J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y C o m p a r i s o n o f h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e , s o y b e a n p e r o x i d a s e a n d r a d i s h p e r o x i d a s e f o r t h e p o l y m e r i z a t i o n o f p h e n o l K e y w o r d s : H o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ( H R P ) , s o y b e a n p e r o x i d a s e ( S B P ) , r a d i s h p e r o x i d a s e ( R P ) , p h e n o l , e n z y m e s f o r p h e n o l d e g r a d a t i o n . A B S T R A C T : P o l y m e r i z a t i o n o f P h e n o l w a s c a r r i e d o u t i n l a b o r a t o r y u s i n g p e r o x i d a s e e n z y m e e x t r a c t e d f r o m t h r e e d i f f e r e n t p l a n t s o u r c e s n a m e l y , h o r s e r a d i s h r o o t s , s o y b e a n h u l l s a n d r a d i s h r o o t s . T h e a m b i e n t r o o m t e m p e r a t u r e d u r i n g t h e s t u d y p e r i o d w a s b e t w e e n 2 7 - 3 2 o C . P h e n o l c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 - 3 0 0 m g / L w a s g i v e n t o t h e f r e e e n z y m e s . P h e n o l p o l y m e r i z a t i o n o f 8 4 % w a s a c h i e v e d a t 1 0 0 m g / L p h e n o l u s i n g f r e e H R P e n z y m e . S i m i l a r l y , 7 2 % a n d 7 6 % p h e n o l p o l y m e r i z a t i o n w a s o b t a i n e d u s i n g f r e e S B P a n d R P r e s p e c t i v e l y a t 1 0 0 m g / L p h e n o l . P e r o x i d a s e i s o l a t e d f r o m h o r s e r a d i s h r o o t s w a s a b l e t o p o l y m e r i z e p h e n o l m o r e e f f i c i e n t l y t h a n t h e e n z y m e s i s o l a t e d f r o m s o y b e a n h u l l s a n d r a d i s h r o o t s . A s t h e c o n c e n t r a t i o n o f p h e n o l i n c r e a s e d , r e d u c t i o n i n p h e n o l p o l y m e r i z a t i o n e f f i c i e n c y w a s o b s e r v e d f o r a l l t h e t h r e e e n z y m e s . 5 0 3 - 5 0 7 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 7 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : P r a d e e p N V 1 , A n u p a m a 1 , H a m p a n n a v a r U S 2 . I n s t i t u t i o n : 1 . M . T e c h S c h o l a r , D e p t o f C i v i l E n g g , K . L . E ’ s C o l l e g e o f E n g i n e e r i n g a n d T e c h n o l o g y , B e l g a u m , I n d i a . 2 . P r o f e s s o r , D e p t o f C i v i l E n g g , K . L . E ’ s C o l l e g e o f E n g i n e e r i n g a n d T e c h n o l o g y , B e l g a u m , I n d i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : P r a d e e p N V . E m a i l : n a g a m a l l i v p r a d e e p @ g m a i l . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 1 3 6 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 2 5 O c t 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 0 1 N o v 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 0 7 N o v 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : P r a d e e p N V , A n u p a m a , H a m p a n n a v a r U S . C o m p a r i s o n o f h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e , s o y b e a n p e r o x i d a s e a n d r a d i s h p e r o x i d a s e f o r t h e p o l y m e r i z a t i o n o f p h e n o l . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 0 3 - 5 0 7 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h P a p e r

I N T R O D U C T I O N P h e n o l ( C 6 H 5 O H ) i s o n e o f t h e m o s t w i d e l y u s e d o r g a n i c c o m p o u n d s , t h e d i s c o v e r y o f p h e n o l i s a t t r i b u t e d t o R u n g e i n 1 8 3 4 w h o i s o l a t e d s e v e r a l c o m p o n e n t s o f c o a l t a r i n c l u d i n g c a r b o l i c a c i d ( T y m a n , 1 9 9 6 ) . P h e n o l i c c o m p o u n d s a r e f o u n d i n w a s t e w a t e r s o f v a r i o u s i n d u s t r i e s s u c h a s p e t r o l e u m r e f i n i n g , c o a l c o n v e r s i o n , p l a s t i c s , r e s i n s , t e x t i l e s , i r o n a n d s t e e l m a n u f a c t u r i n g a s w e l l a s p u l p a n d p a p e r m a n u f a c t u r i n g ( E n s u n c h o e t a l . , 2 0 0 5 ) . D u e t o t h e t o x i c n a t u r e o f s o m e o f t h e s e c o m p o u n d s , t h e E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n A g e n c y , E P A , h a s s e t a w a t e r p u r i f i c a t i o n s t a n d a r d o f l e s s t h a n 1 μ g L – 1 o f p h e n o l i n d r i n k i n g w a t e r s . M o r e o v e r , E P A s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t t h e u s a g e o f c h l o r i n e f o r d i s i n f e c t i o n o f p h e n o l - c o n t a i n i n g w a t e r m a y y i e l d t o x i c 2 - c h l o r o p h e n o l . P h e n o l i s t o x i c t o f i s h a t a l e v e l o f 0 . 0 5 m g / l , t h e r e f o r e t h e r e m o v i n g o f p h e n o l s f r o m w a s t e w a t e r i s t h e r e f o r e o f g r e a t i m p o r t a n c e ( M o s s a l l a m e t a l . , 2 0 0 9 ) . D e p a r t m e n t o f T r a n s p o r t a t i o n ’ s H a z a r d o u s M a t e r i a l R e g u l a t i o n c l a s s i f i e s p h e n o l a s a C l a s s B p o i s o n . D r u m s a n d p a c k a g e s a r e t o b e l a b e l e d ‘ ‘ P o i s o n ’ ’ a n d m u s t c o m p l y w i t h t h e r e g u l a t i o n s a n d b u l k c o n t a i n e r s m u s t b e p r o p e r l y m a r k e d . E n z y m e s a s b i o c a t a l y s t s h a v e b e e n u s e d i n m a n y b i o l o g i c a l r e a c t i o n s b u t t h e y m o s t l y s u f f e r f r o m c e r t a i n d i s a d v a n t a g e s . E n z y m a t i c t r e a t m e n t h a s b e e n p r o p o s e d b y m a n y a s a n a l t e r n a t i v e t r e a t m e n t t e c h n o l o g y t o t r a d i t i o n a l m e t h o d s ( M o s s a l l a m e t a l . , 2 0 0 9 ) . E n z y m a t i c r e m o v a l o f p h e n o l i c c o m p o u n d s h a s b e e n i n v e s t i g a t e d b y m a n y r e s e a r c h e r s a n d i t h a s b e e n s h o w n t h a t p e r o x i d a s e s a r e a b l e t o r e a c t w i t h a q u e o u s p h e n o l i c c o m p o u n d s ( I r a n a n d S i a m a k , 2 0 0 9 ) . P e r o x i d a s e s a r e o x i d o r e d u c t a s e s p r o d u c e d b y a n u m b e r o f m i c r o o r g a n i s m s a n d p l a n t s . P e r o x i d a s e s c a t a l y s e a v a r i e t y o f r e a c t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f p e r o x i d e s ; ( e g ) H y d r o g e n p e r o x i d e ( H a m i d M a n d R e h m a n K , 2 0 0 9 ) . R e d u c t i o n o f p e r o x i d e s a t t h e e x p e n s e o f e l e c t r o n d o n a t i n g s u b s t r a t e s , m a k e p e r o x i d a s e s u s e f u l i n a n u m b e r o f b i o t e c h n o l o g i c a l a p p l i c a t i o n s . P e r o x i d a s e h a s a p o t e n t i a l f o r s o i l d e t o x i f i c a t i o n , w h i l e H R P a s w e l l a s s o y b e a n a n d t u r n i p p e r o x i d a s e s h a v e b e e n a p p l i e d f o r t h e b i o r e m e d i a t i o n o f w a s t e w a t e r c o n t a m i n a t e d w i t h p h e n o l s , c r e s o l s , a n d c h l o r i n a t e d p h e n o l s ( C a r l o s e t a l . , 2 0 0 4 ) . H o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ( H R P ) i s e f f e c t i v e f o r t h e r e m o v a l o f p h e n o l s a n d p h e n o l i c c o m p o u n d s f r o m a q u e o u s s o l u t i o n s b y c a t a l y z i n g t h e f o r m a t i o n o f i n s o l u b l e , p o l y m e r i c p h e n o l i c a g g r e g a t e s ( L a i a n d L i n , 2 0 0 5 ) . S o y b e a n s e e d h u l l s h a v e b e e n i d e n t i f i e d a s a r i c h s o u r c e o f a p e r o x i d a s e , t h e s o y b e a n p e r o x i d a s e ( S B P ) , b e i n g a b y - p r o d u c t o f t h e s o y b e a n f o o d i n d u s t r y , t h e y p r o v i d e a c h e a p a n d a b u n d a n t s o u r c e o f p e r o x i d a s e ( W i l b e r g e t a l . , 2 0 0 2 ) . R a d i s h r o o t j u i c e a n d p i e c e s c o n t a i n i n g R a d i s h p e r o x i d a s e ( R P ) h a v e a p o t e n t i a l a c t i v i t y f o r t h e r e m o v a l o f p h e n o l f r o m a s y n t h e t i c w a s t e w a t e r ( N a g h i b i e t a l . , 2 0 0 3 ) . P h e n o l i c w a s t e w a t e r i s a m a j o r i s s u e w h e n d i s p o s e d u n t r e a t e d . T h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n w o u l d b e a s t e p t o w a r d s t h e r e d u c t i o n o f p h e n o l u s i n g f r e e e n z y m e s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S E n z y m e e x t r a c t i o n H o r s e R a d i s h P e r o x i d a s e ( H R P ) e n z y m e w a s e x t r a c t e d f r o m h o r s e r a d i s h r o o t s i n t h e l a b o r a t o r y . T h e h o r s e r a d i s h r o o t s w e r e s o a k e d i n b u f f e r o f p H 6 . 8 ; l a t e r i t w a s c r u s h e d u s i n g b l e n d e r f o r 1 0 m i n . T h e e x t r a c t w a s f i l t e r e d u s i n g w h a t m a n f i l t e r p a p e r a n d t h e f i l t r a t e w a s c e n t r i f u g e d a t 8 , 0 0 0 r p m , 2 5 o C f o r 3 0 m i n . T h e s u p e r n a t a n t o b t a i n e d a f t e r c e n t r i f u g a t i o n w a s u s e d a s c r u d e e n z y m e s o u r c e . T h i s e n z y m e s o l u t i o n w a s s t o r e d a t 4 o C a n d w a r m e d t o r o o m t e m p e r a t u r e i m m e d i a t e l y p r i o r t o u s e . T h e s i m i l a r p r o c e d u r e w a s f o l l o w e d f o r t h e e x t r a c t i o n o f S o y B e a n P e r o x i d a s e ( S B P ) e n z y m e f r o m s o y b e a n s e e d h u l l s a n d R a d i s h P e r o x i d a s e ( R P ) e n z y m e f r o m e d i b l e p a r t o f r a d i s h r o o t s . P e r o x i d a s e a c t i v i t y m e a s u r e m e n t T h e a c t i v i t y o f H o r s e R a d i s h P e r o x i d a s e ( H R P ) , S o y b e a n P e r o x i d a s e ( S B P ) a n d R a d i s h P e r o x i d a s e ( R P ) w e r e a s s a y e d a t 2 5 o C u s i n g p h e n o l , 4 - A m i n o a n t i p y r i n e ( A A P ) a n d h y d r o g e n p e r o x i d e a s s u b s t r a t e s . T h e a s s a y m i x t u r e c o n t a i n e d 1 . 5 m l o f a 2 0 m M p h e n o l s o l u t i o n , 0 . 7 5 m l o f a 9 . 6 m M A A P s o l u t i o n , 0 . 3 m l o f 2 m M H 2 O 2 s o l u t i o n , 0 . 4 5 m l o f e n z y m e s o l u t i o n , a n d 0 . 3 m l p h o s p h a t e b u f f e r . T h e t o t a l v o l u m e o f t h e a s s a y m i x t u r e w a s 3 m l . T h e e n z y m e a c t i v e c o n c e n t r a t i o n i s p r o p o r t i o n a l t o t h e c o l o r d e v e l o p m e n t r a t e m e a s u r e d a t 5 0 0 n m , d u r i n g a p e r i o d o f t i m e i n w h i c h t h e s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n i s n o t s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d ( S a d a s i v a m a n d M a n i c k a n , 2 0 0 4 ) . T h e c o l o r d e v e l o p m e n t r a t e d u r i n g t h i s p e r i o d w a s c o n v e r t e d t o a c t i v i t y u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t o f 7 , 1 0 0 M - 1 c m - 1 b a s e d o n h y d r o g e n p e r o x i d e . O n e u n i t o f e n z y m a t i c a c t i v i t y i s d e f i n e d a s t h e a m o u n t o f e n z y m e w h i c h t r a n s f o r m s 1 m i c r o m o l o f h y d r o g e n p e r o x i d e p e r m i n u t e a t 2 5 o C . D e t e r m i n a t i o n o f P h e n o l C o n c e n t r a t i o n T h e p h e n o l c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e c t e d u s i n g 5 0 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 0 3 - 5 0 7 P r a d e e p e t a l . , 2 0 1 1

4 - A m i n o a n t i p y r i n e ( 4 - A A P ) m e t h o d . T h i s m e t h o d c a n b e u s e d f o r w a s t e w a t e r s c o n t a i n i n g p h e n o l c o n c e n t r a t i o n s f r o m 0 . 5 t o 5 m g / l . 1 0 0 m l o f s a m p l e w a s t a k e n , 2 . 5 m l o f A m m o n i u m h y d r o x i d e ( 0 . 5 N ) w a s a d d e d a n d t h e p H w a s a d j u s t e d t o 7 . 9 u s i n g p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 8 ) . 1 m l o f 4 - A A P ( 2 % ) w a s a d d e d a n d m i x e d w e l l , 1 m l o f p o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e w a s a d d e d a n d o p t i c a l d e n s i t y ( O D ) w a s m e a s u r e d a t 5 0 0 n m a f t e r 1 5 m i n u t e s . T h e O D w a s c o n v e r t e d t o p h e n o l c o n c e n t r a t i o n u s i n g a c a l i b r a t i o n c u r v e ( D a n n i s , 1 9 5 1 , S t a n d a r d m e t h o d s 1 9 9 5 ) . A s s a y u s i n g f r e e e n z y m e E x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t i n 1 0 0 m l E r l e n m e y e r f l a s k s a t r o o m t e m p e r a t u r e . R e a c t i o n m e d i u m w a s p r e p a r e d b y a d d i n g 1 0 0 t o 3 0 0 m g / L w i t h a n i n c r e m e n t o f 1 0 0 m g / L p h e n o l , e n z y m e ( 4 % ) a n d H 2 O 2 ( 1 . 1 t o 5 . 5 m M ) i n t o t h e p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 8 ) . T h e v o l u m e o f a s s a y m i x t u r e w a s 5 0 m l . T h e r e a c t i o n w a s i n i t i a t e d b y H 2 O 2 w h i c h w a s a d d e d d i s c r e t e l y f o r e v e r y 3 0 m i n u t e s t o a s s u r e p h e n o l c o n v e r s i o n . T h e c o n i c a l f l a s k s c o n t a i n i n g t h e a s s a y m i x t u r e w a s p l a c e d o n a r o t a r y s h a k e r t o e n s u r e c o m p l e t e m i x i n g . T h e s a m p l e w a s d r a w n f o r e v e r y 3 0 m i n u t e s a n d p h e n o l c o n c e n t r a t i o n w a s m e a s u r e d . T h e p h e n o l c o n c e n t r a t i o n w a s v a r i e d w h e n t h e r e w a s n o c o n s i d e r a b l e d i f f e r e n c e i n t w o c o n s e c u t i v e r e a d i n g s . R E S U L T S T h e f r e e H R P , R P a n d S B P e n z y m e s w e r e u s e d f o r c o n v e r s i o n o f p h e n o l . A l l t h e t h r e e f r e e e n z y m e s s h o w e d e f f e c t i v e p h e n o l c o n v e r s i o n s . T h e h i g h e s t p h e n o l c o n v e r s i o n p e r c e n t a g e w a s o b t a i n e d a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 m g / L a n d t h e p h e n o l p o l y m e r i z a t i o n e f f i c i e n c i e s o b t a i n e d w e r e 8 4 , 7 6 a n d 7 2 % f o r H R P , R P a n d S B P r e s p e c t i v e l y , a s s h o w n i n F i g 1 . T h e p e r c e n t a g e o f p h e n o l p o l y m e r i z a t i o n e f f i c i e n c i e s a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f 2 0 0 m g / L w e r e 7 6 , 6 9 a n d 6 6 f o r H R P , R P a n d S B P r e s p e c t i v e l y . A t t h e c o n c e n t r a t i o n o f 2 0 0 m g / L , H R P p r o v e d t o b e m o s t e f f i c i e n t a m o n g t h r e e a n d S B P b e i n g t h e l e a s t e f f e c t i v e a s s h o w n i n F i g 2 . A t t h e c o n c e n t r a t i o n o f 3 0 0 m g / L , H R P p r o v e d t o b e m o s t e f f i c i e n t a m o n g t h r e e a n d R P b e i n g t h e l e a s t e f f e c t i v e a s s h o w n i n F i g 3 . T h e p e r c e n t a g e o f p h e n o l p o l y m e r i z a t i o n e f f i c i e n c i e s a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f 3 0 0 m g / L w e r e 6 2 , 5 8 a n d 5 7 f o r H R P , R P a n d S B P r e s p e c t i v e l y . D I S C U S S I O N S A l l t h e t h r e e e n z y m e s p r o v e d t h e i r e f f i c i e n c y i n p o l y m e r i z i n g p h e n o l , H R P p r o v e d t o b e m o s t e f f i c i e n t a n d S B P p r o v e d t o l e a s t e f f i c i e n t a m o n g t h e t h r e e p e r o x i d a s e e n z y m e s . A s t h e c o n c e n t r a t i o n o f p h e n o l i n c r e a s e d , t h e p h e n o l c o n v e r s i o n e f f i c i e n c y r e d u c e d f o r a l l t h e p e r o x i d a s e e n z y m e s . W i l b e r g e t a l . , ( 2 0 0 0 ) r e p o r t e d 9 9 % p h e n o l c o n v e r s i o n e f f i c i e n c y u s i n g f r e e H R P e n z y m e . I r a n a n d S i a m a k ( 2 0 0 9 ) a t t a i n e d 6 0 % c o n v e r s i o n o f p h e n o l u s i n g f r e e H R P e n z y m e . N a g h i b i e t a l . , ( 2 0 0 3 ) r e p o r t e d 9 8 % p h e n o l c o n v e r s i o n u s i n g r a d i s h p e r o x i d a s e e n z y m e e x t r a c t e d f r o m t h e j u i c e o f R a p a h a n u s s a t i v u s . C a z a e t a l . , ( 1 9 9 9 ) d e t e r m i n e d o p t i m a l c o n d i t i o n s t o a c h i e v e 9 5 % p h e n o l c o n v e r s i o n u s i n g s o y b e a n p e r o x i d a s e . T h e y c o n c l u d e d t h e o p t i m a l p H o f 7 a s b e s t s u i t e d f o r J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 0 3 - 5 0 7 5 0 5 P r a d e e p e t a l . , 2 0 1 1