J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y G e n e t i c a n d p h y t o c h e m i c a l v a r i a b i l i t y i n A c a l y p h a i n d i c a L . K e y w o r d s : A c a l y p h a i n d i c a , p h y t o c h e m i c a l g e n e t i c v a r i a b i l i t y , s u p e r i o r g e n o t y p e . A B S T R A C T : I n t h e p r e s e n t s t u d y , A c a l y p h a i n d i c a L . w a s c o l l e c t e d f r o m t e n l o c a t i o n s i n T i r u n e l v e l i h i l l s a n d t h e g e n e t i c v a r i a b i l i t y w a s i n v e s t i g a t e d u s i n g R A P D - P C R f i n g e r p r i n t . T h e p o p u l a t i o n w h i c h s h o w e d h i g h p e r c e n t a g e o f p o l y m o r p h i s m w a s s e l e c t e d . T h e s a m p l e s f r o m t h i s p o p u l a t i o n w e r e c h o s e n f o r f u r t h e r p h y t o c h e m i c a l a n a l y s i s a n d t h e a c t i v e p r i n c i p l e h a s b e e n q u a n t i f i e d . T h e p o p u l a t i o n w h i c h e x h i b i t e d b o t h h i g h p e r c e n t a g e o f p o l y m o r p h i s m a n d h i g h a m o u n t o f a c t i v e p r i n c i p l e w a s c o n s i d e r e d t o b e t h e s u p e r i o r g e n o t y p e . 4 7 7 - 4 8 2 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 7 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : J o h n D e B r i t t o a n d R e k h a G S . I n s t i t u t i o n : P l a n t M o l e c u l a r B i o l o g y R e s e a r c h U n i t , P G a n d R e s e a r c h D e p a r t m e n t o f P l a n t B i o l o g y a n d B i o t e c h n o l o g y , S t . X a v i e r ’ s C o l l e g e ( A u t o n o m o u s ) , P a l a y a m k o t t a i – 6 2 7 0 0 2 . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : J o h n D e B r i t t o A E m a i l : b j o h n d e @ y a h o o . c o . i n W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 1 3 9 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 9 S e p 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 2 1 O c t 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 0 2 N o v 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : J o h n D e B r i t t o a n d R e k h a G S . G e n e t i c a n d p h y t o c h e m i c a l v a r i a b i l i t y i n A c a l y p h a i n d i c a L . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 4 7 7 - 4 8 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h p a p e r

I N T R O D C U T I O N : I n t h e w a k e o f t h e c u r r e n t p a c e o f h a b i t a t l o s s a n d d e p l e t i o n o f p l a n t g e n e t i c r e s o u r c e s i n t h e t r o p i c s , i t i s e s s e n t i a l f o r t h e d e v e l o p i n g c o u n t r i e s w h i c h a r e r i c h i n b i o l o g i c a l d i v e r s i t y , t o e v o l v e s t r a t e g i e s a n d c o n s c i o u s e f f o r t s t o s c r u t i n i z e t h e i r r e s o u r c e s a n d i d e n t i f y t h e v a r i a n t s o f e c o n o m i c v a l u e f o r c o n s e r v a t i o n a n d u t i l i z a t i o n . S i n c e a p o p u l a t i o n n e e d s v a r i a t i o n , t h e m e a s u r e o f t h e a m o u n t o f h e t e r o z y g o s i t y a c r o s s a l l g e n e s c a n b e u s e d a s a g e n e r a l i n d i c a t o r o f t h e a m o u n t o f g e n e t i c v a r i a b i l i t y a n d g e n e t i c h e a l t h o f a p o p u l a t i o n . V a r i a t i o n s t h a t e n a b l e i n d i v i d u a l s t o p r o d u c e m o r e o f f s p r i n g a r e c o n s i d e r e d t o b e " m o s t f i t " . T h e s e v a r i a t i o n s b e c o m e m o r e f r e q u e n t w i t h e a c h g e n e r a t i o n . G e n e t i c v a r i a b i l i t y a m o n g a l l s p e c i e s i s i m p o r t a n t t o m a i n t a i n s i n c e i t r e p r e s e n t s t h e ' b l u e p r i n t ' f o r a l l o f t h e l i v i n g t h i n g s o n e a r t h . D u e t o v a r i o u s e n v i r o n m e n t a l , p h y s i c o - c h e m i c a l f a c t o r s , s o i l c o n d i t i o n s a n d c l i m a t i c f a c t o r s , t h e q u a l i t y a n d q u a n t i t y o f a c t i v e p r i n c i p l e s m a y v a r y f r o m p o p u l a t i o n t o p o p u l a t i o n . H e n c e , p h y t o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n a l o n g w i t h t h e m o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n g a i n s s i g n i f i c a n c e i n o r d e r t o f i n d o u t t h e s u p e r i o r g e n o t y p e s . A c a l y p h a i n d i c a L . c o m e s u n d e r t h e f a m i l y E u p h o r b i a c e a e . T h e w h o l e p l a n t i s u s e d a s m e d i c i n e t o t r e a t s k i n d i s e a s e s , c o n s t i p a t i o n , u l c e r s a n d b r o n c h i t i s . T h e p l a n t c o n t a i n s a c y a n o g e n e t i c g l u c o s i d e a n d t w o a l k a l o i d s v i z . , a c a l y p h i n e a n d t r i a c e t o n a m i n e . T h i s i s d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t t h e W e s t e r n G h a t s . W i t h t h i s b a c k g r o u n d , i n o r d e r t o f i n d o u t t h e s u p e r i o r g e n o t y p e s a m o n g t h e v a r i o u s p o p u l a t i o n s i n T i r u n e l v e l i h i l l s , t h e m o l e c u l a r a n d p h y t o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f A c a l y p h a i n d i c a w a s c a r r i e d o u t . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S : T e n l o c a t i o n s i n T i r u n e l v e l i h i l l a r e a s u c h a s T h i r u g u r u n k u d i , K a l a k a d , M a n i m u t h a r , A b a s a m u d r a m , P a p a n a s a m , C o u r t a l l u m , K a d a y a n a l l u r , K r i s h n a p u r a m , V a s u d e v a n a l l u r a n d S i v a g i r i w e r e s e l e c t e d f o r c o l l e c t i o n o f s p e c i e s . Y o u n g l e a v e s f r o m t e n i n d i v i d u a l s o f A c a l y p h a i n d i c a L . f r o m e a c h l o c a t i o n c o l l e c t e d i n s e p a r a t e v i a l s f o r R A P D a n a l y s i s a n d s t o r e d i n - 7 0 0 C u n t i l D N A w a s e x t r a c t e d f r o m a l l t e n i n d i v i d u a l s o f e a c h l o c a t i o n a n d p o o l e d . L e a f s a m p l e s w e r e a l s o c o l l e c t e d f o r H P L C a n l a y s i s . D N A w a s e x t r a c t e d f r o m t h e s e p l a n t s b y C T A B ( m o d i f i e d ) t e c h n i q u e D o y l e J J a n d D o y l e J L , 1 9 8 7 . T h e A 2 6 0 / A 2 8 0 r e a d i n g o f D N A r a n g e d f r o m 1 . 5 t o 1 . 9 . F o r R A P D a n a l y s i s W i l l i a m s e t a l . , ( 1 9 9 0 ) ( m o d i f i e d ) m e t h o d w a s f o l l o w e d . T h e r e a c t i o n w a s p e r f o r m e d b y 5 0 n g o f D N A , 1 5 p i c o m o l e s o f a s i n g l e d e c a m e r r a n d o m p r i m e r , P C R m i x t u r e a n d w a t e r t o a t o t a l v o l u m e o f 2 5 µ l i n 2 . 5 m l P C R t u b e s . T h e a m p l i f i c a t i o n w a s c a r r i e d o u t i n a t h e r m a l c y c l e r ( T a b l e . 1 ) . B a s e d o n t h e p r i m a r y d a t a ( p r e s e n c e o r a b s e n c e o f b a n d s ) , p a i r w i s e g e n e t i c i d e n t i t y a n d g e n e t i c d i s t a n c e b e t w e e n s a m p l e s w e r e c a l c u l a t e d u s i n g P o p g e n e p a c k a g e v e r s i o n 1 . 3 1 . D e n d r o g r a m w a s c o n s t r u c t e d a n d a n a l y z e d . T h e w i l d , f u l l y g r o w n A . i n d i c a l e a v e s w e r e s h a d e d r i e d f o r a w e e k a n d p o w d e r e d a n d e x t r a c t e d w i t h 1 0 0 m l o f m e t h a n o l . S t a n d a r d s t o c k s o l u t i o n s ( 5 0 0 µ g / m l ) w e r e p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 5 0 µ g A c a l y p h i n 5 m l o f w a r m m e t h a n o l a n d w a s m a d e u p t o 1 0 0 m l w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d s o n i c a t e d f o r 2 0 m i n u t e s . S t a n d a r d s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d b y d i l u t i n g t h e s t o c k s o l u t i o n w i t h 5 0 % m e t h a n o l t o o b t a i n t h e d e s i r e d c o n c e n t r a t i o n . T h e m e t h a n o l e x t r a c t o f e a c h s a m p l e w a s u s e d f o r H P L C a n a l y s i s f o l l o w i n g t h e s t a n d a r d p r o t o c o l g i v e n b y T i k h o m i r o f f a n d J o l i c o e u r , 2 0 0 2 . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N : T h e f i v e p r i m e r s u s e d t o a n a l y z e g e n e t i c v a r i a t i o n i n A c a l y p h a i n d i c a p r o d u c e d 5 9 p o l y m o r p h i c b a n d s ( P l a t e . 1 ) . T h e s a m e t y p e o f b a n d s o c c u r r e d a t d i f f e r e n t f r e q u e n c i e s i n a l l p o p u l a t i o n s . T h e g e n e t i c d i s t a n c e b e t w e e n t h e p o p u l a t i o n r a n g e d f r o m 0 . 1 2 1 4 t o 0 . 8 2 8 6 a n d t h e g e n e t i c i d e n t i t y r a n g e d f r o m 0 . 6 0 0 0 a n d 0 . 8 8 5 7 . T h e o v e r a l l o b s e r v e d a n d e f f e c t i v e n u m b e r o f 4 7 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 4 7 7 - 4 8 2 B r i t t o . , 2 0 1 1 A c t i v i t y T e m p e r a t u r e ( 0 C ) T i m e N u m b e r o f c y c l e s I n i t i a l D e n a t u r a t i o n 9 4 5 M i n O n e D e n a t u r i n g 9 4 1 M i n 3 5 A n n e a l i n g 3 7 1 M i n E x t e n s i o n 7 2 1 M i n F i n a l E x t e n s i o n 7 2 5 M i n O n e S t o r a g e 4 F o r e v e r T a b l e . 1 . P C R a m p l i c f i c a t i o n p r o g r a m m e

a l l e l e s i s a b o u t 1 . 6 8 a n d 1 . 3 9 r e s p e c t i v e l y . N e i ( 1 9 7 8 ) o v e r a l l g e n e d i v e r s i t y i s 0 . 2 3 6 6 . T h e d e n d r o g r a m o f A c a l y p h a i n d i c a ( F i g . 1 ) p r o d u c e d t w o m a j o r c l u s t e r s . T h e f i r s t c l u s t e r i s w i t h p o p u l a t i o n s 2 , 3 a n d 6 . T h i s i s f u r t h e r d i v i d e d i n t o t w o s u b c l u s t e r s w i t h p o p u l a t i o n s 2 a n d 3 t o g e t h e r l e a v i n g p o p u l a t i o n 6 s e p a r a e t . T h e r e s t o f t h e p o p u l a t i o n s g r o u p s i n t o a n o t h e r c l u s t e r . I n t h i s c l u s t e r , t h e r e a r e t w o s u b c l u s t e r s . T h e f i r s t s u b c l u s t e r i s w i t h p o p u l a t i o n s 1 , 4 a n d 5 . H e r e a g a i n p o p u l a t i o n 1 i s d f f e r e n t f r o m p o p u l a t i o n s 4 a n d 5 . T h e s e c o n d s u b c l u s t e r i s w i t h p o p u l a t i o n s 7 , 8 , 9 a n d 1 0 . H e r e a g a i n p o p u l a t i o n s 7 , 8 a n d 1 0 f o r m a s e p a r a t e c l u s t e r l e a v i n g p o p u l a t i o n 1 0 s e p a r a t e . P o p u l a t i o n s 7 a n d 8 f o r m a s u b c l u s t e r l e a v i n g p o p u l a t i o n 9 s e p a r a t e . F r o m t h e d e n d r o g r a m , i t i s u n d e r s t o o d t h a t t h e r e i s c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f g e n e t i c v a r i a b i l i t y b e t w e e n t h e 1 0 p o p u l a t i o n s o f A c a l y p h a i n d i c a . T h e p o u l a t i o n 1 0 c o l l e c t e d f r o m C o u r t a l l u m f o r m s a u n i q u e c l u s t e r d i f f e r i n g f r o m a l l o t h e r p o p u l a t i o n s . T h e n u m b e r o f p o l y m o r p h i c l o c i a n d p e r c e n t a g e o f p o l y m o r p h i s m ( T a b l e . 4 ) w a s c a l c u l a t e d b y u s i n g t h e s o f t w a r e P o p g e n e p a c k a g e v e r s i o n 1 . 3 1 . A m o n g t h e s e t e n p o p u l a t i o n s , p o p u l a t i o n s 1 , 4 , 7 , 8 , 1 0 ( T h i r u g u r u n g u d i , J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 4 7 7 - 4 8 2 4 7 9 B r i t t o . , 2 0 1 1 P o p I D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 * * * * 2 0 . 4 1 9 9 * * * * 3 0 . 4 1 9 9 0 . 1 2 1 4 * * * * 4 0 . 1 8 8 1 0 . 5 1 0 8 0 . 5 1 0 8 * * * * 5 0 . 1 8 8 1 0 . 3 3 6 5 0 . 3 3 6 5 0 . 1 2 1 4 * * * * 6 0 . 4 1 9 9 0 . 2 5 9 5 0 . 2 5 9 5 0 . 3 3 6 5 0 . 2 5 9 5 * * * * 7 0 . 3 3 6 5 0 . 4 1 9 9 0 . 2 5 9 5 0 . 2 5 9 5 0 . 3 3 6 5 0 . 2 5 9 5 * * * * 8 0 . 3 3 6 5 0 . 4 1 9 9 0 . 4 1 9 9 0 . 1 8 8 1 0 . 1 8 8 1 0 . 2 5 9 5 0 . 1 8 8 1 * * * * 9 0 . 4 1 9 9 0 . 2 5 9 5 0 . 2 5 9 5 0 . 4 1 9 9 0 . 2 5 9 5 0 . 2 5 9 5 0 . 2 5 9 5 0 . 1 8 8 1 * * * * 1 0 0 . 3 3 6 5 0 . 4 1 9 9 0 . 4 1 9 9 0 . 3 3 6 5 0 . 3 3 6 5 0 . 3 3 6 5 0 . 1 8 8 1 0 . 3 3 6 5 0 . 3 3 6 5 * * * * T a b l e . 2 . N e i ' s U n b i a s e d M e a s u r e s o f G e n e t i c I d e n t i t y i n A . i n d i c a P o p I D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 * * * * 0 . 6 5 7 1 0 . 6 5 7 1 0 . 8 2 8 6 0 . 8 2 8 6 0 . 6 5 7 1 0 . 7 1 4 3 0 . 7 1 4 3 0 . 6 5 7 1 0 . 7 1 4 3 2 * * * * 0 . 8 8 5 7 0 . 6 0 0 0 0 . 7 1 4 3 0 . 7 7 1 4 0 . 6 5 7 1 0 . 6 5 7 1 0 . 7 7 1 4 0 . 6 5 7 1 3 * * * * 0 . 6 0 0 0 0 . 7 1 4 3 0 . 7 7 1 4 0 . 6 5 7 1 0 . 6 5 7 1 0 . 7 7 1 4 0 . 6 5 7 1 4 * * * * 0 . 8 8 5 7 0 . 7 1 4 3 0 . 7 7 1 4 0 . 8 2 8 6 0 . 6 5 7 1 0 . 7 1 4 3 5 * * * * 0 . 7 7 1 4 0 . 8 2 8 6 - . 8 2 8 6 0 . 7 7 1 4 0 . 7 1 4 3 6 * * * * 0 . 7 7 1 4 0 . 7 7 1 4 0 . 7 7 1 4 0 . 7 1 4 3 7 * * * * 0 . 8 2 8 6 0 . 7 7 1 4 0 . 8 2 8 6 8 * * * * 0 . 8 2 8 6 0 . 7 1 4 3 9 * * * * 0 . 7 1 4 3 1 0 * * * * T a b l e . 3 . N e i ' s U n b i a s e d M e a s u r e s o f G e n e t i c d i s t a n c e i n A . i n d i c a N e i ' s g e n e t i c i d e n t i t y ( a b o v e d i a g o n a l ) a n d g e n e t i c d i s t a n c e ( b e l o w d i a g o n a l )

A m b a s a m u t h r a m , M a n i m u t h a r , P a p a n a s a m a n d C o u r t a l l u m ) s h o w e d h i g h e s t p o l y m o r p h i s m . A m o n g t h e s e f i v e , p e r c e n t a g e o f p o l y m o r p h i s m w a s h i g h e r i n p o p u l a t i o n 1 0 . I n o r d e r t o s c r u t i n i z e f u r t h e r , p h y t o c h e m i c a l a n a l y s i s h a s b e e n d o n e . T h e f i v e p o p u l a t i o n s , w h i c h s h o w e d t h e h i g h e s t p o l y m o r p h i s m , w e r e s e l e c t e d f o r f u r t h e r H P L C . L e a v e s f r o m t h e p l a n t s o f t h e s e f i v e p o p u l a t i o n s w e r e c o l l e c t e d a n d s h a d e d r i e d a n d p o w d e r e d . A c a l y p h i n q u a n t i f i c a t i o n ( T a b l e . 5 ) w a s b a s e d o n t h e a n a l y s i s o f k v a z i m o l e c u l a r i o n m / z = 3 6 1 . 1 2 w i t h a n i n t e r n a l s t a n d a r d c a f f e i n e . A m o n g t h e s e f i v e , ( 1 , 4 , 7 , 8 , a n d 1 0 ) p o p u l a t i o n 1 0 w h i c h w a s c o l l e c t e d f r o m C o u r t a l l u m , s h o w e d t h e h i g h e s t a m o u n t o f A c a l y p h i n ( 3 . 2 5 µ g ± 0 . 2 0 µ g ) , f o l l o w e d b y p o p 8 , w h i c h w a s c o l l e c t e d f r o m P a p a n a s a m ( 2 . 2 8 µ g ± 0 . 4 9 µ g ) . I t i s i m p o r t a n t t o p o i n t o u t t h a t t h e g e n e t i c v a r i a t i o n t h a t a p o p u l a t i o n o f o r g a n i s m s p o s s e s s e s i s t h e f u e l t h a t a l l o w s t h e m t o b e a b l e t o c h a n g e o r e v o l v e i n r e s p o n s e t o c h a n g i n g e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s . G e n e t i c v a r i a b i l i t y w i t h i n a p o p u l a t i o n c a n s o m e t i m e s a l l o w a s p e c i e s t o a d a p t t o a c h a n g i n g e n v i r o n m e n t , i t l e a d s t o l o n g t e r m s u r v i v a l o f a s p e c i e s , a n d i t c o m e s t o t h e r e s c u e o f a s p e c i e s a t c r u c i a l s i t u a t i o n s b y l e n d i n g g e n e s t h a t i m p a r t r e s i s t a n c e , s u r v e i l l a n c e a n d h i g h e r p r o d u c t i v i t y . S p e c i e s w i t h l i t t l e o r n o g e n e t i c v a r i a b i l i t y w i l l h a v e g r e a t e r t e n d e n c y t o g o e x t i n c t 4 8 0 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 4 7 7 - 4 8 2 B r i t t o . , 2 0 1 1 P o p u l a t i o n n o N u m b e r o f p o l y m o r p h i c l o c i P e r c e n t a g e o f p o l y m o r p h i c l o c i 1 1 4 4 0 . 0 0 2 8 2 2 . 8 6 3 1 0 2 8 . 5 7 4 1 2 3 4 . 2 9 5 8 2 2 . 8 6 6 8 2 2 . 8 6 7 1 0 2 8 . 5 7 8 1 0 2 8 . 5 7 9 6 1 7 . 1 4 1 0 1 6 4 5 . 7 1 T a b l e . 4 . N u m b e r o f p o l y m o r p h i c l o c i a n d p e r c e n t a g e o f p o l y m o r p h i s m i n A c a l y p h a i n d i c a S a m p l e W e i g h t f o r e x t r a c t i o n ( g ) R e s i d u u m a f t e r e v a p o r a t i o n ( g ) D e t e r m i n e d w ( % ) i n r e s i d u u m A m o u n t o f a c a l y p h i n i n 1 g o f d r y p l a n t ( µ g / g ) A I - 1 T h i r u g u r u n g u d i 5 2 . 9 9 0 . 1 8 8 1 . 8 0 ± 0 . 2 3 A I - I I A m b a s a m u t h r a m 5 2 . 9 6 0 . 0 8 3 0 . 9 5 ± 0 . 1 4 A I - I I I M a n i m u t h a r 5 2 . 1 3 0 . 0 7 0 1 . 0 3 ± 0 . 3 3 A I - I V P a p a n a s a m 5 1 . 2 3 0 . 1 2 6 2 . 2 8 ± 0 . 4 9 A I - V C o u r t a l l u m 5 2 . 0 0 0 . 1 9 0 3 . 2 5 ± 0 . 2 0 T a b l e . 5 . Q u a n t i f i c a t i o n o f a c a l y p h i n i n A c a l y p h a i n d i c a d r y p l a n t s a m p l e s c a r r i e d o u t w i t h M S / M S d e t e c t i o n R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n ± S D , n = 2 . F i g 1 . U P G M A d e n d r o g r a m o f A c a l y p h a i n d i c a b a s e d o n N e i ’ s G e n e t i c d i s t a n c e d e r i v e d f r o m R A P D d a t a .