J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y S h o o t m u l t i p l i c a t i o n a n d d i r e c t o r g a n o g e n e s i s o f a n i m p o r t a n t m e d i c i n a l p l a n t P l u m b a g o z e y l a n i c a L . ( P l u m b a g i n a c e a e ) . K e y w o r d s : P l u m b a g o z e y l a n i c a L . , m e d i c i n a l p l a n t , c a u l o g e n e s i s , r h i z o g e n e s i s , I n v i t r o r o o t i n g , d e n o v o o r g a n o g e n e s i s . A B S T R A C T : E f f i c i e n t m i c r o p r o p a g a t i o n p r o t o c o l w a s d e v e l o p e d f o r P l u m b a g o z e y l a n i c a L . , a s p e c i e s t h r e a t e n e d d u e t o o v e r e x p l o i t a t i o n f o r m e d i c i n a l p u r p o s e s a n d h a b i t a t d e s t r u c t i o n i n S o u t h e r n P e n i n s u l a r I n d i a . M u l t i p l e s h o o t i n d u c t i o n w a s m o r e s u c c e s s f u l u s i n g n o d e s a s e x p l a n t s o n M u r a s h i g e a n d S k o o g s ( M S ) m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 1 m g / L b e n z y l a m i n o p u r i n e ( B A P ) . S h o o t s , w h e n t r a n s f e r r e d t o M S m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 2 0 . 5 m g / L g i b b e r e l l i c a c i d ( G A 3 ) s h o w e d v a r i a b l e e l o n g a t i o n . F u r t h e r , M S m e d i u m f o r t i f i e d w i t h 1 . 5 m g / L B A P i n d u c e d h i g h e s t f r e q u e n c y o f s h o o t s t h r o u g h a d v e n t i t i o u s d e n o v o o r g a n o g e n e s i s . S h o o t s d e v e l o p e d w e r e r o o t e d o n f u l l s t r e n g t h M S m e d i u m w i t h e i t h e r α - n a p h t h a l e n e a c e t i c a c i d ( N A A ) , i n d o l e - 3 - b u t y r i c a c i d ( I B A ) o r i n d o l e - 3 - a c e t i c a c i d ( I A A ) . O p t i m u m s h o o t s a n d r o o t m u l t i p l i c a t i o n w e r e o b t a i n e d w i t h i n 8 w e e k s . I n v i t r o d e r i v e d p l a n t l e t s w e r e s u c c e s s f u l l y w e a n e d a n d t r a n s f e r r e d t o s o i l a n d s h o w e d 9 0 % s u r v i v a l r a t e . 4 2 4 - 4 2 8 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 6 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : L u b a i n a A S 1 , N a i r G M 2 a n d M u r u g a n K 1 . I n s t i t u t i o n : 1 . P l a n t B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r b i o l o g y L a b , D e p a r t m e n t o f B o t a n y , U n i v e r s i t y C o l l e g e , T h i r u v a n a n t h a p u r a m , K e r a l a - 6 9 5 0 3 4 , I n d i a . 2 . P r o f e s s o r o f B o t a n y , U n i v e r s i t y o f K e r a l a , K a r i a v a t t o m . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : M u r u g a n K E m a i l : h a r i m u r u k a n @ g m a i l . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 1 1 7 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 2 6 S e p 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 2 6 S e p 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 1 2 O c t 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : L u b a i n a A S , N a i r G M a n d M u r u g a n K . S h o o t m u l t i p l i c a t i o n a n d d i r e c t o r g a n o g e n e s i s o f a n i m p o r t a n t m e d i c i n a l p l a n t P l u m b a g o z e y l a n i c a L . ( P l u m b a g i n a c e a e ) . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 2 4 - 4 2 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h P a p e r A b b r e v i a t i o n s : M u r a s h i g e a n d S k o o g s ( M S ) , B e n z y l A m i n o P u r i n e ( B A P ) , G i b b e r e l l i c A c i d ( G A 3 ) , α - N a p h t h a l e n e A c e t i c A c i d ( N A A ) , I n d o l e - 3 - B u t y r i c A c i d ( I B A ) , I n d o l e - 3 - A c e t i c A c i d ( I A A ) , M e r c u r i c C h l o r i d e ( H g C l 2 ) .

I N T R O D U C T I O N P l u m b a g o , r e p o r t e d t o c o m p r i s e 1 0 - 2 0 s p e c i e s ( f a m i l y P l u m b a g i n a c e a e ) , i s n a t i v e t o w a r m t e m p e r a t e t o t r o p i c a l r e g i o n s o f t h e W o r l d . I t c a n b e p r o p a g a t e d b y s e e d s o r c u t t i n g s . P l u m b a g o z e y l a n i c a L . i s a p e r e n n i a l r a m b l i n g s u b s c a n d e n t u n d e r s h r u b d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t I n d i a . F l o w e r s a r e w h i t e w i t h c o n s p i c u o u s g l a n d u l a r p e r s i s t e n t c a l y x . T h e r o o t i s a r i c h s o u r c e o f a l k a l o i d p l u m b a g i n , a n a t u r a l l y o c c u r r i n g n a p h t h o q u i n o n e , w h i c h i s r e p o r t e d t o h a v e w i d e p h a r m a c e u t i c a l a p p l i c a t i o n s s u c h a s a n t i b a c t e r i a l , a n t i f u n g a l , a n t i - f e r t i l i t y a n d a n t i - t u m o r p r o p e r t i e s ( K i n i e t a l , 1 9 9 6 ) . T h e r o o t s a r e u s e d i n m a n y A y u r v e d i c p r e p a r a t i o n s f o r t h e t r e a t m e n t o f d i s e a s e s l i k e d i a r r h o e a , d y s p e p s i a , r h e u m a t i s m , a n a s a r c a a n d p i l e s . I t i s a l s o e f f i c i e n t l y u s e d a s a d i u r e t i c , c a u s t i c a n d e x p e c t o r a n t . T h e r o o t e x t r a c t i s m a d e i n t o a p a s t e a n d a p p l i e d e x t e r n a l l y i n l e p r o s y a n d o t h e r s k i n d i s e a s e s . T h e i n c r e a s i n g d e m a n d o f h e r b a l m e d i c i n e i s d u e t o t h e i r f e w e r s i d e e f f e c t s i n c o m p a r i s o n t o s y n t h e t i c d r u g s a n d a n t i b i o t i c s ( K r i s h n a s w a m y a n d P u r u s h o t h a m a n , 1 9 8 0 ) . T h e g r a d u a l d e c l i n e i n t h e p o p u l a t i o n o f t h i s s p e c i e s d e m a n d s t h e l a u n c h i n g o f c o n s e r v a t i o n e f f o r t s s o a s t o e n s u r e c o n t i n u o u s a n d a m p l e s u p p l y b y e s t a b l i s h i n g a b a l a n c e d c y c l e o f h a r v e s t a n d r e n e w a l . S u c h c o n s e r v a t i o n s t r a t e g i e s w o u l d e n s u r e i m m e n s e a v a i l a b i l i t y o f t h i s v a l u a b l e m e d i c i n a l h e r b w h i c h i s i n g r e a t d e m a n d b y t h e p h a r m a c e u t i c a l i n d u s t r y . O n l y a s m a l l p e r c e n t a g e o f m e d i c i n a l p l a n t s , u s e d i n t h e i n d u s t r y a r e c u l t i v a t e d . M o s t o f t h e m a r e c o l l e c t e d f r o m t h e w i l d , v e r y o f t e n i n a d e s t r u c t i v e a n d u n s u s t a i n a b l e m a n n e r . K e e p i n g t h e a b o v e f a c t s i n m i n d , t h e p r e s e n t s t u d y w a s u n d e r t a k e n t o d e v e l o p a s u i t a b l e p r o t o c o l i n t h e s p e c i e s f o r t h e r a p i d p r o p a g a t i o n t h r o u g h s h o o t m u l t i p l i c a t i o n a n d d e n o v o o r g a n o g e n e s i s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S P l a n t m a t e r i a l N o d a l s e g m e n t s a n d l e a f s e g m e n t s o f P l u m b a g o z e y l a n i c a L . ( P l u m b a g i n a c e a e ) , c o l l e c t e d f r o m t h e g r e e n h o u s e , D e p a r t m e n t o f B o t a n y , U n i v e r s i t y o f K e r a l a , K a r i a v a t t o m , w e r e w a s h e d i n r u n n i n g t a p w a t e r f o l l o w e d b y s o a k i n g a n d w a s h i n g w i t h 1 0 % l a b o l e n e s o l u t i o n ( a c o m m e r c i a l n e u t r a l d e t e r g e n t , Q u a l i g e n s , I n d i a ) f o r 1 5 m i n . T h e e x p l a n t s a f t e r w a s h i n g w i t h s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r , w e r e s u r f a c e d i s i n f e c t e d w i t h H g C l 2 ( 0 . 1 % w / v f o r 8 m i n ) . A f t e r r e p e a t e d w a s h e s w i t h s t e r i l e d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r t o r e m o v e t r a c e s o f H g C l 2 , t h e e x p l a n t s w e r e t r i m m e d t o a p p r o p r i a t e s i z e s a n d i n o c u l a t e d . M e d i u m a n d c u l t u r e c o n d i t i o n s T h e e x p l a n t s w e r e c u l t u r e d i n M u r a s h i g e a n d S k o o g s ( 1 9 6 2 ) m e d i u m ( M S ) c o n t a i n i n g v a r i o u s g r o w t h r e g u l a t o r s ( B A P , K i n e t i n , N A A , I A A , I B A ) a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s e i t h e r a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n s . T h e d i s p e n s e d m e d i a , a f t e r a d j u s t m e n t o f t h e p H t o 5 . 7 ± 1 , w e r e a u t o c l a v e d a t 1 2 1 ° C a n d 1 5 l b s p r e s s u r e f o r 2 0 m i n . A l l t h e c u l t u r e s w e r e m a i n t a i n e d a t 2 4 ± 2 ° C u n d e r 1 2 h p h o t o p e r i o d w i t h 3 0 0 0 l u x l i g h t i n t e n s i t y u s i n g f l u o r e s c e n t l i g h t s a t 6 0 - 7 0 % r e l a t i v e h u m i d i t y . T e n c u l t u r e s w e r e r a i s e d f o r e a c h t r e a t m e n t a n d a l l e x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e d t h r i c e . C a u l o g e n e s i s T h e n o d e s o f 0 . 5 - 1 . 0 c m w e r e i n o c u l a t e d o n M S m e d i u m c o n t a i n i n g B A P a n d K I N a l o n e a t c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 5 - 3 m g / L ) w e r e u s e d f o r m u l t i p l i c a t i o n o f s h o o t s w h e r e a s B A P o r K I N a l o n e ( 1 - 4 m g / L ) o r i n c o m b i n a t i o n w i t h I A A ( 0 . 1 - 0 . 2 m g / L ) w e r e u s e d f o r d i r e c t r e g e n e r a t i o n f r o m n o d e s a n d l e a v e s . W i t h i n 1 0 d a y s , r a p i d g r o w t h h a s b e e n o b s e r v e d a n d t h e e x p l a n t s w e r e s u b c u l t u r e d a f t e r e v e r y 2 8 - 3 0 d a y s . I n v i t r o r o o t i n g T w o t o t h r e e c e n t i m e t e r s o f w e l l - d e v e l o p e d s h o o t s w e r e e x c i s e d a n d i n o c u l a t e d o n M S m e d i u m w i t h 3 % s u c r o s e c o n t a i n i n g i n d i v i d u a l c o n c e n t r a t i o n o f ( 0 . 5 - 2 m g / L ) I A A , I B A , a n d N A A . T h e c o m b i n a t i o n o f t w o d i f f e r e n t a u x i n s , N A A + I B A ( d a t a n o t p r e s e n t e d ) w e r e a l s o s t u d i e d . H a r d e n i n g a n d A c c l i m a t i z a t i o n M i c r o s h o o t s w i t h w e l l - d e v e l o p e d r o o t s y s t e m s w e r e t r a n s f e r r e d d i r e c t l y t o s m a l l p o t s c o n t a i n i n g s t e r i l e v e r m i c u l i t e a n d c o c o p e a t i n ( 1 : 1 ) r a t i o a n d n o u r i s h e d w i t h h a l f s t r e n g t h M S b a s a l l i q u i d m e d i u m . S u r v i v a l r a t e o f t h e p l a n t l e t s a n d t h e p l a n t l e t s e s t a b l i s h e d i n t h e f i e l d w e r e r e c o r d e d . E x p e r i m e n t a l d e s i g n a n d s t a t i s t i c a l a n a l y s i s A l l e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t i n a r a n d o m i z e d d e s i g n , t e n r e p l i c a t e s w e r e r a i s e d f o r e a c h t r e a t m e n t a n d e x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e d t h r i c e . T h e d a t a w e r e a n a l y z e d s t a t i s t i c a l l y u s i n g o n e w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) , a n d t h e d a t a , m e a n ± S D o f a t l e a s t t h r e e d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s w e r e r e p r e s e n t e d a n d c o m p a r e d u s i n g T u k e y - K r a m e r m u l t i p l e c o m p a r i s o n s t e s t w i t h t h e l e v e l o f s i g n i f i c a n t P < 0 . 0 5 . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N T h e m o r p h o g e n e t i c r e s p o n s e s o f n o d a l e x p l a n t s t o v a r i o u s c y t o k i n i n s ( B A P , K i n e t i n ) a r e r e p r e s e n t e d i n t h e t a b l e ( T a b l e 1 ) . N o d a l e x p l a n t s c u l t u r e d o n g r o w t h r e g u l a t o r f r e e M S m e d i u m 4 2 5 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 2 4 - 4 2 8 L u b a i n a e t a l . , 2 0 1 1

s h o w e d n o s i g n o f p r o l i f e r a t i o n e v e n a f t e r t w o w e e k s . A d d i t i o n o f a c y t o k i n i n w a s e s s e n t i a l t o i n d u c e m u l t i p l e s h o o t f o r m a t i o n f r o m t h e e x p l a n t s . O f t h e t w o c y t o k i n i n s t e s t e d , B A P w a s m o r e e f f e c t i v e t h a n K I N . T h e n o d a l s e g m e n t s r e s p o n d e d b y a n i n i t i a l e n l a r g e m e n t o f t h e d o r m a n t a x i l l a r y b u d s f o l l o w e d b y b u d b r e a k w i t h i n a w e e k , a n d m u l t i p l e s h o o t i n d u c t i o n a n d p r o l i f e r a t i o n w i t h i n f o u r w e e k s o f c u l t u r e . T h e f r e q u e n c y o f a x i l l a r y s h o o t p r o l i f e r a t i o n a n d t h e n u m b e r o f s h o o t s p e r e x p l a n t i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n o f B A P u p t o s o m e e x t e n t ( T a b l e 1 ) . B A P 1 m g / L s h o w e d t h e h i g h e s t s h o o t m u l t i p l i c a t i o n ( 2 0 . 2 ± 0 . 3 2 ) a b i l i t y ( P < 0 . 0 5 ) ( F i g . 1 ) . T h e r e s u l t s w e r e f o u n d s i g n i f i c a n t a t 5 % l e v e l . T h u s , t h e r e s u l t s s t r o n g l y s u g g e s t t h a t t h e B A P i s t h e m o s t e f f e c t i v e p l a n t g r o w t h r e g u l a t o r f o r i n d u c i n g m u l t i p l e s h o o t s i n P . z e y l a n i c a . T h e s e r e s u l t s w e r e i n c o n s o n a n t w i t h t h e m u l t i p l e s h o o t i n d u c t i o n r e p o r t e d i n C e r o p e g i a i n t e r m e d i a ( K a r u p p u s a m y e t a l . , 2 0 0 9 ) , C . b u l b o s a ( J o h n B r i t t o e t a l . , 2 0 0 3 ) , C . c a n d e l a b r u m ( B e e n a e t a l . , 2 0 0 3 ) a n d C e n t e l l a a s i a t i c a ( K a r t h i k e y a n e t a l . , 2 0 0 9 ) . M u l t i p l e s h o o t s o b t a i n e d o n M S m e d i u m c o n t a i n i n g 1 m g / L B A P a f t e r t w o w e e k s o f c u l t u r e w h e n t r a n s f e r r e d t o m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 2 - 0 . 5 m g / L G A 3 s h o w e d v a r i a b l e r a t e o f e l o n g a t i o n . M a x i m u m e l o n g a t i o n w a s o b s e r v e d w h e n t h e m e d i u m f o r t i f i e d w i t h 0 . 5 m g / L G A 3 ( F i g . 2 ) . T h e r e s u l t s w e r e f o u n d s i g n i f i c a n t a t 5 % l e v e l . T h e s t i m u l a t o r y e f f e c t o f G A 3 i n t h e e l o n g a t i o n o f s h o o t b u d i s b e c a u s e i t p r o m o t e s c e l l d i v i s i o n a n d e l o n g a t i o n i n t h e s u b a p i c a l z o n e o f t h e s h o o t s ( J o h n e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e r o l e o f G A 3 o n s h o o t d i f f e r e n t i a t i o n a n d e l o n g a t i o n h a s b e e n r e p o r t e d i n W i t h a n i a s o m n i f e r a ( S i v a n e s a n e t a l . , 2 0 0 7 ) . A d v e n t i t i o u s d e n o v o o r g a n o g e n e s i s w a s a c h i e v e d f r o m l e a f e x p l a n t s a f t e r 1 2 d a y s o f i n c u b a t i o n . A m o n g t h e v a r i o u s c o m b i n a t i o n s o f p l a n t g r o w t h r e g u l a t o r s u s e d , c y t o k i n i n s a l o n e w e r e v e r y e f f e c t i v e i n i n d u c i n g d i r e c t m o r p h o g e n e s i s . T h e r e s u l t s a r e i n c o r r o b o r a t i o n w i t h t h e o r g a n o g e n e s i s o b t a i n e d i n o t h e r p l a n t s ( F a i s a l a n d A n i s , 2 0 0 6 ; S h i n d e e t a l . , 2 0 0 9 ) . P r e s e n c e o f B A P ( 1 . 5 m g / L ) a l o n e i n t h e m e d i u m i n d u c e d t h e i n i t i a t i o n o f a b o u t f i f t e e n s h o o t s d i r e c t l y f r o m t h e e x p l a n t s a f t e r f o u r w e e k s o f c u l t u r e ( F i g . 3 ) . F u r t h e r i n c r e a s e i n c o n c e n t r a t i o n o f B A P o r K I N r e s u l t e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f l e s s e r n u m b e r o f s h o o t s ( T a b l e 2 ) . H i g h e r l e v e l s o f c y t o k i n i n m a y b e s u p r a o p t i m a l J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 2 4 - 4 2 8 4 2 6 L u b a i n a e t a l . , 2 0 1 1 C y t o k i n i n c o n c e n t r a t i o n C y t o k i n i n c o n c e n t r a t i o n M e a n n u m b e r o f s h o o t s a f t e r 3 0 d a y s * ( m g / L ) B A P B A P 0 . 5 0 9 . 0 ± 0 . 2 5 1 . 0 0 2 0 . 2 ± 0 . 3 2 1 . 5 0 1 5 . 7 ± 0 . 1 2 2 . 0 0 8 . 0 ± 0 . 8 4 2 . 5 0 5 . 7 ± 0 . 1 2 3 . 0 0 4 . 5 ± 0 . 1 2 0 0 . 5 6 . 4 ± 0 . 5 4 0 1 . 0 1 2 . 8 ± 0 . 3 2 0 1 . 5 8 . 5 ± 0 . 1 8 0 2 . 0 6 . 2 ± 0 . 7 4 0 2 . 5 4 . 8 ± 0 . 2 5 0 3 . 0 3 . 7 ± 0 . 2 5 T a b l e 1 . E f f e c t o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f c y t o k i n i n s o n M S m e d i u m f o r s h o o t m u l t i p l i c a t i o n i n P l u m b a g o z e y l a n i c a * V a l u e s r e p r e s e n t m e a n ± S D o f t e n r e p l i c a t e s a n d t h e e x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e d t h r i c e . T h e l e v e l o f s i g n i f i c a n c e a t 5 % p r o b a b i l i t y l e v e l . H o r m o n e s m g / L B A K I N I A A M e a n n u m b e r o f s h o o t s a f t e r 3 0 d a y s * ( m g / L ) 1 0 0 8 . 6 ± 0 . 1 2 1 . 5 0 0 1 5 . 2 ± 0 . 2 5 2 0 0 9 . 3 ± 0 . 7 4 3 0 0 5 . 6 ± 0 . 2 9 4 0 0 3 . 8 ± 0 . 3 5 0 1 0 6 . 8 ± 0 . 1 8 0 1 . 5 0 1 0 . 3 ± 0 . 2 5 0 2 0 7 . 0 ± 0 . 3 1 0 3 0 4 . 6 ± 0 . 5 4 0 4 0 3 . 2 ± 0 . 3 2 1 0 0 . 1 6 . 3 ± 0 . 2 3 1 . 5 0 0 . 1 1 0 . 3 ± 0 . 2 0 1 . 5 0 0 . 2 7 . 0 ± 0 . 3 1 2 0 0 . 1 5 . 8 ± 0 . 5 1 3 0 0 . 1 4 . 1 ± 0 . 1 2 4 0 0 . 2 3 . 0 ± 0 . 3 5 0 1 0 . 1 5 . 6 ± 0 . 3 1 0 1 . 5 0 . 1 8 . 8 ± 0 . 2 8 0 1 . 5 0 . 2 7 . 6 ± 0 . 1 2 0 2 0 . 1 4 . 9 ± 0 . 4 3 0 3 0 . 1 3 . 8 ± 0 . 1 8 0 4 0 . 2 2 . 7 ± 0 . 2 5 T a b l e 2 . E f f e c t o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f g r o w t h r e g u l a t o r s o n M S m e d i u m f o r D i r e c t o r g a n o g e n e s i s i n P l u m b a g o z e y l a n i c a * V a l u e s r e p r e s e n t m e a n ± S D o f t e n r e p l i c a t e s a n d t h e e x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e d t h r i c e . T h e l e v e l o f s i g n i f i - c a n c e a t 5 % p r o b a b i l i t y l e v e l .

f o r s h o o t r e g e n e r a t i o n . O f t h e t w o c y t o k i n i n s u s e d , B A P w a s f o u n d t o b e m o s t e f f e c t i v e f o r p r o d u c i n g m a x i m u m n u m b e r o f s h o o t s . S u p e r i o r i t y o f B A P o v e r K I N o n d e n o v o o r g a n o g e n e s i s w a s r e p o r t e d e a r l i e r i n E r y n g i u m f o e t i d u m ( G a y a t h r i e t a l . , 2 0 0 6 ) a n d P h y l l a n t h u s n i r u r i ( K a r t h i k e y a n e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h e s y n e r g i s t i c e f f e c t o f c y t o k i n i n s a n d a u x i n s a l s o f a v o r e d d i r e c t r e g e n e r a t i o n o f s h o o t s . B A P ( 1 . 5 m g / L ) w i t h 0 . 1 m g / L I A A i n d u c e d m a x i m u m s h o o t r e g e n e r a t i o n . C o m b i n a t i o n o f B A P a n d I A A f a v o r e d s h o o t i n i t i a t i o n w a s n o t e d i n t h e c a s e o f C a p s i c u m a n n u u m ( S o b h a n a k u m a r i a n d L a l i t h a k u m a r i , , 2 0 0 3 ) . T h e r e s u l t s w e r e f o u n d s i g n i f i c a n t a t 5 % l e v e l . I n d i v i d u a l c o n c e n t r a t i o n o f I A A , I B A , N A A a n d c o m b i n a t i o n o f t w o d i f f e r e n t a u x i n s w e r e u s e d f o r i n v i t r o r o o t i n g . I B A 1 . 5 m g / L i n d u c e d m a x i m u m n u m b e r o f r o o t s . T h e p r e s e n t r e s u l t c o i n c i d e s w i t h t h e o b s e r v a t i o n o b t a i n e d b y o t h e r s ( A b r i a n d S t a d e n , 2 0 0 1 ; V a d a w a l e e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e r o o t s i n d u c e d i n N A A c o n t a i n i n g m e d i u m w e r e l o n g b u t l e s s i n n u m b e r . H o w e v e r , t h e c o m b i n a t i o n o f t w o d i f f e r e n t a u x i n s I B A + N A A h a d t h e m a x i m u m i m p a c t o n t h e e l o n g a t i o n o f r o o t s . T h e w e l l d e v e l o p e d p l a n t l e t s w e r e t r a n s f e r r e d t o p l a s t i c c u p s c o n t a i n i n g a u t o c l a v e d v e r m i c u l i t e a n d c o c o p e a t i n 1 : 1 r a t i o . T h e p l a n t l e t s w e r e a c c l i m a t i z e d i n a m i s t c h a m b e r . T h e h u m i d i t y w a s m a i n t a i n e d a t 9 5 % i n t h e i n i t i a l d a y s . L a t e r o n , t h e p e r c e n t o f h u m i d i t y w a s d e c r e a s e d b y p r i c k i n g t h e p l a s t i c c o v e r w i t h a n e e d l e . O n t h e 3 0 t h d a y , t h e p l a n t s w e r e t r a n s f e r r e d t o t h e p o t s . T h e s u r v i v a l r a t e o f p l a n t l e t s w a s 9 0 % ( F i g . 4 ) . T h e r e s u l t s w e r e f o u n d s i g n i f i c a n t a t 5 % l e v e l . T h e p l a n t l e t s w e r e s u c c e s s f u l l y a d a p t e d t o t h e n a t u r a l e n v i r o n m e n t a n d e x h i b i t e d t h e i r s i m i l a r i t y w i t h t h a t o f m o t h e r p l a n t s . T h e p r e s e n t s t u d y t h e r e f o r e p r o j e c t s t h e s u c c e s s f u l m i c r o p r o p a g a t i o n p r o t o c o l e s t a b l i s h e d t h a t c a n b e e m p l o y e d i n t h e p r o p a g a t i o n o f P l u m b a g o z e y l a n i c a L . f o r i t s c o n s e r v a t i o n a n d d o m e s t i c a t i o n . A C K N O W L E D G E M E N T A u t h o r s a r e t h a n k f u l t o t h e H e a d , D e p a r t m e n t o f B o t a n y , U n i v e r s i t y o f K e r a l a , K a r i a v a t t o m , T h i r u v a n a n t h a p u r a m f o r p r o v i d i n g t h e n e c e s s a r y f a c i l i t i e s . R E F E R E N C E S A b r i A L , V a n S t a d e n J . 2 0 0 1 . M i c r o p r o p a g a t i o n o f t h e e n d a n g e r e d A l o e p o l y p h y l l a , P l a n t G r o w t h R e g u l a t . , 3 3 : 1 9 - 2 3 . B e e n a M R , M a r t i n K P , K i r t i B , H a r i h a r a n M . 2 0 0 3 . R a p i d i n v i t r o p r o p a g a t i o n o f m e d i c i n a l l y i m p o r t a n t C e r o p e g i a c a n d e l a b r u m , P l a n t C e l l T i s s u e O r g a n C u l t . , 7 2 : 2 8 5 - 2 8 9 . F a i s a l M , A n i s M . 2 0 0 6 . T h i d i a z u r o n i n d u c e d h i g h f r e q u e n c y a x i l l a r y s h o o t m u l t i p l i c a t i o n i n P s o r a l e a c o r y l i f o l i a . B i o l P l a n t . . , 5 0 : 4 3 7 - 4 4 0 . G a y a t h r i M C , M a d h u M , K a v y a s h r e e R , D h a n a n j a y a n , S P . 2 0 0 6 . A p r o t o c o l f o r i n v i t r o r e g e n e r a t i o n o f E r y n g i u m f o e t i d u m L . , I n d i a n J B i o t e c h n o l . , 5 : 2 4 9 - 2 5 1 . 4 2 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 2 4 - 4 2 8 L u b a i n a e t a l . , 2 0 1 1 F i g . ( 1 - 4 ) . I n v i t r o s h o o t m u l t i p l i c a t i o n a n d d i r e c t s h o o t r e g e n e r a t i o n o f P l u m b a g o z e y l a n i c a L : 1 . M u l t i p l e s h o o t i n d u c t i o n o n M S m e i u m + 1 m g / L B A P . 2 . E l o n g a t i o n o f m u l t i p l e s h o o t s o n M S m e d i u m + 0 . 5 m g / L G A 3 . 3 . A d v e n t i t i o u s s h o o t s o n M S m e d i u m + 1 . 5 m g / L B A P . 4 . A c c l i m a t i z e d p l a n t l e t .

J o h n B r i t t o S , N a t r a j a n E , A r o c k i a s a m y D I . 2 0 0 3 . I n v i t r o f l o w e r i n g a n d s h o o t m u l t i p l i c a t i o n f r o m n o d a l e x p l a n t s o f C e r o p e g i a b u l b o s a R o x b . V a r . b u l b o s a . T a i w a n i a . 4 8 : 1 0 6 - 1 1 1 . J o h n S , S o n i y a E V , V a l s a l a K , N a i r G M . 1 9 9 7 . I n v i t r o a d v e n t i t i o u s s h o o t f o r m a t i o n f r o m m a t u r e l e a v e s a n d l e a f d e r i v e d c a l l i o f N a r e g a m i a a l e a t a W & A . I n d i a n J E x p B i o l . , 3 5 : 1 2 4 9 - 1 2 5 1 . K a r t h i k e y a n K , C h a n d r a n C , K u l o t h u n g a n S . 2 0 0 9 . R a p i d c l o n a l m u l t i p l i c a t i o n t h r o u g h i n v i t r o a x i l l a r y s h o o t p r o l i f e r a t i o n o f C e n t e l l a a s i a t i c a L . , I n d i a n J B i o t e c h n o l . , 8 : 2 3 2 - 2 3 5 . K a r t h i k e y a n K , C h a n d r a n C , K u l o t h u n g a n S . 2 0 0 7 . R a p i d r e g e n e r a t i o n o f P h y l l a n t h u s n i r u r i L . f r o m s h o o t t i p a n d n o d a l e x p l a n t s , I n d i a n J A p p l P u r e B i o l . , 2 2 : 3 3 7 - 3 4 2 . K a r u p p u s a m y S , K i r a n m a i C , A r u n a V , P u l l a i a h T . 2 0 0 9 I n v i t r o c o n s e r v a t i o n o f C e r o p e g i a i n t e r m e d i a a n e n d e m i c p l a n t o f s o u t h I n d i a , A f r i c a n J o u r n a l o f B i o t e c h n o l o g y . , 8 ( 1 7 ) : 4 0 5 2 - 4 0 5 7 . K i n i D P , P a n d e y S , S h e n o y B D , S i n g h U V , U d u p p a N . 1 9 9 6 . A n t i t u m o r a n d a n t i f e r t i l i t y a c t i v i t i e s o f p l u m b a g i n s c o n t r o l l e d r e l e a s e f o r m u l a t i o n s , I n d i a n J E x p B i o l . , 3 5 : 3 7 4 - 3 7 9 . K r i s h n a s w a m y M , P u r u s h o t h a m a n , K K . 1 9 8 0 . P l u m b a g i n a s t u d y o f i t s a n t i c a n c e r , a n t i b a c t e r i a l a n d a n t i f u n g a l p r o p e r t i e s I n d i a n J E x p B i o l . , 1 8 : 8 7 6 - 8 7 7 . M u r a s h i g e T , S k o o g F . 1 9 6 2 . A r e v i s e d m e d i u m f o r r a p i d g r o w t h a n d b i o a s s a y s w i t h t o b a c c o t i s s u e c u l t u r e s . P h y s i o l P l a n t . . , 1 5 : 4 7 3 - 4 7 9 . S h i n d e A N , M a l p a t h a k N , F u l z e l e D P . 2 0 0 9 . I n d u c e d h i g h f r e q u e n c y s h o o t r e g e n e r a t i o n a n d e n h a n c e d i s o f l a v o n e s p r o d u c t i o n i n P s o r a l e a c o r y l i f o l i a , R e c N a t P r o d . , 3 : 3 8 - 4 5 . S i v a n e s a n I . 2 0 0 7 . D i r e c t r e g e n e r a t i o n f r o m a p i c a l b u d e x p l a n t s o f W i t h a n i a s o m n i f e r a D u n a l . I n d i a n J B i o t e c h n o l . , 6 : 1 2 5 - 1 2 7 . S o b h a k u m a r i V P , L a l i t h a k u m a r i D . 2 0 0 3 . D i r e c t p l a n t r e g e n e r a t i o n f r o m s h o o t t i p c u l t u r e s o f C a p s i c u m a n n u u m L . c v P L R - 1 , P h y t o m o r p h o l o g y 5 3 : 2 3 5 - 2 4 2 . V a d a w a l e A V , M e h t a - B h a t t P , D a v e A M . 2 0 0 4 . R a p i d i n v i t r o p r o p a g a t i o n o f A s w a g a n d h a ( W i t h a n i a s o m n i f e r a ) t h r o u g h a x i l l a r y b u d m u l t i p l i c a t i o n a n d i n d i r e c t o r g a n o g e n e s i s . P h y t o m o r p h o l o g y 5 4 : 5 9 - 6 4 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 2 4 - 4 2 8 4 2 8 L u b a i n a e t a l . , 2 0 1 1