J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y B i o a c c u m u l a t i o n o f l e a d b y B a c i l l u s s p e c i e s i s o l a t e d f r o m p i g w a s t e K e y w o r d s : B i o a c c u m u l a t i o n , l e a d , B a c i l l u s s p e c i e s . A B S T R A C T : H e a v y m e t a l s , s u c h a s l e a d , c o p p e r , c a d m i u m , c h r o m i u m a n d m e r c u r y a r e i m p o r t a n t e n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s , p a r t i c u l a r l y i n a r e a s w i t h h i g h a n t h r o p o g e n i c p r e s s u r e . T h e i r p r e s e n c e i n t h e a t m o s p h e r e , s o i l a n d w a t e r , e v e n i n t r a c e s , c a n c a u s e s e r i o u s p r o b l e m s t o a l l o r g a n i s m s . L i v i n g o r g a n i s m s a r e e x p o s e d i n n a t u r e t o l e a d c o m m o n l y i n t h e i r i o n i z e d f o r m s , w h i c h a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s a f f e c t m i c r o b i a l p o p u l a t i o n . M i c r o o r g a n i s m s a r e k n o w n t o i n t e r a c t w i t h h e a v y m e t a l s t h r o u g h a n u m b e r o f m e c h a n i s m s i n c l u d i n g i n t r a c e l l u l a r a c c u m u l a t i o n . B a c i l l u s s p e c i e s i s o l a t e d f r o m p i g w a s t e w a s e x p o s e d t o d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f l e a d s o l u t i o n w i t h i n 2 4 h o u r s . T h e p e r c e n t a g e l o g s u r v i v a l / g r o w t h r a t e i n t h e d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f l e a d w a s d e t e r m i n e d p e r i o d i c a l l y . B i o a c c u m u l a t i o n o f l e a d b y t h e t e s t i s o l a t e w a s d e t e r m i n e d i n t h e g r a d e d l e a d c o n c e n t r a t i o n s ( 0 , 1 . 1 0 , 1 0 0 . 5 0 0 µ g / m l ) . T h e r e s u l t s h o w e d t h a t t h e g r o w t h o f t h e i s o l a t e w a s p r o g r e s s i v e l y i n h i b i t e d b y l e a d i n a d o s e d e p e n d e n t f a s h i o n . T h e i s o l a t e s h o w e d a p o t e n t i a l t o s u r v i v e l e a d i n t o x i c a t i o n a n d a c c u m u l a t e d t h e t o x i c a n t . T h e r e f o r e , B a c i l l u s s p e c i e s i s o l a t e d f r o m p i g w a s t e s h o w s a p r o m i s e f o r i t s u s e i n b i o r e m e d i a t i o n o f l e a d p o l l u t e d e n v i r o n m e n t s . T h i s c a n b e a p p l i e d a s o r g a n i c m a n u r e t o g e t h e r w i t h t h e m i c r o o r g a n i s m i n h e a v y m e t a l - p o l l u t e d s i t e t o p r e v e n t h e a v y m e t a l t o x i c i t y a n d t o e n h a n c e t h e g r o w t h o f p l a n t s . 0 8 3 - 0 8 9 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 2 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : A k u j o b i C O 1 , O d u N N 2 a n d O k o r o n d u S I 1 . I n s t i t u t i o n : 1 . M i c r o b i o l o g y D e p a r t m e n t , F e d e r a l U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y , P M B 1 5 2 6 , O w e r r i , I m o S t a t e , N i g e r i a . 2 . M i c r o b i o l o g y D e p a r t m e n t , U n i v e r s i t y o f P o r t H a r c o u r t , C h o b a , P o r t H a r c o u r t , R i v e r s S t a t e , N i g e r i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : A k u j o b i C O . E m a i l : c a m p b e l l 2 0 5 @ y a h o o . c o m . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 1 7 6 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 2 J a n 2 0 1 2 / A c c e p t e d : 1 1 J a n 2 0 1 2 / P u b l i s h e d : 0 7 F e b 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : A k u j o b i C O , O d u N N a n d O k o r o n d u S I . B i o a c c u m u l a t i o n o f l e a d b y B a c i l l u s s p e c i e s i s o l a t e d f r o m p i g w a s t e . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 0 8 3 - 0 8 9 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h

I N T R O D U C T I O N H e a v y m e t a l s , s u c h a s l e a d , c o p p e r , c a d m i u m , c h r o m i u m a n d m e r c u r y , a r e i m p o r t a n t e n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s , p a r t i c u l a r l y i n a r e a s w i t h h i g h a n t h r o p o g e n i c p r e s s u r e . T h e i r p r e s e n c e i n t h e a t m o s p h e r e , s o i l a n d w a t e r , e v e n i n t r a c e s , c a n c a u s e s e r i o u s p r o b l e m s t o a l l o r g a n i s m s . H e a v y m e t a l a c c u m u l a t i o n i n s o i l s i s o f c o n c e r n i n a g r i c u l t u r a l p r o d u c t i o n d u e t o t h e a d v e r s e e f f e c t s o n f o o d q u a l i t y ( s a f e t y a n d m a r k e t a b i l i t y ) , c r o p g r o w t h ( d u e t o p h y t o t o x i c i t y ) a n d e n v i r o n m e n t a l h e a l t h ( A u g u s t o C o s t a a n d P e r e i r a D u t a , 2 0 0 1 ) . T h e m o b i l i z a t i o n o f h e a v y m e t a l s i n t o t h e b i o s p h e r e b y h u m a n a c t i v i t y h a s b e c o m e a n i m p o r t a n t p r o c e s s i n t h e g e o c h e m i c a l c y c l i n g o f t h e s e m e t a l s . T h i s i s a c u t e l y e v i d e n t i n u r b a n a r e a s w h e r e v a r i o u s s t a t i o n a r y a n d m o b i l e s o u r c e s r e l e a s e l a r g e q u a n t i t i e s o f h e a v y m e t a l s i n t o t h e a t m o s p h e r e a n d s o i l , e x c e e d i n g t h e n a t u r a l e m i s s i o n r a t e s ( D a C o s t a , 1 9 9 9 ) . L i v i n g o r g a n i s m s a r e e x p o s e d i n n a t u r e t o l e a d c o m m o n l y i n t h e i r i o n i z e d f o r m s , w h i c h a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s a f f e c t m i c r o b i a l p o p u l a t i o n . T h i s c a n h a v e s i g n i f i c a n t i m p a c t g i v e n t h a t m a n y m i c r o o r g a n i s m s a r e e s s e n t i a l p a r t s o f t h e d e c o m p o s i n g f o o d c h a i n . T h e a f f e c t e d m i c r o b i a l p o p u l a t i o n a r e l i k e l y t o b e r e p l a c e d b y s a m e / o t h e r s p e c i e s t h a t m a y b e l e s s e f f i c i e n t i n o r g a n i c m a t t e r d e c o m p o s i t i o n , N u t r i e n t r e c y c l i n g , s o i l f o r m a t i o n e t c . , t h e r e b y p u t t i n g a b r i d g e t o A g r i c u l t u r a l s u s t e n a n c e / c o n t i n u i t y ( Y u 2 0 0 5 ) . L e a d p o l l u t i o n a f f e c t s a b r o a d s p e c t r u m o f s p e c i e s a n d i t s p e r s i s t e n c e i n t h e e n v i r o n m e n t i s c o n s i d e r e d t o b e h a z a r d o u s . I t a f f e c t s t h e h u m a n b o d y o r g a n s a n d s y s t e m s n e g a t i v e l y e s p e c i a l l y t h e n e r v o u s s y s t e m , ( W h i t e e t . a l . , 2 0 0 7 ) . I t s l o w s d o w n p h o t o s y n t h e t i c p r o c e s s e s , r e d u c e s e s s e n t i a l n u t r i e n t a n d w a t e r a b s o r p t i o n , r e t a r d s p l a n t g r o w t h a n d e v e n t u a l l y p l a n t d e a t h . A l s o , G r a z i n g a n i m a l s a r e d i r e c t l y a f f e c t e d b y t h e c o n s u m p t i o n o f f o r a g e a n d f e e d c o n t a m i n a t e d b y a i r b o r n e l e a d a n d s o m e w h a t i n d i r e c t l y b y t h e u p t a k e o f l e a d t h r o u g h p l a n t r o o t w h i c h s u b s e q u e n t l y l e a d t o r e p r o d u c t i v e f a i l u r e a n d d e a t h ( C a s a r e t t e t a l . , 2 0 0 7 ) . H e a v y m e t a l s c o n s t i t u t e a m a j o r h a z a r d f o r t h e h u m a n h e a l t h a n d e c o s y s t e m ( B o o p a t h y , 2 0 0 0 ) . T h e s e m e t a l s e n t e r t h e h u m a n b o d y m a i n l y t h r o u g h t w o r o u t e s n a m e l y : i n h a l a t i o n a n d i n g e s t i o n , a n d w i t h i n g e s t i o n b e i n g t h e m a i n r o u t e o f e x p o s u r e t o t h e s e e l e m e n t s i n h u m a n p o p u l a t i o n . H e a v y m e t a l s i n t a k e b y h u m a n p o p u l a t i o n s t h r o u g h t h e f o o d c h a i n h a s b e e n r e p o r t e d i n m a n y c o u n t r i e s w i t h t h i s p r o b l e m r e c e i v i n g i n c r e a s i n g a t t e n t i o n f r o m t h e p u b l i c a s w e l l a s g o v e r n m e n t a l a g e n c i e s , p a r t i c u l a r l y i n d e v e l o p i n g c o u n t r i e s ( A u g u s t o C o s t a a n d P e r e i r a D u t a , 2 0 0 1 ) . C o n t a m i n a t e d s i t e s c a n b e a p r e f e r e n t i a l s o u r c e o f t h o s e m i c r o o r g a n i s m s w h i c h r e p r e s e n t , t h e r e f o r e , i m p o r t a n t m a t e r i a l f o r b o t h s t u d y a n d a p p l i c a t i o n s o f b i o r e m e d i a t i o n f o r d i f f e r e n t i a l t a r g e t s ( M a l i k , 2 0 0 4 ) . T h e t e r m b i o r e m e d i a t i o n f o r h e a v y m e t a l s m a y s e e m i m p r o p e r , s i n c e n o p r o c e s s c a n d e g r a d e a n d t h u s e l i m i n a t e i n o r g a n i c e l e m e n t s ( B a r k a y a n d S c h a e f e r , 2 0 0 1 ) ; n e v e r t h e l e s s i n s o m e c a s e s t h e i r i m m o b i l i z a t i o n , p e r f o r m e d b y m i c r o o r g a n i s m s , m a y b e t h e o n l y f e a s i b l e m e a n s t o p r o t e c t g r o u n d w a t e r a n d f o o d - c h a i n f r o m c o n t a m i n a t i o n s . I n t h e s e c a s e s r e m e d i a l g o a l s c a n b e a c h i e v e d i n d i f f e r e n t w a y s : t h e p r e c i p i t a t i o n , a n d t h u s t h e i m m o b i l i z a t i o n , t h r o u g h d i f f e r e n t b i o l o g i c a l p r o c e s s e s o f i n o r g a n i c c o n t a m i n a n t s , t h e c o n c e n t r a t i o n a n d t h e n r e d u c t i o n i n v o l u m e o f c o n t a m i n a t e d m a t r i c e s a n d t h e c o m p a r t m e n t a l i z a t i o n o f m e t a l s t o a p a r t o f t h e e n v i r o n m e n t i n w h i c h t h e i r t o x i c i t y i s r e d u c e d . T h e i m p o r t a n c e o f t h e b a c t e r i a l e f f e c t s i n t h e r e m o v a l o f h e a v y m e t a l s i s s u p p o r t e d b y m a n y s t u d i e s a n d F e i n ( 2 0 0 0 ) s u g g e s t s t h e i n c o r p o r a t i o n o f b a c t e r i a i n m o d e l s o f w a t e r r o c k s i n t e r a c t i o n a n d c o n t a m i n a n t s t r a n s p o r t . T h e m e a s u r e s e v o l v e d b y m i c r o o r g a n i s m s t o r e s p o n d t o h e a v y m e t a l s t r e s s h a v e b e e n r e v i e w e d ( N i e s , 1 9 9 2 , 1 9 9 9 ; J i a n d S i l v e r , 1 9 9 5 ; N i e s a n d S i l v e r , 1 9 9 5 ) a n d t h e m a i n p r o c e s s e s a r e b i o a c c u m u l a t i o n , e n z y m a t i c r e d u c t i o n a n d c o m p l e x a t i o n . B i o a c c u m u l a t i o n c a n o c c u r e i t h e r b y m e t a b o l i s m - i n d e p e n d e n t ( p a s s i v e ) b i o s o r p t i o n o r b y i n t r a c e l l u l a r , m e t a b o l i s m - d e p e n d e n t ( a c t i v e ) u p t a k e ( L e d i n , 2 0 0 0 ) . 0 8 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 0 8 3 - 0 8 9 A k u j o b i e t a l . , 2 0 1 2

T h e a i m o f t h i s s t u d y i s t o i s o l a t e a n d c h a r a c t e r i z e b a c t e r i a f r o m p i g w a s t e , t o s t u d y t h e h e a v y m e t a l s r e s i s t a n c e p a t t e r n a n d t h e b i o a c c u m u l a t i o n p o t e n t i a l o f t h e s e l e c t e d o r g a n i s m . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S S a m p l e p r e p a r a t i o n a n d i s o l a t i o n o f l e a d - r e s i s t a n t B a c i l l u s P i g w a s t e w a s c o l l e c t e d u s i n g a c l e a n p o l y e t h y l e n e b a g f r o m t h e d e p a r t m e n t o f A n i m a l p r o d u c t i o n i n t h e S c h o o l o f A g r i c u l t u r e a n d A g r i c u l t u r a l T e c h n o l o g y ( S A A T ) o f F e d e r a l U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y O w e r r i ( F . U . T . O ) , l m o s t a t e , N i g e r i a . T w o g r a m s o f t h e p i g w a s t e w e r e h o m o g e n i z e d i n s t e r i l e w a t e r a n d s e r i a l l y d i l u t e d . L e a d [ ( P b N O 3 ) 2 ] i n c o r p o r a t e d n u t r i e n t a g a r p l a t e s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s ( 1 , 1 0 , 1 0 0 , 5 0 0 µ g / m l ) o f t h e l e a d s a l t w e r e p r e p a r e d a n d i n o c u l a t e d w i t h 0 . 1 m l o f t h e d i l u t e d s a m p l e s . I n c u b a t i o n w a s d o n e a t 3 7 o C f o r 2 4 h o u r s . I s o l a t e d c o l o n i e s w e r e p u r i f i e d b y t w o s u b s e q u e n t s i n g l e c o l o n y t r a n s f e r s . P u r e c o l o n i e s w e r e s p e c i f i c a l l y t r a n s f e r r e d i n t o n u t r i e n t a g a r s l a n t s . T h e s l a n t s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 1 8 - 2 4 h . T h e s e s e r v e d a s t h e s t o c k c u l t u r e s a n d w e r e s t o r e d a t 4 ° C i n t h e r e f r i g e r a t o r . P u r e b a c t e r i a l i s o l a t e s w e r e c h a r a c t e r i z e d a n d i d e n t i f i e d u s i n g c r i t e r i a a s i n H o l t e t a l . ( 1 9 9 4 ) . P r e p a r a t i o n o f s t o c k s o l u t i o n o f h e a v y m e t a l s a l t A w e i g h t o f l e a d s a l t t h a t g a v e 1 g o f t h e h e a v y m e t a l ( m e t a l w i t h o u t t h e s a l t ) w a s w e i g h e d a n d d i s s o l v e d i n 1 0 0 0 m l o f d e i o n i z e d w a t e r . I t w a s l e f t t o s t a n d f o r 3 0 m i n t o o b t a i n c o m p l e t e d i s s o l u t i o n . T h i s w a s f o l l o w e d b y s t e r i l i z a t i o n a n d t h e n b y m e m b r a n e f i l t r a t i o n . P r e p a r a t i o n o f s t a n d a r d i n o c u l u m A l o o p f u l o f c e l l s f r o m t h e s t o c k c u l t u r e w a s i n o c u l a t e d i n t o 1 0 0 m l s t e r i l e n u t r i e n t b r o t h i n t r i p l i c a t e s a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 2 4 h w i t h i n t e r m i t t e n t s h a k i n g . A t t h e e n d o f t h e i n c u b a t i o n p e r i o d , c e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 4 0 0 0 r p m f o r 3 0 m i n a n d r e - s u s p e n d e d i n 1 0 0 m l s t e r i l e p h y s i o l o g i c a l s a l i n e . T h e t o t a l v i a b l e c o u n t s w e r e c a r r i e d o u t t o e s t i m a t e t h e n u m b e r o f v i a b l e o r g a n i s m s . D u r i n g t h i s p r o c e s s , t h e c u l t u r e s w e r e s u b j e c t e d t o s e r i a l d i l u t i o n s u p t o 1 0 6 d i l u t i o n s . A n a l i q u o t ( 0 . 1 m l ) f r o m e a c h d i l u t i o n w a s i n o c u l a t e d b y s p r e a d p l a t e t e c h n i q u e i n t o f r e s h l y p r e p a r e d n u t r i e n t a g a r p l a t e s , w h i c h w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 2 4 h . T h e d i l u t i o n s p r o d u c i n g b e t w e e n 3 0 - 3 0 0 c o l o n i e s w e r e c h o s e n a n d s e r v e d a s i n o c u l u m f o r P e r c e n t a g e l o g s u r v i v a l t e s t . P e r c e n t a g e l o g s u r v i v a l t e s t D i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f l e a d s o l u t i o n w e r e p r e p a r e d i n d e i o n i z e d w a t e r t o o b t a i n 1 . 0 , 1 0 . 0 , 1 0 0 . 0 a n d 5 0 0 . 0 µ g / m l . N i n e t y m i l l i l i t e r s o f e a c h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s w a s p u t i n 1 0 0 m l c o n i c a l f l a s k a n d i n o c u l a t e d w i t h 1 0 m l o f t h e s t a n d a r d c u l t u r e w i t h c o n s t a n t s h a k i n g . A c o n t r o l w a s s e t u p w i t h 9 0 m l o f n o r m a l s a l i n e w i t h o u t t o x i c a n t a n d w a s i n o c u l a t e d w i t h 1 0 m l o f t h e s t a n d a r d c u l t u r e . A t e x p o s u r e t i m e s o f 0 , 2 , 4 , 1 2 , 2 4 h , 1 m l w a s a s e p t i c a l l y w i t h d r a w n f r o m e a c h o f t h e f l a s k s f o r v i a b l e c o u n t u s i n g t h e s p r e a d p l a t e t e c h n i q u e . T h e p e r c e n t a g e l o g s u r v i v a l o f t h e i s o l a t e w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e f o r m u l a : P e r c e n t a g e l o g s u r v i v a l = x 1 0 0 W h e r e A = C o u n t i n t o x i c a n t c o n c e n t r a t i o n B = C o u n t i n t h e c o n t r o l M e t a l u p t a k e a s s a y T h e i s o l a t e w a s d e v e l o p e d b y g r o w i n g i n 1 0 0 m l o f f r e s h l y p r e p a r e d n u t r i e n t b r o t h ( p H 7 . 0 ) a t 3 7 0 C f o r 1 8 - 2 4 h r s w i t h c o n s t a n t s h a k i n g . C e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 4 0 0 0 r p m f o r 3 0 m i n . T h e y w e r e w a s h e d t h r i c e w i t h s t e r i l e p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e a n d r e - s u s p e n d i n g i n 1 0 0 m l o f d e i o n i z e d w a t e r . T h e v i a b i l i t y o f t h e c e l l s w e r e a s s e s s e d b y p l a t i n g 0 . 1 m l o n t o a n u t r i e n t a g a r p l a t e . S t o c k s o l u t i o n o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s ( 1 . 0 , 1 0 . 0 , 1 0 0 , 5 0 0 µ g / m l ) o f l e a d w a s p r e p a r e d a n d a d j u s t e d t o p H o f 7 . 0 u s i n g 0 . 1 M s o d i u m h y d r o x i d e a n d 0 . 1 M J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 0 8 3 - 0 8 9 0 8 5 A k u j o b i e t a l . , 2 0 1 2 L o g A l o g B

0 8 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 0 8 3 - 0 8 9 t r i o x o n i t r a t e ( V ) a c i d . F r o m t h e v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f t h e h e a v y m e t a l s a l t , 4 0 m l w e r e w i t h d r a w n u s i n g s t e r i l e p i p e t t e i n t o d u p l i c a t e s e t o f 1 0 0 m l f l a s k a n d i n o c u l a t e d w i t h 1 0 m l o f e a c h o f t h e s t a n d a r d i n o c u l u m . F o r t h e c o n t r o l , 4 0 m l o f s t e r i l e n o r m a l s a l i n e w a s i n o c u l a t e d w i t h 1 0 m l o f t h e i n o c u l u m . A l l f l a s k s w e r e i n c u b a t e d a t 2 5 ° C ± 2 f o r 2 4 h . A t t h e e n d o f t h e i n c u b a t i o n p e r i o d , c e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 4 0 0 0 r p m f o r 3 0 m i n , w a s h e d t h r i c e i n s t e r i l e p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e , d r i e d , w e i g h e d , d i g e s t e d a n d a n a l y z e d f o r h e a v y m e t a l c o n t e n t u s i n g A A S . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s D a t a o b t a i n e d f r o m t h i s s t u d y w e r e a n a l y z e d u s i n g a o n e - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) a n d v a l u e s f o r P 0 . 0 5 w e r e c o n s i d e r e d s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . R E S U L T A N D D I S C U S S I O N T h e g r o w t h c u r v e o f t h e t e s t o r g a n i s m r e l a t i v e t o t h e c o n t r o l w a s c a l c u l a t e d . T h e a b s o r b a n c e o f t h e c o n t r o l a f t e r 2 4 h o u r s o f i n c u b a t i o n w a s t a k e n a s t h e m a x i m u m g r o w t h o f t h e t e s t o r g a n i s m a n d w a s a s s i g n e d t h e v a l u e o f 1 0 0 % . B a s e d o n t h i s , t h e p e r c e n t a g e g r o w t h o f t h e t e s t o r g a n i s m i n t h e d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f t h e l e a d t o x i c a n t a f t e r 2 4 h o u r s o f i n c u b a t i o n w a s c a l c u l a t e d . T h e r e s u l t i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 1 . F r o m t h e r e s u l t , i t w a s o b s e r v e d t h a t t h e g r o w t h c u r v e w a s c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t . T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o f t h e l e a d o n t h e g r o w t h c u r v e o f t h e o r g a n i s m w h e n e x p o s e d t o 1 µ g / m l a n d 1 0 µ g / m l a t P 0 . 0 5 . C o n v e r s e l y , t h e r e w a s a v e r y h i g h s i g n i f i c a n t e f f e c t o f t h e l e a d t o x i c a n t o n t h e g r o w t h c u r v e o f t h e o r g a n i s m w h e n e x p o s e d t o 1 0 0 µ g / m l a n d 5 0 0 µ g / m l c o n c e n t r a t i o n s a f t e r t h e i n c u b a t i o n p e r i o d . T h e e f f e c t w a s s o p r o n o u n c e d t h a t t h e o r g a n i s m w a s u n a b l e t o e n t e r i n t o t h e l o g a r i t h m i c p h a s e o f g r o w t h w h e n e x p o s e d t o t h e s e l e a d c o n c e n t r a t i o n s . T h e r e s u l t s o f t h e s t u d y s h o w e d t h a t t h e B a c i l l u s s p e c i e s i s c a p a b l e o f s u r v i v i n g w h e n e x p o s e d t o v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f l e a d s a l t w i t h i n 2 4 h o u r s e x p o s u r e d u r a t i o n . T h i s i s i n a c c o r d a n c e w i t h t h e w o r k s o f O d o k u m a a n d A k p o n a h ( 2 0 1 0 ) , O d o k u m a a n d I j e o m a h ( 2 0 0 3 ) , O d o k u m a a n d E m e d o l u ( 2 0 0 5 ) . I n t h e i r r e p o r t s B a c i l l u s s p . a n d A e r o m o n a s s p . w e r e s h o w n t o b e r e s i s t a n t t o t h e t o x i c i t y o f h e a v y m e t a l s . T h e p e r s i s t e n c e o f t h e s e i s o l a t e s i n t h e p r e s e n c e o f t h e r e s p e c t i v e h e a v y m e t a l s m a y b e a s a r e s u l t o f t h e p o s s e s s i o n o f h e a v y m e t a l r e s i s t a n t p l a s m i d s ( O d o k u m a a n d O l i w e , 2 0 0 3 ) . T h e s p o r e f o r m i n g a b i l i t y o f B a c i l l u s s p . m i g h t a l s o , h a v e c o n t r i b u t e d t o i t s a b i l i t y t o s u r v i v e w h e n e x p o s e d t o t h e v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f t h e h e a v y m e t a l s a l t . T h e r e s u l t o f t h e p e r c e n t a g e l o g s u r v i v a l o f t h e t e s t o r g a n i s m i n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f t h e l e a d t o x i c a n t a n d a t d i f f e r e n t i n c u b a t i o n t i m e s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 2 . A t t h e i n i t i a l h o u r o f i n c u b a t i o n , t h e t e s t o r g a n i s m h a d 1 0 0 % s u r v i v a l i n a l l t h e l e a d c o n c e n t r a t i o n s . A t s u b s e q u e n t h o u r s o f i n c u b a t i o n , t h e t e s t o r g a n i s m h a d i r r e g u l a r r a t e o f s u r v i v a l i n t h e 1 µ g / m l a n d 1 0 µ g / m l c o n c e n t r a t i o n s r e s p e c t i v e l y . W h e n e x p o s e d A k u j o b i e t a l . , 2 0 1 2 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 P e r c e n t a g e g r o w t h r e l a t i v e t o t h e c o n t r o l T i m e ( h r s ) F i g . 1 . T h e g r o w t h c u r v e o f t h e t e s t o r g a n i s m r e l a t i v e t o t h e c o n t r o l . 0 µ g / m l 1 µ g / m l 1 0 µ g / m l 1 0 0 µ g / m l 5 0 0 µ g / m l P e r c e n t a g e g r o w t h r e l a t i v e t o t h e c o n t r o l F i g . 1 . T h e g r o w t h c u r v e o f t h e t e s t O r g a n i s m r e l a t i v e t o t h e c o n t r o l F i g . 2 . P e r c e n t a g e l o g s u r v i v a l o f t h e i s o l a t e s i n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f l e a d a t d i f f e r e n t t i m e i n t e r v a l s . P e r c e n t a g e l o g s u r v i v a l L e a d C o n c e n t r a t i o n ( m g / l )

t o 1 0 0 µ g / m l a n d 5 0 0 µ g / m l , t h e r a t e o f s u r v i v a l d e c r e a s e d w i t h i n c r e a s e i n t h e t i m e o f i n c u b a t i o n . T h e e f f e c t o f l e a d c o n c e n t r a t i o n s o n t h e p e r c e n t a g e l o g s u r v i v a l o f t h e t e s t o r g a n i s m s h o w e d t h a t a t h i g h c o n c e n t r a t i o n l e a d , t h e p e r c e n t a g e l o g s u r v i v a l d e c r e a s e d w i t h i n c r e a s e i n t i m e o f e x p o s u r e . T h i s i s i n l i n e w i t h t h e w o r k s o f O d o k u m a a n d A k p o n a h , ( 2 0 1 0 ) a n d B u i k e m a e t a l . , ( 1 9 8 2 ) t h a t s h o w e d t h a t t h e p e r c e n t a g e s u r v i v a l o f t h e i r i s o l a t e s d e c r e a s e d w i t h i n c r e a s e i n c o n t a c t t i m e a s w e l l a s c o n c e n t r a t i o n w h e n e x p o s e d t o d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f h e a v y m e t a l s . T h i s s h o w e d t h a t c o n t a c t t i m e i s a v e r y c r u c i a l f a c t o r i n e s t a b l i s h i n g t h e r e s i s t a n c e o f o r g a n i s m s t o t h e t o x i c p r e s s u r e o f t h e m e t a l s . D o s e r e s p o n s e c u r v e o b t a i n e d f r o m t h e p l o t o f l e a d c o n c e n t r a t i o n ( µ g / m l ) a g a i n s t t h e b i o a c c u m u l a t i o n o f l e a d ( m g / k g ) b y t h e t e s t o r g a n i s m i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 3 . T h e l e a d c o n c e n t r a t i o n c o r r e l a t e d w e l l w i t h l e a d b i o a c c u m u l a t i o n w i t h a v e r y h i g h R 2 v a l u e ( R ² = 0 . 9 9 4 5 ) . T h e b i o a c c u m u l a t i o n m o d e l g a v e a g o o d l i n e a r i z a t i o n o f t h e d o s e - r e s p o n s e d a t a . T h e e q u a t i o n o f t h e c u r v e i s g i v e n a s l e a d c o n c e n t r a t i o n ( µ g / m l ) = 1 . 6 3 9 4 l e a d b i o a c c u m u l a t i o n ( m g / k g ) + 9 . 2 2 5 7 . T h e r e s u l t s h o w e d t h a t t h e b i o a c c u m u l a t i o n i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y w i t h i n c r e a s e i n c o n c e n t r a t i o n o f t h e l e a d t o x i c a n t w i t h t h e h i g h e s t b i o a c c u m u l a t i o n o b s e r v e d i n t h e t e s t o r g a n i s m w h e n e x p o s e d t o 5 0 0 µ g / m l c o n c e n t r a t i o n s . B i o a c c u m u l a t i o n t e s t c a r r i e d o u t r e v e a l e d t h a t B a c i l l u s s p e c i e s h a d a n i n h e r e n t c a p a b i l i t y t o w i t h s t a n d t h e t o x i c i t y o f l e a d a n d b i o a c c u m u l a t e t h e m e t a l ( O d o k u m a a n d E m e d o l u , 2 0 0 5 ) . S e v e r a l p r i n c i p a l s i t e s o f m e t a l - c o m p l e x f o r m a t i o n i n b i o l o g i c a l s y s t e m s h a v e b e e n p r o p o s e d ( V i e i r a a n d V o l e s k y , 2 0 0 0 ) . T h e s e p r o c e s s e s i n v o l v e a t y p i c a l i o n - e x c h a n g e p r o c e s s w h e r e t h e m e t a l i o n i s e x c h a n g e d f o r a c o u n t e r - i o n a t t a c h e d t o b i o m a s s . B i o l e a c h i n g i s a s i m i l a r p r o c e s s w h e r e m i c r o b e s d i s s o l v e t h e m e t a l s p r e s e n t i n s o l i d m a t r i x i n t o s o l u b l e f o r m . O t h e r s i n c l u d e a c c u m u l a t i o n i n t h e c e l l w a l l , c a r b o h y d r a t e o r p r o t e i n p o l y p h o s p h a t e c o m p l e x e s , a n d c o m p l e x i o n w i t h c a r b o x y l g r o u p s o f t h e p e p t i d o g l y c a n i n t h e c e l l w a l l . H o w e v e r , t h e r e a r e f i v e b a s i c m e c h a n i s m s t h a t c o n v e y a n i n c r e a s e d l e v e l o f c e l l u l a r r e s i s t a n c e t o m e t a l s : ( 1 ) e f f l u x o f t h e t o x i c m e t a l o u t o f t h e c e l l ; ( 2 ) e n z y m a t i c c o n v e r s i o n ; ( 3 ) i n t r a - o r e x t r a c e l l u l a r s e q u e s t r a t i o n ; ( 4 ) e x c l u s i o n b y a p e r m e a b i l i t y b a r r i e r ; a n d ( 5 ) r e d u c t i o n i n s e n s i t i v i t y o f c e l l u l a r t a r g e t s . I n t h e p r e s e n t s t u d y , i t w a s o b s e r v e d t h a t t h e r e w a s a n i n c r e a s e i n b i o a c c u m u l a t i o n w i t h i n c r e a s e i n t h e l e a d c o n c e n t r a t i o n . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t e d t h a t m e t a l u p t a k e m a y i n v o l v e d i f f u s i o n p h e n o m e n o n w h e r e b y , m e t a l i o n s m o v e f r o m r e g i o n s o f h i g h c o n c e n t r a t i o n s t o l o w c o n c e n t r a t i o n s a n d t h e f a c t t h a t t h e s t e e p e r t h e c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t , t h e m o r e r a p e d i s t h e m o v e m e n t o f m o l e c u l e s o r i o n s ( T a y l o r e t a l . , 1 9 9 7 ) o r a n y o f t h e a b o v e - m e n t i o n e d m e c h a n i s m s . T h e h i g h R 2 v a l u e s o b t a i n e d i n t h e r e g r e s s i o n p l o t i n d i c a t e d t h a t l e a d c o n c e n t r a t i o n w a s a s t r o n g d e t e r m i n a n t o f t h e b a c t e r i a l a c c u m u l a t i o n . T h e B a c i l l u s s p e c i e s c a n b e u s e d , i n t h e f u t u r e , f o r h e a v y m e t a l s r e m o v a l , i m m o b i l i z e d o n w a s t e b i o m a t e r i a l s . I n p u t o f h e a v y m e t a l s i m p o s e a s e l e c t i v e p r e s s u r e t h a t m a y f a v o r t h e g r o w t h a n d a c t i v i t y o f r e s i s t a n t / t o l e r a n t m i c r o b e s . T h e d e v e l o p m e n t o f a m e t a l - r e s i s t a n t p o p u l a t i o n i n a c o n t a m i n a t e d s o i l c a n r e s u l t f r o m : ( i ) v e r t i c a l g e n e t r a n s f e r ( r e p r o d u c t i o n ) , ( i i ) h o r i z o n t a l g e n e t r a n s f e r ( i n c l u d i n g t r a n s p o s o n s a n d b r o a d h o s t r a n g e p l a s m i d s ) , a n d ( i i i ) s e l e c t i o n p r e s s u r e s o n s p o n t a n e o u s m u t a n t s ( d u e t o t h e p r e s e n c e o f m e t a l s ) . T r a n s p o s a b l e e l e m e n t s c a r r y i n g m e r c u r y r e s i s t a n c e g e n e s J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 0 8 3 - 0 8 9 0 8 7 A k u j o b i e t a l . , 2 0 1 2 L e a d c o n c e n t r a t i o n ( µ g / m l ) L e a d b i o a c c u m u l a t i o n ( m g / k g ) F i g . 3 . L e a d b i o a c c u m u l a t i o n b y B a c i l l u s s p e c i e s i n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f l e a d

h a v e b e e n l i n k e d t o t h e d i s t r i b u t i o n o f t h i s t r a i t i n n a t u r e ( K h o s r o e t a l , 2 0 1 1 ) . T h e p r e s e n t s t u d y h a s b e e n a b l e t o s h o w t h a t m i c r o o r g a n i s m s i s o l a t e d f r o m p i g w a s t e h a v e t h e i n h e r e n t c a p a b i l i t y o f r e m o v i n g h e a v y m e t a l s f r o m h e a v y m e t a l - p o l l u t e d s o i l . I t i m p l i e s t h a t a d v e r s e e f f e c t s o f h e a v y m e t a l o n p l a n t s i n h e a v y m e t a l - p o l l u t e d s o i l c a n b e r e m e d i e d u s i n g p i g w a s t e . T h i s s e r v e s t h e d o u b l e p u r p o s e o f s u p p l y i n g n u t r i e n t s t o t h e p l a n t s w h i l e a l s o r e m o v i n g t h e h e a v y m e t a l s f r o m t h e s o i l . R E F E R E N C E S A u g u s t o C o s t a A C , P e r e i r a D u t a F . 2 0 0 1 . B i o a c c u m u l a t i o n o f c o p p e r , z i n c , c a d m i u m a n d l e a d b y B a c i l l u s S P . , B a c i l l u s c e r e u s , B a c i l l u s s p e a e r e c u s a n d B a c i l l u s s u b t i l l u s . B r a z . J . M i c r o b i o l . , 3 2 ( 1 ) : 3 2 - 5 0 . B a r k a y T , S c h a e f e r J . 2 0 0 1 . M e t a l a n d r a d i o n u c l i d e b i o r e m e d i a t i o n : i s s u e s , c o n s i d e r a t i o n s a n d p o t e n t i a l s . C u r r O p i n M i c r o b i o l . , 4 : 3 1 8 - 3 2 3 . B o o p a t h y R . 2 0 0 0 . F a c t o r s l i m i t i n g b i o r e m e d i a t i o n t e c h n o l o g i e s . B i o r e s . T e c h n o l . , 7 4 : 6 3 - 6 7 . B u i k e m a A L , N e i d e r l e h e r B R , C a i r n s J . 1 9 8 2 . B i o l o g i c a l m o n i t o r i n g p a r t I V t o x i c i t y t e s t i n g . W a t . R e s . , 1 6 : 2 3 0 - 2 6 2 . C a s a r e t t L J , K l a a s s e n C D a n d D o u l l J . 2 0 0 7 . B i o l o g i c a l a n d h e a l t h e f f e c t s o f l e a d p o l l u t i o n . W a t . S c i . T e c h n o l . , 2 9 : 1 5 2 - 1 6 1 . D a C o s t a A C A . 1 9 9 9 . C h e m i c a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n m e r c u r i a l s p e c i e s a n d s u r f a c e b i o m o l e c u l e s f r o m s t r u c t u r a l c o m p o n e n t s o f s o m e b i o l o g i c a l s y s t e m s . I n : E b i n g h a u s , W . , L a c e r d a , L . D . a n d S a l o m o n s , W . ( e d s . ) . M e r c u r y C o n t a m i n a t e d S i t e s : R i s k A s s e s s m e n t a n d S o l u t i o n s , E n v i r o n m e n t a l S c i e n c e S e r i e s , C h a p t e r I - 8 , S p r i n g e r - V e r l a g , H e i l d e l b e r g . 1 5 9 - 1 7 8 . F e i n J B . 2 0 0 0 . Q u a n t i f y i n g t h e e f f e c t o f b a c t e r i a o n a d s o r p t i o n r e a c t i o n s i n w a t e r r o c k s y s t e m s . C h e m . G e o l . , 1 6 9 : 2 6 5 - 8 0 . H o l t J G , K r i e g N R , S n e a t h P H A , S t a l e y J T a n d W i l l i a m s T . 1 9 9 4 . B e r g e y s M a n u a l o f D e t e r m i n a t i v e B a c t e r i o l o g y . 9 t h e d . W i l l i a m s a n d W i l k i n s , B a l t i m o r e , U S A . 1 - 1 2 . J i G Y . 1 9 9 5 . S i l v e r S . N e w e r s y s t e m s f o r b a c t e r i a l r e s i s t a n c e t o t o x i c h e a v y m e t a l s . J . I n d . M i c r o b i o l . , 1 4 : 6 1 - 7 5 . K h o s r o I , M o h a m m a d R M P a n d A l i r e z a M . 2 0 1 1 . B i o r e m e d i a t i o n o f t o x i c h e a v y m e t a l s p o l l u t a n t s b y B a c i l l u s s p p . i s o l a t e d f r o m G u i l a n B a y s e d i m e n t s , N o r t h o f I r a n . I n t . C o n . B i o t e c h n o l . E n v i r o n . M a n . , 1 8 : 6 7 - 7 1 . L e d i n M . 2 0 0 0 . B i o a c c u m u l a t i o n o f m e t a l b y m i c r o o r g a n i s m s - p r o c e s s e s a n d i m p o r t a n c e f o r s o i l s y s t e m s . E a r t h S c i R e v . , 5 1 : 1 - 3 1 . M a l i k A . 2 0 0 4 . M e t a l b i o r e m e d i a t i o n t h r o u g h g r o w i n g c e l l s . E n v i r o n I n t . , 3 0 : 2 6 1 - 2 7 8 . N i e s D H , S i l v e r S . 1 9 9 5 . I o n e f f l u x s y s t e m s i n v o l v e d i n b a c t e r i a l m e t a l r e s i s t a n c e s . J . I n d . M i c r o b i o l . , 1 4 : 1 8 6 - 9 9 . N i e s D H . 1 9 9 2 . R e s i s t a n c e t o c a d m i u m , c o b a l t , z i n c a n d n i c k e l i n m i c r o b e s . P l a s m i d 2 7 : 1 7 - 2 8 . N i e s D H . 1 9 9 9 . M i c r o b i a l h e a v y m e t a l r e s i s t a n c e . A p p l M i c r o b i o l B i o t e c h n o l . , 5 1 : 7 3 0 - 7 5 0 . O d o k u m a L O , A k p o n a h E . 2 0 1 0 . E f f e c t o f n u t r i e n t s u p p l e m e n t a t i o n o n b i o d e g r a d a t i o n a n d m e t a l u p t a k e b y t h r e e b a c t e r i a i n c r u d e o i l i m p a c t e d f r e s h a n d b r a c k i s h w a t e r s o f t h e N i g e r D e l t a . J . C e l l A n i m a l B i o l . , 4 ( 1 ) : 1 - 1 8 . O d o k u m a L O , E m e d o l u S N . 2 0 0 5 . B a c t e r i a l s o r b e n t s o f h e a v y m e t a l s a s s o c i a t e d w i t h t w o N i g e r i a n C r u d e O i l s . G l o b . J . P u r . A p p l . S c i . , 1 1 ( 3 ) : 3 4 3 - 3 5 1 . O d o k u m a L O , I j e o m a h S O . 2 0 0 3 . T o l e r a n c e o f b a c t e r i a t o t o x i c i t y o f h e a v y m e t a l s i n t h e N e w C a l a b a r 0 8 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 0 8 3 - 0 8 9 A k u j o b i e t a l . , 2 0 1 2

R i v e r . G l o b . J . E n v i r o n . S c i . , 2 ( 2 ) : 1 2 8 - 1 3 2 . O d o k u m a L O , O l i w e S I . 2 0 0 3 . T o x i c i t y o f s u b s t i t u t e d b e n z e n e d e r i v a t i v e s t o f o u r c h e m o l i t h o t r o p i c b a c t e r i a i s o l a t e s f r o m t h e N e w C a l a b a r R i v e r , N i g e r i a . G l o b . J . E n v i r o n . S c i . , 2 ( 2 ) : 7 2 - 7 6 . T a y l o r D J , G r e e n N P O , S t o u t G W . 1 9 9 7 . B i o l o g i c a l S c i e n c e s . 3 r d e d . C a m b r i d g e U n i v e r s i t y P r e s s 9 8 3 . V i e i r a H S F , V o l e s k y B . 2 0 0 0 . B i o s o r p t i o n : A s o l u t i o n t o p o l l u t i o n ? I n t . M i c r o b i o l . , 3 : 1 7 - 2 4 . W h i t e L O , C o r y S h e c h t a D A , G i b l e t M E , T i f f a n y J , C a s t i g I i o n i E , Z a w i a N H , V i r g i l i a n M , R o s s - G e o r g e A a n d L e s l e y S M . 2 0 0 7 . N e w a n d e v o l v i n g c o n c e p t o f t h e N e u r o t o x i c o l o g y o f L e a d . I n d i a n J . M e d . R e s . , 2 2 5 ( 1 ) : 1 - 2 7 . Y u M H . 2 0 0 5 . S o i l a n d w a t e r p o l l u t i o n : E n v i r o n m e n t a l m e t a l s a n d m e t a l l o i d s . E n v i r o n . h e a l t h p e r s p . , 1 1 5 ( 3 ) : 4 7 2 - 8 2 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 0 8 3 - 0 8 9 0 8 9 A k u j o b i e t a l . , 2 0 1 2 S u b m i t y o u r a r t i c l e s o n l i n e a t F i c u s p u b l i s h e r s . c o m A d v a n t a g e s E a s y o n l i n e s u b m i s s i o n C o m p l e t e P e e r r e v i e w A f f o r d a b l e C h a r g e s Q u i c k p r o c e s s i n g E x t e n s i v e i n d e x i n g O p e n A c c e s s a n d Q u i c k s p r e a d i n g Y o u r e t a i n s y o u r c o p y r i g h t s u b m i t @ f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m / s u b m i t 1 . a s p x .