r o m a c t i v a t e d s l u d g e . A c t a M i c r o b i o l . P o l o n . , 5 1 : 1 8 2 - 1 9 1 . C h a r e s t A , B i s a i l l o n J G , L é p i n e F , B e a u d e t R . 1 9 9 9 . R e m o v a l o f p h e n o l i c c o m p o u n d s f r o m a p e t r o c h e m i c a l e f f l u e n t w i t h a m e t h a n o g e n i c c o n s o r t i u m . C a n . J . M i c r o b i o l . , 4 5 : 2 3 5 - 2 4 1 . C o l l i n s L D , D a u g u l i s A J . 1 9 9 7 . C h a r a c t e r i s t i c s a n d o p t i m i z a t i o n o f a t w o - p h a s e p a r t i t i o n i n g b i o r e a c t o r f o r t h e b i o d e g r a d a t i o n o f p h e n o l . A p p l . M i c o b i o l . B i o t e c h n o l . , 4 8 : 1 8 - 2 2 . C o l w e l l R R , W a l k e r J D . 1 9 7 7 . E c o l o g i c a l a s p e c t s o f m i c r o b i a l d e g r a d a t i o n o f p e t r o l e u m i n t h e m a r i n e e n v i r o n m e n t . C r i t . R e v . M i c r o b i o l . , 5 : 4 2 3 - 4 4 5 . F o l s o m B R , C h a p m a n P J , P r i t c h a r d P M . 1 9 9 0 . P h e n o l a n d t r i c h l o r o e t h y l e n e d e g r a d a t i o n b y P s e u d o m o n a s c e p c i a G A : K i n e t i c s a n d i n t e r a c t i o n b e t w e e n s u b s t r a t e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . , 5 6 : 1 2 7 9 - 1 2 8 5 . H a o O , K i m M , S e a g r e e n E a n d K i m H . 2 0 0 2 . K i n e t i c s o f p h e n o l a n d c h l o r o p h e n o l u t i l i z a t i o n b y A c i n e t o b a c t e r i s o l a t e s . C h e m o s p h e r e 4 6 ( 6 ) : 7 9 - 8 0 7 . H e i p i e p e r H J , K e w e l o H , R e h m H J . 1 9 9 1 . I n f l u e n c e o f p h e n o l s o n g r o w t h a n d m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y o f f r e e a n d i m m o b i l i z e d E s c h e r i c h i a c o l i . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . , 5 7 : 1 2 1 3 - 1 2 1 7 . H i l l G A , M i l n e B J , N a w r o c k P A . 1 9 9 6 . C o m e t a b o l i c d e g r a d a t i o n o f 4 - c h l o r o p h e n o l b y A l c a l i g e n e s e u t r o p h u s . A p p l M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . , 4 6 : 1 6 3 - 1 6 8 . H i l l G A , R o b i n s o n C W . 1 9 7 5 . S u b s t r a t e i n h i b i t i o n k i n e t i c s : p h e n o l d e g r a d a t i o n b y P s e u d o m o n a s p u t i d a . N w a n y a n w u e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 6 7 - 1 7 7 1 7 5

B i o t e c h n o l . B i o e n g . , 1 7 : 1 5 9 9 - 1 6 1 5 . H o l t J G , K r i e g N R , S n e a t h P H A , S t a l e y J T , W i l l i a m s S T . 1 9 9 4 . B e r g e y s M a n u a l o f D e t e r m i n a t i v e B a c t e r i o l o g y , 9 t h e d . W i l l i a m s , W i l k i n s . B a l t i m o r e . I d i s e O E , A m e h J B , Y a k u b u S E , O k u o f u C A . 2 0 1 0 . B i o d e g r a d a t i o n o f a r e f i n e r y e f f l u e n t t r e a t e d w i t h o r g a n i c f e r t i l i z e r b y m o d i f i e d s t r a i n s o f B a c i l l u s c e r e u s a n d P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a . A f r . J . B i o t e c h n o l . , 9 ( 2 2 ) : 3 2 9 8 - 3 3 0 2 . J i n d r o v a E , C h o c o v a M , D e m n e r o v a K , B r e n e n e r V . 2 0 0 2 . B a c t e r i a l a e r o b i c d e g r a d a t i o n o f b e n z e n e , t o l u e n e , e t h y l b e n z e n e a n d x y l e n e . F o l i a M i c r o b i o l . , 4 7 : 8 3 - 9 4 . J o s e p h V , J o s e p h A . 1 9 9 9 . A c c l i m a t i o n o f a l g a l s p e c i e s f o l l o w i n g e x p o s u r e t o p h e n o l . B u l l . E n v i r o n . C o n t a m . T o x i c o l . , 6 2 : 8 7 - 9 2 . K e w e l o H , W e y r a u c h G , R e h m H J . 1 9 9 0 . P h e n o l i n d u c e d m e m b r a n e c h a n g e s i n f r e e a n d i m m o b i l i z e d E s c h e r i c h i a c o l i . A p p l . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . , 3 3 : 6 6 - 7 1 . K h l e i f a t K M . 2 0 0 6 . B i o d e g r a d a t i o n o f p h e n o l b y E w i n g e l l a a m e r i c a n a : E f f e c t o f c a r b o n s t a r v a t i o n a n d s o m e g r o w t h c o n d i t i o n s . P r o c . B i o c h e m . , 4 1 : 2 0 1 0 - 2 0 1 6 . K o p y t k o M , J a c o m e L A P . 2 0 0 8 . A l t e r n a t i v e f o r p h e n o l b i o d e g r a d a t i o n i n o i l c o n t a m i n a t e d w a s t e w a t e r s u s i n g a n a d a p t e d b a c t e r i a l b i o f i l m l a y e r . R u d . G e o . N a f t . Z b . , 2 0 : 7 1 - 8 2 . K o t r e s h a D , V i d y a s a g a r G M . 2 0 0 8 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i s a t i o n o f p h e n o l - d e g r a d i n g P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a M T C C 4 9 9 6 . W o r l d J . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . , 2 4 : 5 4 1 - 5 4 7 . K o t t u r i G , R o b i n s o n C W , I n n i s s W E . 1 9 9 1 . P h e n o l d e g r a d a t i o n b y a p s y c h r o t r o p h i c s t r a i n o f P s e u d o m o n a s p u t i d a . A p p l i e d M i c r o b i o l o g y a n d B i o t e c h n o l o g y 4 : 5 3 9 - 5 4 3 . K u o C W , G e n t h n e r B R S . 1 9 9 6 . E f f e c t o f a d d e d m e t a l i o n s o n b i o t r a n s f o r m a t i o n a n d b i o d e g r a d a t i o n o f 2 - c h l o r o p h e n o l a n d 3 - c h l o r o b e n z o a t e i n a n a e r o b i c b a c t e r i a l c o n s o r t i u m A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . , 6 2 : 2 3 1 7 - 2 3 2 3 . L e a h y J G , C o l w e l l R R . 1 9 9 0 . M i c r o b i a l d e g r a d a t i o n o f h y d r o c a r b o n s i n t h e e n v i r o n m e n t . M i c r b i o l . R e v . , 5 4 : 3 0 5 - 3 1 5 . M a r g e s i n R , B e r g a u e r P , G a n d e r S . 2 0 0 4 . D e g r a d a t i o n o f p h e n o l a n d t o x i c i t y o f p h e n o l i c c o m p o u n d s : a c o m p a r i s o n o f c o l d - t o l e r a n t A r t h r o b a c t e r s p . a n d m e s o p h i l i c P s e u d o m o n a s p u t i d a . E x t r e m o p h i l e s 8 : 2 0 1 - 2 0 7 . M a r r o t B , B a r r i o s - M a r t i n e z A , M o u l i n P , R o c h e N . 2 0 0 8 . B i o d e g r a d a t i o n o f h i g h p h e n o l c o n c e n t r a t i o n i n a m e m b r a n e b i o r e a c t o r . I n t . J . C h e m . R e a c t . E n g . , 6 . M o n k i e d j e A , N j i n e M , M e y a b e m e - E l o n o A L , Z e b a z e S H , K e m k a N , C h o u n w o u P B , D j o m o J E . 2 0 0 4 . F r e s h w a t e r m i c r o c o s m s - b a s e d a s s e s s m e n t o f e c o t o x i c o l o g i c a l e f f e c t s o f a c h e m i c a l e f f l u e n t f r o m t h e p i l c a n i n d u s t r y i n C a m e r o o n . I n t . J . E n v i r o n . R e s . P u b l . H e a l t h 1 ( 2 ) : 1 1 1 - 1 2 3 . N w a n y a n w u C E , A b u G O . 2 0 1 0 . I n v i t r o e f f e c t s o f p e t r o l e u m r e f i n e r y w a s t e w a t e r o n d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y i n m a r i n e b a c t e r i a l s t r a i n s . A m b i . A g u a . , 5 : 2 1 - 2 9 . N w a n y a n w u C E , A b u G O . 2 0 1 1 . A s s e s s m e n t o f v i a b i l i t y r e s p o n s e s o f r e f i n e r y e f f l u e n t b a c t e r i a a f t e r e x p o s u r e t o p h e n o l s t r e s s . J . R e s . B i o l . 8 : 5 9 4 6 0 2 . N w e k e C O , O k p o k w a s i l i G C . 2 0 1 0 a . I n f l u e n c e o f e x p o s u r e t i m e o n p h e n o l t o x i c i t y t o r e f i n e r y w a s t e w a t e r b a c t e r i a . J . E n v i r o n . C h e m . E c o t o x i c o l . , 2 ( 2 ) : 2 0 - 2 7 . N w e k e C O , O k p o k w a s i l i G C . 2 0 1 0 b . I n h i b i t i o n o f d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y i n p e t r o l e u m r e f i n e r y w a s t e w a t e r b a c t e r i a b y p h e n o l i c c o m p o u n d s . A m b i . Á g u a . , 5 : 6 - 1 6 . N w a n y a n w u e t a l . , 2 0 1 2 1 7 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 6 7 - 1 7 7

N w e k e C O , O k p o k w a s i l i G C . 2 0 1 1 . I n h i b i t i o n o f β - g a l a c t o s i d a s e a n d α - g l u c o s i d a s e s y n t h e s i s i n p e t r o l e u m r e f i n e r y e f f l u e n t b a c t e r i a b y p h e n o l i c c o m p o u n d s . A m b i . Á g u a . , 6 ( 1 ) : 4 0 - 5 3 . N u h o g l u A , Y a l c i n B . 2 0 0 5 . M o d e l l i n g o f p h e n o l r e m o v a l i n a b a t c h r e a c t o r . P r o c . B i o c h e m . , 4 0 : 1 2 3 3 - 1 2 3 9 . O k o l o J C , N w e k e C O , N w a b u e z e R N , D i k e C U , N w a n y a n w u C E . 2 0 0 7 . T o x i c i t y o f p h e n o l i c c o m p o u n d s t o o x i d o r e d u c t a s e s o f A c i n e t o b a c t e r s p e c i e s i s o l a t e d f r o m a t r o p i c a l s o i l . S c i . R e s . , E s s a y 7 : 2 4 4 - 2 5 0 . O k p o k w a s i l i G C , N w e k e C O . 2 0 0 6 . M i c r o b i a l g r o w t h a n d s u b s t r a t e u t i l i z a t i o n k i n e t i c s . A f r . J . B i o t e c h n o l . , 5 ( 4 ) : 3 0 5 - 3 1 7 . R i g o M , A l e g r e R M . 2 0 0 4 . I s o l a t i o n a n d s e l e c t i o n o f p h e n o l - d e g r a d i n g m i c r o o r g a n i s m s f r o m i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r s a n d k i n e t i c s o f t h e b i o d e g r a d a t i o n . F o l i a M i c r o b i o l . , 4 9 : 4 1 - 4 5 . R u i z - O r d a z N , R u i z - L a g u n e z J C , G o n z a l e z J U C , M a n z a n o E H , U r b i n a E C , M a y e r J G . 2 0 0 1 . P h e n o l b i o d e g r a d a t i o n u s i n g a r e p e a t e d b a t c h c u l t u r e o f C a n d i d a t r o p i c a l i s i n a m u l t i s t a g e b u b b l e c o l u m n . R e v . L a t i n o - A m e r i c a n a M i c r o b i o l . , 4 3 : 1 9 - 2 5 . R u i z - O r d a z N , H e r n á n d e z - M a n z a n o E , R u i z - L a g ú n e z J C , C r i s t i a n i - U r b i n a E , G a l í n d e z - M a y e r J . 1 9 9 8 . G r o w t h k i n e t i c s m o d e l t h a t d e s c r i b e s t h e i n h i b i t o r y a n d l y t i c e f f e c t s o f p h e n o l o n C a n d i d a t r o p i c a l i s y e a s t . B i o t e c h n o l . P r o g . , 1 4 : 9 6 6 - 9 6 9 . S a r a v a n a n P , P a k s h i r a j a n K , S a h a P . 2 0 0 8 . G r o w t h k i n e t i c s o f a n i n d i g e n o u s m i x e d m i c r o b i a l c o n s o r t i u m d u r i n g p h e n o l d e g r a d a t i o n i n a b a t c h r e a c t o r . B i o r e s . T e c h n o l . , 9 9 : 2 0 5 - 2 0 9 . S a t s a n g e e e R , G o s h P . 1 9 9 0 . A n a e r o b i c d e g r a d a t i o n o f p h e n o l u s i n g a n a c c l i m a t e d m i x e d c u l t u r e . A p p l . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . , 3 4 : 1 2 7 - 1 3 0 . T a n a k a O H , V e n k a t s w a r a n K , K o m u k a i S , T o k i H , I w a b u c h T , M i y a c h i S . 1 9 9 3 . E c o d y n a m i c s o f o i l d e g r a d i n g b a c t e r i a a n d s i g n i f i c a n c e o f m a r i n e m i x e d p o p u l a t i o n s i n t h e d e g r a d a t i o n o f p e t r o l e u m c o m p o u n d s . I n t e r n a t i o n a l O i l S p i l l C o n f e r e n c e 7 8 0 - 7 8 5 . V e e r e s h G S , K u m a r P , M e h r o t r a I . 2 0 0 5 . T r e a t m e n t o f p h e n o l a n d c r e s o l i n u p f l o w a n a e r o b i c s l u d g e b l a n k e t ( U A S B ) p r o c e s s : a r e v i e w . W a t . R e s . , 3 9 : 1 5 4 - 1 7 0 . Y a p L F , L e e Y K , P o h C L . 1 9 9 9 . M e c h a n i s m f o r p h e n o l t o l e r a n c e i n p h e n o l - d e g r a d i n g C o m a m o n a s t e s t o s t e r o n i s t r a i n . A p p l . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . , 5 1 : 8 3 3 - 8 4 0 . Z h a o J , Z h u J . 1 9 9 7 . S t u d y o n t h e B i o d e g r a d a t i o n o f o i l s p i l l e d o n t h e s e a . I n t e r n a t i o n a l O i l S p i l l C o n f e r e n c e 9 8 9 - 9 9 0 . N w a n y a n w u e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 6 7 - 1 7 7 1 7 7 S u b m i t y o u r a r t i c l e s o n l i n e a t F i c u s p u b l i s h e r s . c o m A d v a n t a g e s E a s y o n l i n e s u b m i s s i o n C o m p l e t e P e e r r e v i e w A f f o r d a b l e C h a r g e s Q u i c k p r o c e s s i n g E x t e n s i v e i n d e x i n g O p e n A c c e s s a n d Q u i c k s p r e a d i n g Y o u r e t a i n s y o u r c o p y r i g h t s u b m i t @ f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m / s u b m i t 1 . a s p x .