J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y I n v i t r o r e g e n e r a t i o n o f P a s s i f l o r a f o e t i d a l . K e y w o r d s : P a s s i f l o r a f o e t i d a , M S m e d i u m , B A P , I A A . A B S T R A C T : P a s s i f l o r a f o e t i d a i s a n a n g i o s p e r m p l a n t w i t h h i g h m e d i c i n a l v a l u e a n d i s b e c o m i n g l e s s i n n a t u r a l c o m m u n i t i e s . I t i s u s e d a s a b a c t e r i o c i d e , a n t i d y s e n t r i c a n d a n t i l i t h i c . A q u e o u s e x t r a c t s o f l e a v e s o r w h o l e p l a n t s h a v e b e e n u s e d t o t r e a t c o l i c , c o l d s , d i a r r h e a , a s t h m a , a n d s l e e p i n g p r o b l e m s . P . f o e t i d a h a s q u i c k a n d e f f e c t i v e a c t i o n i n b u r n w o u n d s a n d i s r e c o m m e n d e d b y B r a z i l i a n D r u g s c e n t r e a s a n a n t i r h e u m a t i c . T h e p r e s e n t s t u d y r e p o r t a n e f f i c i e n t i n v i t r o r e g e n e r a t i o n p r o t o c o l b y u s i n g l e a f , n o d e , i n t e r n o d e a n d s h o o t t i p e x p l a n t s f o r t h i s s p e c i e s . E x p l a n t s a r e s u r f a c e s t e r i l i z e d a n d i n o c u l a t e d i n t o c u l t u r e m e d i u m w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n o f g r o w t h r e g u l a t o r s . T h e s h o o t t i p d e r i v e d c a l l u s e f f e c t i v e l y ( 7 6 % ) p r o d u c e d s h o o t s i n t h e M S m e d i u m c o n t a i n i n g B A P a n d N A A a t 3 . 0 a n d 0 . 5 m g / l r e s p e c t i v e l y . T h e n o d a l a n d s h o o t t i p s e g m e n t s d e r i v e d s h o o t s a n d r o o t e d e f f e c t i v e l y ( 7 0 % & 8 0 % ) i n t h e b a s a l m e d i u m c o n t a i n i n g t h e a u x i n , I B A a n d I A A a l o n e a t 1 . 0 m g / l r e s p e c t i v e l y . T h e n o d a l c a l l u s d e r i v e d i n v i t r o r o o t e d s h o o t s r e s p o n d e d w e l l ( 9 2 % ) i n t h e h a r d e n i n g m e d i u m . 6 5 3 - 6 5 9 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 8 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : K o m a t h i S 1 , R a j a l a k s h m i G 1 , S a v e t h a S 2 a n d A y y a p p a d a s M P 2 . I n s t i t u t i o n : 1 . D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , H i n d u s t a n C o l l e g e o f A r t s & S c i e n c e . 2 . D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , R . V . S C o l l e g e o f A r t s a n d s c i e n c e S u l u r , C o i m b a t o r e - 4 0 2 . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : K o m a t h i S E m a i l : k o m a t h i p o l u r @ g m a i l . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 1 5 8 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 1 D e c 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 1 2 D e c 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 2 6 D e c 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : K o m a t h i S , R a j a l a k s h m i G , S a v e t h a S a n d A y y a p p a d a s M P . I n v i t r o r e g e n e r a t i o n o f P a s s i f l o r a f o e t i d a l . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 8 : 6 5 3 - 6 5 9 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h P a p e r

I N T R O D U C T I O N I n d i a f o r m a n y y e a r s h a s e n j o y e d a m o d e r a t e h a r v e s t o f p u r p l e p a s s i o n f r u i t i n t h e n i l g i r i s i n t h e S o u t h a n d i n v a r i o u s p a r t s o f n o r t h e r n I n d i a . P a s s i o n f r u i t i s a n e x o t i c a n d f a s t - g r o w i n g p e r e n n i a l . I t i s a c r e e p i n g v i n e l i k e o t h e r m e m b e r s o f t h e g e n u s , a n d y i e l d s a n e d i b l e f r u i t . T h e s p e c i f i c n a m e , f o e t i d a m e a n s “ s t i n k i n g ” i n L a t i n a n d r e f e r s t o t h e s t r o n g a r o m a e m i t t e d b y d a m a g e d f o l i a g e ( F l a v i a G u z z o e t a l . , 2 0 0 4 ) . I t g r o w s a s m u c h a s 3 0 f t ( 1 0 m ) t a l l , w i t h a t h i c k , w o o d y s t e m . T h e s t e m s a r e t h i n a n d w i r y , c o v e r e d w i t h m i n u t e s t i c k y y e l l o w h a i r s ( F i g u r e . 1 ) . T h e l e a v e s a r e h e a r t s h a p e d t h r e e - t o f i v e l o b e d , a l t e r n a t e , a r r a n g e d h e l i c a l l y , w i t h l o n g - s t a l k e d g l a n d s a n d l o n g f i n e h a i r s o n m a r g i n s , p r o d u c i n g a d i s a g r e e a b l e s m e l l w h e n c r u s h e d . T h e f l o w e r s a r e w h i t e t o p a l e c r e a m c o l o u r e d , a b o u t 5 - 6 c m i n d i a m e t e r a n d b i s e x u a l . P a s s i o n f r u i t i s m a i n l y u s e d i n j a m s , j e l l i e s , a n d f r u i t j u i c e s . I t i s u s e d f o r m e d i c i n a l p u r p o s e s a s a s e d a t i v e , a s w e l l a s a f o o d s o u r c e . I t i s u s e d f o r m o o d d i s o r d e r s ( d e p r e s s i o n , a n x i e t y , a n d s t r e s s ) . Y o u n g l e a v e s a n d p l a n t t i p s a r e e d i b l e . D r y l e a v e s a r e u s e d i n V i e t n a m e s e f o l k m e d i c i n e t o r e l i e v e s l e e p i n g p r o b l e m s . T h e w h o l e p l a n t i s u s e d i n t h e t r e a t m e n t o f i n s o m n i a a n d a n x i e t y . I n I n d i a , i t i s t r a d i t i o n a l l y u s e d f o r d i a r r h e a , t h r o a t a n d e a r i n f e c t i o n s , l i v e r d i s o r d e r s , t u m o r s , i t c h e s , f e v e r , s k i n d i s e a s e s a n d f o r w o u n d d r e s s i n g ( A . G . I n g a l e e t a l . , 2 0 1 0 ) . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S I n v i t r o r e g e n e r a t i o n T h e a p p l i c a t i o n o f t i s s u e c u l t u r e t e c h n o l o g y f o r t h e e s t a b l i s h m e n t o f i n v i t r o r e g e n e r a t i o n o f t h e s t u d y s p e c i e s h a s b e e n d o n e b y f o l l o w i n g t h e m e t h o d s a s d e s c r i b e d b e l o w . S o u r c e s o f p l a n t m a t e r i a l s H e a l t h y p l a n t , P a s s i f l o r a f o e t i d a w e r e c o l l e c t e d f r o m t h e h a b i t a t o f o c c u r r e n c e o f i n a n d a r o u n d C o i m b a t o r e d i s t r i c t . E x p l a n t s e l e c t i o n a n d s t e r i l i z a t i o n H e a l t h y a n d i m m a t u r e l e a v e s s h o o t t i p , n o d a l a n d i n t e r m o d a l s e g m e n t s o f t h i s s p e c i e s w e r e u s e d a s e x p l a n t s . T h e s e s e g m e n t s w e r e w a s h e d u n d e r r u n n i n g t a p w a t e r f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h a s u r f a c t a n t , t w e e n 2 0 ( 5 % w / v ) f o r f i v e m i n u t e s . A f t e r r e p e a t e d w a s h e s i n d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r , t o e l i m i n a t e t h e f u n g a l c o n t a m i n a t i o n e x p l a n t s w e r e t r e a t e d w i t h t h e c a r b e n d a z i m ( 5 0 % w / v ) , a n d w i t h f u n g i c i d e ( 1 0 % ) a l s o f o r 1 5 m i n u t e s a n d r i n s e d w i t h d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r 2 o r 3 t i m e s . T o e l i m i n a t e b a c t e r i a l c o n t a m i n a t i o n e x p l a n t s w e r e a l s o t r e a t e d w i t h 5 % a n t i b i o t i c s ( A m p i c i l l i n a n d R i b a m p i c i n ) f o r 3 0 m i n u t e s f o l l o w e d b y t h r e e r i n s e s i n s t e r i l e d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r ( S h e k h a w a t , M . S . e t a l . , 2 0 0 7 ) . F u r t h e r m o r e , s u r f a c e s t e r i l i z a t i o n w a s c a r r i e d o u t b y d i p p i n g t h e e x p l a n t s i n 0 . 1 % m e r c u r i c c h l o r i d e f o r 3 m i n u t e s f o l l o w e d b y 3 - 4 r i n s e s i n s t e r i l i z e d d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r . C u l t u r e m e d i u m a n d i t s c o m p o s i t i o n M S ( M u r a s h i g e a n d S k o o g , 1 9 6 2 ) b a s a l m e d i u m c o n t a i n s 3 % s u c r o s e s o l i d i f i e d w i t h 0 . 8 % a g a r w a s u s e d . T h e p H o f t h e m e d i u m a d j u s t e d t o 5 . 8 - 5 . 9 p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f t h e a g a r . P r e p a r a t i o n o f m e d i u m D o u b l e d i s t i l l e d w a t e r w a s u s e d f o r p r e p a r i n g t h e m e d i u m . T h e n u t r i e n t m e d i u m b a s i c a l l y c o n s i s t s o f i n o r g a n i c n u t r i e n t s , c a r b o n s o u r c e , v i t a m i n s , i r o n s a n d a m i n o a c i d s . T h e c h e m i c a l s w e r e w e i g h e d a c c u r a t e l y i n e l e c t r o n i c w e i g h i n g b a l a n c e . A l l t h e s t o c k s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d i n a n d s t o r e d i n w e l l - s t o p p e d s t e r i l i z e d b o t t l e s a n d p r e s e r v e d i n r e f r i g e r a t o r a t 4 ° C . S p e c i f i c q u a n t i t y o f t h e s t o c k s o l u t i o n s o f t h e c h e m i c a l s a n d g r o w t h r e g u l a t o r s w e r e p i p e t t e o u t o n t o a o n e l i t e r b e a k e r a n d r e q u i r e d s u c r o s e w a s a d d e d . T h e f i n a l v o l u m e w a s m a d e u p w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d t h e p H w a s a d j u s t e d t o 5 . 8 - 5 . 9 w i t h 0 . 1 N N a O H o r 0 . 1 N H C L u s i n g a p H m e t e r ( M . E . M o h a m e d e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e b o t t l e s a f t e r c o v e r i n g w i t h a p o l y e t h y l e n e c a p w e r e a u t o c l a v e d a t 1 . 0 6 k g p r e s s u r e / s q c m f o r a b o u t 2 0 m i n u t e s a t 1 2 1 ° C . T h e a u t o c l a v e d m e d i u m i n t h e c u l t u r e b o t t l e s w e r e c o o l e d a n d a l l o w e d t o s o l i d i f y a n d i t w a s s t o r e d i n d a r k f o r f u r t h e r u s e . T h e i n o c u l a t i o n s w e r e d o n e a f t e r f o u r d a y s t o e n s u r e t h a t t h e b o t t l e s w e r e f r e e f r o m c o n t a m i n a t i o n . 6 5 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 8 : 6 5 3 - 6 5 9 K o m a t h i e t a l . , 2 0 1 1 F i g u r e : 1 - P a s s i f l o r a f o e t i d a L .

G r o w t h r e g u l a t o r s a n d t h e i r p r e p a r a t i o n T h r e e i m p o r t a n t g r o u p s o f g r o w t h r e g u l a t o r s s u c h a s a u x i n s , c y t o k i n e s a n d k i n e t i n s w e r e u s e d i n t h e e x p e r i m e n t s ( B u i L e T h a n h K h i e t e t a l . , 2 0 0 6 ) . A l l t h e g r o w t h r e g u l a t o r s w e r e s t o r e d a t 4 ° C u n t i l u s e . A u x i n a n d t h e i r p r e p a r a t i o n T h r e e a u x i n n a m e l y α - n a p h t h a l e n e a c e t i c a c i d ( N A A ) , i n d o l e 3 - a c e t i c a c i d ( I A A ) a n d i n d o l e 3 - b u t e r i c a c i d ( I B A ) w e r e u s e d i n t h e e x p e r i m e n t s ( V i k r a n t A . e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e s t o c k s o l u t i o n w a s p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 1 0 m g o f a u x i n i n d i v i d u a l l y i n 1 m l w i t h s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r . T h e r e q u i r e d v o l u m e s o f a u x i n w e r e a d d e d t o t h e n u t r i e n t m e d i a , b e f o r e a u t o c l a v i n g a n d w e r e u s e d i n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s . C y t o k i n e s a n d t h e i r p r e p a r a t i o n T h e s t o c k s o l u t i o n w a s p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 1 0 m g o f 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e ( B A P ) , k i n e t i n 6 - f u r f u r y l a m i n o p u r i n e i n 1 m l o f 0 . 1 N H y d r o c h l o r i c a c i d ( H C L ) a n d t h e v o l u m e w a s m a d e u p t o 1 0 m l b y a d d i n g s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r . T h e d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s w e r e u s e d b e f o r e a u t o c l a v i n g . C u l t u r e c o n d i t i o n s A l l t h e c u l t u r e s w e r e m a i n t a i n e d i n t h e c u l t u r e r o o m a t a t e m p e r a t u r e o f 2 5 ± 2 ° C a n d r e l a t i v e h u m i d i t y o f 6 5 - 7 0 % . T h e c u l t u r e s w e r e k e p t u n d e r w h i t e l i g h t i n t e n s i t y o f 3 0 0 0 l u x p r o v i d e d f r o m w h i t e f l u o r e s c e n t l a m p s ( P h i l i p s , I n d i a ) w i t h 1 4 h o u r s p h o t o p e r i o d i c d u r a t i o n . I n v i t r o s t u d i e s T h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n o n i n v i t r o p r o p a g a t i o n o f t h e s t u d y s p e c i e s w e r e c a r r i e d o u t i n t h e t i s s u e c u l t u r e l a b o r a t o r y o f D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , H i n d u s t h a n c o l l e g e o f A r t s a n d S c i e n c e , C o i m b a t o r e . I n v i t r o t e c h n i q u e s l i k e c a l l o g e n e s i s , o r g a n o g e n e s i s a n d m i c r o p r o p a g a t i o n w e r e a t t e m p t e d . C a l l o g e n e s i s L e a f s e g m e n t s o f 0 . 5 × 0 . 5 c m , n o d a l s e g m e n t s ( b e l o w t h e t w o t e r m i n a l n o d e s ) a n d s h o o t t i p m e a s u r i n g a b o u t 0 . 4 - 0 . 6 c m l e n g t h w e r e u s e d a s e x p l a n t s f o r t h e s t u d y s p e c i e s . T h e y w e r e c u l t u r e d o n f u l l s t r e n g t h M S m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h t h e g r o w t h r e g u l a t o r s B A P ( 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e ) , N A A ( α - N a p t h a l e n e a c e t i c a c i d ) , K n ( K i n e t i n ) . T w e n t y f i v e e x p l a n t s w e r e u s e d f o r e a c h c u l t u r e a n d t h e e x p e r i m e n t s w e r e t w i c e d . T h e p e r c e n t a g e o f e x p l a n t s r e s p o n d i n g f o r c a l l u s m u l t i p l e s h o o t i n d u c t i o n , t i m e t a k e n f o r t h i s i n d u c t i o n , t o t a l n u m b e r o f s h o o t s / e x p l a n t s a n d l e n g t h o f t h e s h o o t s w e r e r e c o r d e d a f t e r 4 0 d a y s o f c u l t u r e ( A i t c h i s o n , P . A . e t a l . , 1 9 7 7 ) . I n t h e s u b c u l t u r i n g e x p e r i m e n t s f o r o r g a n o g e n e s i s , t h e c a l l u s a n d i n v i t r o p r o d u c e d s h o o t s w e r e h a r v e s t e d a n d u s e d a s s e c o n d a r y e x p l a n t s o f c u l t u r e o n t h e s a m e m e d i u m . S u b c u l t u r i n g w a s c a r r i e d o u t a t t h e r e g u l a r i n t e r v a l o f 2 2 - 3 0 d a y s u s i n g t h e s a m e m e d i u m . T h e c a l l u s p i e c e s ( 0 . 5 × 0 . 5 c m ) a n d t h e i n v i t r o d e v e l o p e d m i c r o - s h o o t s w e r e c u t i n t o s e g m e n t s ( 0 . 4 - 0 . 6 c m l e n g t h w i t h s i n g l e i n t e r n o d e ) . T h e s e s e c o n d a r y e x p l a n t s w e r e s u b c u l t u r e d o n M S m e d i u m c o n t a i n i n g t h e s a m e g r o w t h r e g u l a t o r s a s u s e d i n c a l l u s i n g ( V i k r a n t A . e t a l . , 2 0 0 1 ) . R o o t i n g o f i n v i t r o m u l t i p l i e d s h o o t s T h e e l o n g a t e d s h o o t s w e r e t r a n s f e r r e d t o M S m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h d i f f e r e n t a u x i n l i k e I A A , I B A a n d N A A a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n f o r r o o t i n d u c t i o n . T h e r o o t e d p l a n t l e t s w e r e r e m o v e d f r o m c u l t u r e t u b e s a n d t r a n s f e r r e d f o r h a r d e n i n g . C a l l u s i n d u c t i o n M S m e d i u m e n r i c h e d w i t h a u x i n ( N A A ) , c y t o k i n i n s ( B A P ) , k i n e t i n ( K n ) i n t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f 1 . 0 - 2 . 5 m g / l w e r e t e s t e d f o r c a l l u s i n d u c t i o n a n d m o r p h o g e n e s i s . P e r c e n t a g e o f c a l l u s i n d u c t i o n o f f i v e w e e k o l d c u l t u r e s w a s c a l c u l a t e d ( B h o j w a n i , S . S 1 9 8 3 ) . C a l l u s w a s s u b c u l t u r e d r e g u l a r l y a t a n i n t e r v a l o f t h r e e w e e k s . C a l l u s f r e q u e n c y T h e p e r c e n t a g e o f c a l l u s i n g w a s r e c o r d e d a t t h e e n d o f t h e f i f t h w e e k . F r e q u e n c y o f c a l l u s i n d u c t i o n w a s c a l c u l a t e d b y u s i n g t h e f o l l o w i n g f o r m u l a a n d e x p r e s s e d i n p e r c e n t a g e : N u m b e r o f e x p l a n t s r e s p o n d e d C a l l u s f r e q u e n c y ( % ) = × 1 0 0 T o t a l n o o f e x p l a n t s c u l t u r e d H a r d e n i n g T h e w e l l d e v e l o p e d h e a l t h y e x p l a n t s w e r e r e m o v e d f r o m t h e c u l t u r e f l a s k a n d w e r e t h o r o u g h l y w a s h e d i n r u n n i n g t a p w a t e r t o r e m o v e t h e a d h e r i n g J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 8 : 6 5 3 - 6 5 9 6 5 5 K o m a t h i e t a l . , 2 0 1 1 S . N o G r o w t h R e g u l a t o r s I n i t i a l d i s s o l v i n g s o l u t i o n 1 I B A A b s o l u t e a l c o h o l 2 G A 3 A b s o l u t e a l c o h o l 3 I A A 7 0 % a l c o h o l 4 N A A 1 N N a o h 5 B A P 0 . 1 N H c l 6 2 , 4 , D 7 0 % a l c o h o l 7 K i n e t i n 0 . 1 N H c l P r e p a r a t i o n o f G r o w t h H o r m o n e s