J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y G e n e t i c d i v e r s i t y a s s e s s m e n t i n n i n e c u l t i v a r s o f C a t h a r a n t h u s r o s e u s f r o m C e n t r a l G u j a r a t ( I n d i a ) t h r o u g h R A P D , I S S R a n d S S R m a r k e r s K e y w o r d s : G e n e t i c d i v e r s i t y , R A P D , I S S R , S S R , C a t h a r a n t h u s r o s e u s . A b b r e v i a t i o n s : R a n d o m a m p l i f i e d p o l y m o r p h i c D N A ( R A P D ) , I n t e r s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t s ( I S S R ) , S i m p l e s e q u e n c e r e p e a t s ( S S R ) , b a s e p a i r ( b p ) . A B S T R A C T : T h e g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s t u d y w a s c a r r i e d o u t a m o n g n i n e d i f f e r e n t c u l t i v a r s o f C a t h a r a n t h u s r o s e u s u s i n g R A P D , I S S R a n d S S R m a r k e r s . I n R A P D a n a l y s i s , o u t o f t w e n t y p r i m e r s , s i x p r i m e r s a m p l i f i e d 5 9 2 b a n d s o u t o f w h i c h 4 6 6 w e r e p o l y m o r p h i c w h i l e r e s t w a s m o n o m o r p h i c . T h i s g a v e h i g h ( 7 8 . 7 1 % ) p o l y m o r p h i s m a m o n g n i n e c u l t i v a r s . I n I S S R a n a l y s i s , 7 8 . 9 4 % p o l y m o r p h i s m w a s o b s e r v e d , w h i l e i n S S R a n a l y s i s , 7 6 . 6 2 % p o l y m o r p h i s m w a s o b s e r v e d . T h e d e n d o g r a m b a s e d o n a l l t h r e e m a r k e r s s e p a r a t e d t h e c u l t i v a r s i n t w o m a j o r g r o u p s . ‘ B l u e p e a r l ’ , ’ c o o l e r r e d ’ , a n d ‘ p a c i f i c a a p r i c o t ’ w e r e i n t h e s a m e g r o u p , w h i l e r e s t w a s i n o t h e r g r o u p . A m o n g s t a l l ‘ P a c i f i c a l i a c ’ a n d ‘ A l b u s w i t h r e d e y e ’ w e r e f o u n d t o b e c l o s e l y r e l a t e d . O u r r e s u l t s s h o w e d t h a t a l l R A P D , I S S R a n d S S R m a r k e r s a r e s e n s i t i v e a n d e f f e c t i v e t o o l f o r g e n o m i c a n a l y s i s i n C a t h a r a n t h u s r o s e u s . T h i s s t u d y p r o v i d e s k e y p l a t f o r m f o r f u r t h e r c r o p i m p r o v e m e n t a n d c r o s s b r e e d i n g . 6 6 7 - 6 7 5 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 8 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : S a n j a y L a l , K i n n a r i N . M i s t r y , S m i t D . S h a h , R i d d h i T h a k e r , P a r t h B . V a i d y a . I n s t i t u t i o n : A s h o k & R i t a P a t e l I n s t i t u t e o f I n t e g r a t e d S t u d i e s i n B i o t e c h n o l o g y & A l l i e d S c i e n c e s ( A R I B A S ) , N e w V a l l a b h V i d h y a N a g a r – 3 8 8 1 2 1 ( G u j a r a t ) I n d i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : S a n j a y L a l W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 1 6 3 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 9 D e c 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 1 5 D e c 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 3 0 D e c 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : S a n j a y L a l , K i n n a r i N . M i s t r y , S m i t D . S h a h , R i d d h i T h a k e r , P a r t h B . V a i d y a . G e n e t i c d i v e r s i t y a s s e s s m e n t i n n i n e c u l t i v a r s o f C a t h a r a n t h u s r o s e u s f r o m C e n t r a l G u j a r a t ( I n d i a ) t h r o u g h R A P D , I S S R a n d S S R m a r k e r s . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 8 : 6 6 7 - 6 7 5 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h P a p e r

I N T R O D U C T I O N C a t h a r a n t h u s r o s e u s ( L . ) G . D o n ( f a m i l y A p o c y n a c e a e ) i s a b e a u t i f u l o r n a m e n t a l p l a n t w i t h e n o r m o u s m e d i c i n a l v a l u e s . I n I n d i a , i t ‟ s c o m m o n l y k n o w n a s “ p e r i w i n k l e ” , “ s a d a b a h a r ” , “ s a d a p h u l ” , o r “ b a r m a s i ” . C a t h a r a n t h u s r o s e u s ( V i n c a r o s e a ) i s n a t i v e t o M a d a g a s c a r a n d s p r e a d t h r o u g h o u t t h e t r o p i c s a n d s u b t r o p i c s ( R K S h a w e t a l . , 2 0 1 0 ) . T h e p l a n t i s k n o w n t o h a v e m o r e t h a n 7 0 d i f f e r e n t a l k a l o i d s l i k e a j m a l i c i n e , v i n c r y s t i n e , v i n b l a s t i n e e t c . T h e s e a l k a l o i d s c o n t r i b u t e t o a n t i c a n c e r a n d a n t i d i a b e t i c a c t i v i t y o f p l a n t . C a t h a r a n t h u s r o s e u s h a s b e e n u s e d t r a d i t i o n a l l y f o r i t s c a l m i n g e f f e c t a n d i t s a b i l i t y t o r e d u c e t h e b l o o d p r e s s u r e ( F l o r a o f C h i n a : C a t h a r a n t h u s r o s e u s ) . A s s e s s m e n t o f g e n e t i c d i v e r s i t y i n c r o p s p e c i e s i s a n i m p o r t a n t c o m p o n e n t o f c r o p i m p r o v e m e n t p r o g r a m s . A c c u r a t e a n a l y s i s o f t h e g e n e t i c d i v e r s i t y c a n b e u s e f u l i n p l a n t b r e e d i n g . T h e d e t a i l e d u n d e r s t a n d i n g o f r e l a t i o n s h i p b e t w e e n i n b r e d l i n e s a n d p u r e l i n e s c a n b e u s e f u l i n p l a n n i n g c r o s s e s ( H a l l a u e r a n d M i r a n d a , 1 9 8 8 ) . A n a l y s i s o f g e n e t i c d i v e r s i t y i n g e r m p l a s m c o l l e c t i o n c a n f a c i l i t a t e r e l i a b l e c l a s s i f i c a t i o n o f a c c e s s i o n s a n d i d e n t i f i c a t i o n o f s u b s p e c i e s w h i c h c a n b e f u r t h e r u s e f u l f o r p l a n t b r e e d i n g . V a r i o u s m a r k e r s y s t e m s h a v e b e e n u s e d f o r g e n e t i c s t u d i e s a n d c h a r a c t e r i z a t i o n a n a l y s i s . T h e s e i n c l u d e m o r p h o l o g i c a l , c y t o l o g i c a l , b i o c h e m i c a l a n d D N A m a r k e r s y s t e m s . D N A m a r k e r s a r e c o n s i d e r e d t h e b e s t t o o l s f o r d e t e r m i n i n g g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s / d i v e r s i t y , a s t h e y a r e u n l i m i t e d i n n u m b e r , s h o w h i g h p o l y m o r p h i s m a n d a r e i n d e p e n d e n t o f e n v i r o n m e n t a l i n t e r a c t i o n i . e . , h i g h l y h e r i t a b l e ( S i n g h e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e r e a r e v a r i o u s t y p e s o f D N A m a r k e r s l i k e R e s t r i c t i o n F r a g m e n t L e n g t h P o l y m o r p h i s m ( R F L P , S a m b r o o k e t a l . , 1 9 8 9 ) , V a r i a b l e N u m b e r o f T a n d e m R e p e a t s ( V N T R s , N a k a m u r a e t a l . , 1 9 8 7 ) , S i m p l e S e q u e n c e R e p e a t s ( S S R s , J a c o b e t a l . , 1 9 9 1 ) , I n t e r S i m p l e S e q u e n c e R e p e a t s ( I S S R , Z i e t k i e w i c z e t a l . , 1 9 9 4 ) a n d R a n d o m A m p l i fi e d P o l y m o r p h i c D N A ( R A P D , W i l l i a m s e t a l . , 1 9 9 0 ) . A m o n g s t a l l t h e s e t e c h n i q u e s , R A P D t e c h n i q u e h a s g a i n e d i m p o r t a n c e d u e t o i t s s i m p l i c i t y , e f fi c i e n c y , r e l a t i v e e a s e t o p e r f o r m a n d n o n - r e q u i r e m e n t o f D N A s e q u e n c e i n f o r m a t i o n ( K a r p e t a l . , 1 9 9 7 ; K h a n u j a e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h e t e c h n i q u e h a s b e e n v e r y u s e f u l i n s t u d i e s o f g e n e t i c d i v e r s i t y ( O r o z c o - C a s t i l l o e t a l . , 1 9 9 4 ; C h a l m e r s e t a l . , 1 9 9 4 ) , p h y l o g e n y a n d s y s t e m a t i c ( M i l l a n e t a l . , 1 9 9 6 ; S u n e t a l . , 1 9 9 8 ) , g e n e t i c l i n k a g e m a p p i n g ( C h e u n g e t a l . , 1 9 9 7 ) a n d g e n e t a g g i n g ( T i w a r i e t a l . , 1 9 9 8 ) . S S R a n d I S S R m a r k e r s a r e a l s o b e i n g w i d e l y u s e d t o s t u d y g e n e t i c d i v e r s i t y i n n u m b e r o f p l a n t s p e c i e s . T h e c u r r e n t i n v e s t i g a t i o n w a s c a r r i e d o u t w i t h t h e a i m t o s t u d y t h e g e n e t i c d i v e r s i t y a m o n g C . r o s e u s c u l t i v a r s u s i n g R A P D , I S S R a n d S S R m a r k e r s . M A T E R I A L A N D M E T H O D S P l a n t m a t e r i a l N i n e d i f f e r e n t c u l t i v a r s o f C a t h a r a n t h u s r o s e u s w e r e c o l l e c t e d f o r t h i s s t u d y . A l l s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f r o m n e a r b y a r e a o f A n a n d , G u j a r a t , I n d i a ( T a b l e - 1 ) . F r e s h a n d y o u n g l e a v e s w e r e c o l l e c t e d t o i s o l a t e t h e D N A . G e n o m i c D N A i s o l a t i o n T h e g e n o m i c D N A w a s i s o l a t e d f r o m y o u n g l e a v e s b y s t a n d a r d C T A B ( C e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m b r o m i d e ) m e t h o d ( D o y l e a n d D o y l e , 1 9 9 0 ) w i t h s l i g h t m o d i f i c a t i o n s . S l i g h t h i g h e r 6 6 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 8 : 6 6 7 - 6 7 5 L a l e t a l . , 2 0 1 1 N o . C u l t i v a r n a m e C o l o u r o f p e t a l I m a g e 1 P a t r i c i a w h i t e M i l k y w h i t e 2 G r a p e c o o l e r L i g h t p i n k 3 C o o l e r r e d C h e r r y r e d 4 P e p p e r m i n t c o o l e r W h i t e w i t h r e d c e n t e r 5 P a c i f i c a a p r i c o t W h i t i s h p i n k 6 C o o l e r o r c h i d D a r k p i n k w i t h w h i t e e y e 7 P a c i f i c a l i a c D a r k p i n k 8 A l b u s w i t h r e d e y e M i l k y w h i t e w i t h r a d i a t i n g r e d e y e 9 B l u e p e a r l P u r p l e T a b l e - 1 : N a m e , P e t a l c o l o r a n d I m a g e s o f n i n e c u l t i v a r s o f C a t h a r a n t h u s r o s e u s ( L . ) G . D o n

c o n c e n t r a t i o n o f d e t e r g e n t w a s u s e d . R N A w a s r e m o v e d b y g i v i n g R N a s e A t r e a t m e n t w h i c h w a s g i v e n a f t e r i n c u b a t i o n a t 6 5 0 C i n b o i l i n g w a t e r b a t h . T h e i s o l a t e d D N A w a s d i s s o l v e d i n 2 5 µ l o f T 1 0 E 1 b u f f e r ( T r i s 1 0 m M a n d E D T A 1 m M , p H 8 . 0 ) . T h e D N A w a s c h e c k e d t h r o u g h a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d t h e q u a n t i t y a n d p u r i t y w a s c h e c k e d b y N a n o d r o p - 1 0 0 0 ( T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c , U S A ) . R a n d o m A m p l i f i e d P o l y m o r p h i c D N A ( R A P D ) a n a l y s i s T h e R A P D a n a l y s i s w a s c a r r i e d o u t u s i n g t h e m e t h o d o f W i l l i a m s e t a l . , ( 1 9 9 0 ) . P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n s w e r e p e r f o r m e d i n 2 5 µ l s y s t e m c o n t a i n i n g 2 . 5 µ l o f 1 0 X a s s a y b u f f e r ( 1 0 m M T r i s - C l ; p H 9 . 0 , 1 . 5 m M M g C l 2 , 5 0 m M K C l a n d 0 . 0 1 % g e l a t i n ) , 2 . 5 m M o f e a c h d N T P s ( d A T P , d T T P , d C T P a n d d G T P ) ( B a n g a l o r e G e n e i P v t . L t d , B a n g a l o r e , I n d i a ) , 1 . 5 µ M o f p r i m e r ( S i g m a A l d r i c h , B a n g a l o r e ) , 0 . 2 u n i t o f T a q D N A p o l y m e r a s e ( B a n g a l o r e G e n e i P v t . L t d , B a n g a l o r e , I n d i a ) a n d 2 5 n g o f t e m p l a t e D N A . T h e r e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t u s i n g t h e r m o c y c l e r ( C o r b e t t r e s e a r c h g r a d i e n t a u t o m a t i c , U K ) . R e a c t i o n w a s c a r r i e d p u t i n t h r e e s t e p s . T h e f i r s t s t e p o f i n i t i a l d e n a t u r a t i o n w a s p e r f o r m e d a t 9 4 0 C f o r 5 m i n . F o l l o w i n g t h e i n i t i a l d e n a t u r a t i o n s t e p , P C R w a s c a r r i e d o u t f o r 4 5 c y c l e s . E a c h c y c l e s c o n s i s t e d o f a d e n a t u r a t i o n s t e p o f 1 m i n a t 9 2 0 C , a n n e a l i n g s t e p o f 1 m i n a t 3 7 0 C a n d a n e x t e n s i o n s t e p o f 2 m i n a t 7 2 0 C . T h e l a s t c y c l e w a s f o l l o w e d b y f i n a l e x t e n s i o n s t e p o f 7 m i n a t 7 2 0 C . T h e h o l d i n g t e m p e r a t u r e w a s 4 0 C . I n t e r S i m p l e S e q u e n c e R e p e a t ( I S S R ) a n a l y s i s I n I S S R a n a l y s i s , t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n s w e r e p e r f o r m e d i n 2 5 µ l s y s t e m c o n t a i n i n g 2 . 5 µ l o f 1 0 X a s s a y b u f f e r ( 1 0 m M T r i s - C l ; p H 9 . 0 , 1 . 5 m M M g C l 2 , 5 0 m M K C l a n d 0 . 0 1 % g e l a t i n ) , 2 . 5 m M o f e a c h d N T P s ( d A T P , d T T P , d C T P a n d d G T P ) ( B a n g a l o r e G e n e i P v t . L t d , B a n g a l o r e , I n d i a ) , 1 . 5 µ M o f p r i m e r ( S i g m a A l d r i c h , B a n g a l o r e ) , 0 . 2 u n i t o f T a q D N A p o l y m e r a s e ( B a n g a l o r e G e n e i P v t . L t d , B a n g a l o r e , I n d i a ) a n d 2 5 n g o f t e m p l a t e D N A . T h e r e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t u s i n g t h e r m o c y c l e r ( C o r b e t t r e s e a r c h g r a d i e n t a u t o m a t i c , U K ) . R e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t i n t h r e e s t e p s . T h e f i r s t s t e p o f i n i t i a l d e n a t u r a t i o n w a s p e r f o r m e d a t 9 4 0 C f o r 5 m i n . F o l l o w i n g t h e i n i t i a l d e n a t u r a t i o n s t e p , P C R w a s c a r r i e d o u t f o r 4 0 c y c l e s . E a c h c y c l e s c o n s i s t e d o f a d e n a t u r a t i o n s t e p o f 1 m i n a t 9 4 0 C , a n n e a l i n g s t e p o f 1 m i n a t v a r i o u s a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s ( T a b l e - 3 ) a n d a n e x t e n s i o n s t e p o f 2 m i n a t 7 2 0 C . T h e l a s t c y c l e w a s f o l l o w e d b y f i n a l e x t e n s i o n s t e p o f 7 m i n a t 7 2 0 C . T h e h o l d i n g t e m p e r a t u r e w a s 4 0 C . S i m p l e S e q u e n c e R e p e a t s ( S S R ) I n S S R a n a l y s i s , t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n s w e r e p e r f o r m e d i n 2 5 µ l s y s t e m c o n t a i n i n g 2 . 5 µ l o f 1 0 X a s s a y b u f f e r ( 1 0 m M T r i s - C l ; p H 9 . 0 , 1 . 5 m M M g C l 2 , 5 0 m M K C l a n d 0 . 0 1 % g e l a t i n ) , 2 . 5 m M o f e a c h d N T P s ( d A T P , d T T P , d C T P a n d d G T P ) ( B a n g a l o r e G e n e i P v t . L t d , B a n g a l o r e , I n d i a ) , 1 . 5 µ M o f p r i m e r ( S i g m a A l d r i c h , B a n g a l o r e ) , 0 . 2 u n i t o f T a q D N A p o l y m e r a s e ( B a n g a l o r e G e n e i P v t . L t d , B a n g a l o r e , I n d i a ) a n d 2 5 n g o f t e m p l a t e D N A . T h e r e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t u s i n g t h e r m o c y c l e r ( C o r b e t t r e s e a r c h g r a d i e n t a u t o m a t i c , U K ) . R e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t i n t h r e e s t e p s . T h e f i r s t s t e p o f i n i t i a l d e n a t u r a t i o n w a s p e r f o r m e d a t 9 4 0 C f o r 5 m i n . F o l l o w i n g t h e i n i t i a l d e n a t u r a t i o n s t e p , P C R w a s c a r r i e d o u t f o r 4 0 c y c l e s . E a c h c y c l e s c o n s i s t e d o f a d e n a t u r a t i o n s t e p o f 1 m i n a t 9 4 0 C , a n n e a l i n g s t e p o f 1 m i n a t v a r i o u s a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s ( T a b l e - 4 ) a n d a n e x t e n s i o n s t e p o f 2 m i n a t 7 2 0 C . T h e l a s t c y c l e w a s f o l l o w e d b y f i n a l e x t e n s i o n s t e p o f 7 m i n a t 7 2 0 C . T h e h o l d i n g t e m p e r a t u r e w a s 4 0 C . A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s T h e a m p l i f i e d p r o d u c t s w e r e c h e c k e d o n g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 1 . 5 % a g a r o s e g e l f o r R A P D a n d 2 % f o r I S S R a n d S S R ) . T h e e l e c t r o p h o r e s i s w a s p e r f o r m e d f o r f o u r h o u r s a t a c o n s t a n t v o l t a g e o f 1 0 0 v o l t s . T h e b a n d s w e r e v i s u a l i z e d u n d e r U . V . l i g h t a n d t h e p h o t o g r a p h s w e r e t a k e n b y g e l d o c u m e n t a t i o n s y s t e m ( A l p h a I n n o t e c h , A l p h a I m a g e r E P , U S A ) . 1 0 0 b p l a d d e r w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e s i z e o f t h e a m p l i c o n s . D a t a s c o r i n g a n d s t a t i s t i c a l a n a l y s i s T h e b a n d w a s s c o r e d „ 1 ‟ f o r i t s p r e s e n c e a n d „ 0 ‟ f o r i t s a b s e n c e . T h i s d a t a w e r e u s e d t o c o n s t r u c t t h e b i n a r y m a t r i x . T h e J a c c a r d ‟ s c o e f f i c i e n t ( J a c c a r d , 1 9 0 8 ) w a s u s e d t o c o n s t r u c t t h e s i m i l a r i t y m a t r i x a m o n g t h e n i n e c u l t i v a r s o f C a t h a r a n t h u s r o s e u s . T h e p h y l o g r a m w a s c o n s t r u c t e d u s i n g t h e u n w e i g h t e d p a i r g r o u p m e t h o d u s i n g a r i t h m e t i c m e a n s ( U P G M A ) ( S n e a t h a n d S o k a l , 1 9 7 3 ) a n d S A H N c l u s t e r i n g . T h e e n t i r e a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d u s i n g t h e N T S Y S - p c ( N u m e r i c a l t a x o n o m y s y s t e m , a p p l i e d b i o s t a t i s t i c s , I n c . , N e w Y o r k , U S A , s o f t w a r e v e r s i o n 2 . 0 2 e ) ( R o h l f , 1 9 9 7 ) . T h e p o l y m o r p h i s m i n f o r m a t i o n c o n t e n t ( P I C ) v a l u e w a s c a l c u l a t e d a s P I C = 1 - ∑ P 2 i ; P i i s t h e b a n d f r e q u e n c y o f t h e i t h a l l e l e ( S m i t h e t a l . , 1 9 9 7 ) . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 8 : 6 6 7 - 6 7 5 6 6 9 L a l e t a l . , 2 0 1 1