J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A s s e s s m e n t o f v i a b i l i t y r e s p o n s e s o f r e f i n e r y e f f l u e n t b a c t e r i a a f t e r e x p o s u r e t o p h e n o l s t r e s s K e y w o r d s : P h e n o l t o x i c i t y , E x p o s u r e p e r i o d , V i a b i l i t y , B a c t e r i a . A B S T R A C T : T o x i c i t y o f p h e n o l o n t w o b a c t e r i a l s t r a i n s i s o l a t e d f r o m b i o l o g i c a l t r e a t m e n t u n i t o f p e t r o l e u m r e f i n e r y e f f l u e n t w a s a s s e s s e d b a s e d o n v i a b i l i t y r e s p o n s e s a f t e r e x p o s u r e t o i n c r e a s i n g d o s e s o f p h e n o l . V i a b i l i t y w a s b a s e d o n t h e r e d u c t i o n o f T T C v i a d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y i n v i a b l e c e l l s b u t n o t b y d e a d c e l l s a f t e r 1 , 2 , 3 a n d 4 h e x p o s u r e t o p h e n o l . T h e v i a b i l i t y r e s p o n s e s o f t h e o r g a n i s m s t o p h e n o l a r e t i m e d e p e n d e n t . A t 1 , 2 a n d 3 h o f e x p o s u r e , t h e r e w a s a s t i m u l a t i o n o f d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y i n P s e u d o m o n a s s p . R B D 1 a n d B a c i l l u s s p . R B D 2 . I n P s e u d o m o n a s s p . R B D 1 , d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y w a s p r o g r e s s i v e l y i n h i b i t e d a t p h e n o l c o n c e n t r a t i o n s g r e a t e r t h a n 2 5 0 m g / l a t 1 , 2 a n d 3 h . I n B a c i l l u s s p . R B D 2 , d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y w a s a l s o p r o g r e s s i v e l y i n h i b i t e d a t c o n c e n t r a t i o n s g r e a t e r t h a n 2 5 0 m g / l a t 1 h . T o t a l i n h i b i t i o n o c c u r r e d i n 4 h e x p o s u r e a t a l l c o n c e n t r a t i o n s o f p h e n o l i n b o t h o r g a n i s m s . T h e I C 5 0 r a n g e s f r o m 1 9 0 . 6 0 5 ± 9 . 7 8 6 t o 1 0 7 0 . 5 4 6 ± 2 3 . 1 2 7 m g / l . T h e r e s u l t s o f t h e v i a b i l i t y r e s p o n s e s a s s e s s m e n t o f t h e b a c t e r i a l s t r a i n s i n d i c a t e d t h a t t h e t o x i c i t y o f p h e n o l d e p e n d s o n t h e d u r a t i o n o f e x p o s u r e o f t h e o r g a n i s m s t o t h e t e s t c h e m i c a l . 5 9 4 - 6 0 2 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 8 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : N w a n y a n w u C E 1 a n d A b u G O 2 . I n s t i t u t i o n : 1 . D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , F e d e r a l u n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y , P . M . B . 1 5 2 6 , O w e r r i , N i g e r i a . 2 . D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , U n i v e r s i t y o f P o r t H a r c o u r t , P . M . B . 5 3 2 3 , P o r t H a r c o u r t , N i g e r i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : N w a n y a n w u C E E m a i l : c n w a n y a n w u 2 0 0 0 @ y a h o o . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 1 1 0 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 1 9 S e p 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 2 7 O c t 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 1 2 D e c 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : N w a n y a n w u C E a n d A b u G O . A s s e s s m e n t o f v i a b i l i t y r e s p o n s e s o f r e f i n e r y e f f l u e n t b a c t e r i a a f t e r e x p o s u r e t o p h e n o l s t r e s s J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 8 : 5 9 4 - 6 0 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h P a p e r

I N T R O D U C T I O N T h e n u m b e r , d i v e r s i t y a n d c o m p l e x i t y o f s y n t h e t i c c h e m i c a l c o m p o u n d s a r e o v e r w h e l m i n g a n d i t s u s e h a s p e r m e a t e d e v e r y a s p e c t s o f m o d e r n l i f e . A p a r t i c u l a r w i d e s p r e a d g r o u p o f t h e s e c h e m i c a l i s p h e n o l a n d i t s d e r i v a t i v e s . P h e n o l e n t e r s t h e e n v i r o n m e n t t h r o u g h w a s t e w a t e r d i s c h a r g e s f r o m a v a r i e t y o f i n d u s t r i e s s u c h a s l e a t h e r , t e x t i l e , p e t r o l e u m r e f i n e r y , c o k i n g - p l a n t s , p h a r m a c e u t i c a l s , c o a l c o n v e r s i o n , e t c a n d a l s o t h r o u g h t h e d e c o m p o s i t i o n o f a t t a c h e d a l g a e a n d p h y t o p l a n k t o n s ( A f z a l e t a l . , 2 0 0 7 , H i d a l g o e t a l . , 2 0 0 2 ) . I n r e f i n i n g o f c r u d e o i l p r o c e s s i n t h e r e f i n e r y , m a j o r i t y o f p h e n o l s p r e s e n t i n r e f i n e r y e f f l u e n t o r i g i n a t e f r o m t h e c a t a l y t i c c r a c k i n g p r o c e s s a n d c h e m i c a l s a d d e d a s a d d i t i v e s d u r i n g p h y s i c a l a n d c h e m i c a l t r e a t m e n t o f t h e c r u d e o i l ( J o r g e n s e n , 1 9 7 9 ) . P h e n o l i s v e r y t o x i c t o a l l f o r m s o f l i f e e v e n t o t h o s e a e r o b i c m e s o p h i l i c m i c r o o r g a n i s m s t h a t u t i l i z e i t a s a s o l e s o u r c e o f c a r b o n a n d e n e r g y ( G u r u g e y a l a k s h m i a n d O r i a l , 1 9 8 9 ) . T h i s a r o m a t i c c o m p o u n d i s w a t e r s o l u b l e a n d h i g h l y m o b i l e a n d a s s u c h i s l i k e l y e v e n t u a l l y t o r e a c h d o w n s t r e a m d r i n k i n g w a t e r s o u r c e s w h e r e , e v e n a t v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s , i t c a n c a u s e s e v e r e o d o u r a n d t a s t e p r o b l e m . T h e t o x i c a c t i o n o f p h e n o l i s a l w a y s a s s o c i a t e d w i t h l o s s o f c y t o p l a s m i c m e m b r a n e i n t e g r i t y . T h i s r e s u l t s i n d i s r u p t i o n e n e r g y t r a n s d u c t i o n , d i s t u r b a n c e o f m e m b r a n e b a r r i e r f u n c t i o n , i n h i b i t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n f u n c t i o n a n d s u b s e q u e n t c e l l d e a t h ( C o l l i n s a n d D a u g u l i s , 1 9 9 7 ; Y a p e t a l . , 1 9 9 9 ) . D u e t o i t s t o x i c i t y t o m i c r o o r g a n i s m s , p h e n o l m a y o f t e n c a u s e t h e b r e a k d o w n o f w a s t e w a t e r t r e a t m e n t s y s t e m s b y i n h i b i t i o n o f m i c r o b i a l g r o w t h ( R e n a n d F r y m i e r , 2 0 0 3 ) . T h i s s e n s i t i v e b a c t e r i a l a s s a y f o r t o x i c i t y a s s e s s m e n t s i s i m p o r t a n t . M a n y b i o l o g i c a l e n d p o i n t s a r e u s e d t o e v a l u a t e t o x i c i t y e f f e c t o f p h e n o l . T h i s i n c l u d e : c e l l p r o l i f e r a t i o n ( i n c r e a s e i n c e l l n u m b e r ) , m e m b r a n e d a m a g e ( l o s s o f i o n s o r c o f a c t o r s , N A D P H ) , i n c o r p o r a t i o n o f r a d i o a c t i v e p r e c u r s o r s ( t h y m i d y n e a n d D N A s y n t h e s i s ) , c e l l v i a b i l i t y ( c e l l n u m b e r , d y e r e d u c t i o n / u p t a k e ) , e t c . T h e r e s u l t s f r o m a n y c e l l u l a r i n v i t r o s y s t e m a r e n o t o n l y d e p e n d e n t o n t h e p r o p e r t i e s o f t h e c e l l t y p e u s e d b u t a l s o o n e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s s u c h a s t i m e , p H , m e d i u m c o m p o s i t i o n , e t c ( S k o w r o n a n d Z a p o r , 2 0 0 4 ) . L o n g - t e r m a s s a y s a r e b a s e d o n m e a s u r i n g c e l l s u r v i v a l a n d c e l l p r o l i f e r a t i o n o v e r p e r i o d s f r o m 2 4 h o u r t o s e v e r a l d a y s . S h o r t - t e r m a s s a y s i n v o l v e e x p o s u r e t o p o t e n t i a l t o x i c a n t s f o r p e r i o d s f r o m 1 m i n t o a b o u t 5 h o u r s a n d e n d p o i n t m e a s u r e m e n t s f o c u s e d o n c e l l v i a b i l i t y a n d c e l l m e m b r a n e d a m a g e . S h o r t - t e r m a s s a y s d e t e r m i n e t o x i c e f f e c t s m o r e e f f e c t i v e t h a n l o n g t e r m a s s a y w h e n f a s t d e g r a d a b l e o r g a n i c o r i n o r g a n i c s u b s t r a t e s a r e c o n s i d e r e d w h i c h e n h a n c e m i c r o b i a l g r o w t h . C o n t i n u o u s b i o m a s s q u a n t i f i c a t i o n u s i n g t h e t r a d i t i o n a l m e t h o d s s u c h a s g r a v i m e t r i c m e t h o d s , d i r e c t m i c r o s c o p i c c o u n t , p l a t e c o u n t , m e a s u r i n g c h a n g e s i n t h e o p t i c a l d e n s i t y a n d d e t e r m i n a t i o n o f c e l l c o n s t i t u e n t s a r e v e r y d i f f i c u l t ( G h a l y a n d M a h o m o u d , 2 0 0 6 ) . M e t h o d s t h a t a r e b a s e d o n m e a s u r i n g m i c r o b i a l e n z y m e s a c t i v i t y a r e f a s t g a i n i n g g r o u n d i n t h e a s s e s s m e n t o f c h e m i c a l t o x i c i t y t o m i c r o o r g a n i s m s . M e a s u r e m e n t o f m i c r o b i a l d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y i s u s e d i n t h e a s s e s s m e n t o f e c o t o x i c o l o g i c a l i m p a c t o f e n v i r o n m e n t a l s u b s t r a t e s a s t h e e n z y m e s a r e i n t r a c e l l u l a r ( M a t t h e w a n d O b b a r d , 2 0 0 1 ; R o s s e l e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e u s e o f d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n , c o n t r o l a n d m o n i t o r i n g o f t h e p r e s e n c e o f p o l l u t a n t s o f b o t h o r g a n i c a n d i n o r g a n i c i n s o i l , w a t e r a s w e l l a s w a s t e w a t e r a r e r e c o g n i z e d a s a u s e f u l i n d i c a t o r o f t h e o v e r a l l m e a s u r e o f i n t e n s i t y o f m i c r o b i a l m e t a b o l i s m ( F r i e d e l e t a l . , 1 9 9 4 ; Q u i l c h a n o a n d M a r a n o n , 2 0 0 2 ; R e p e t t o e t a l . , 2 0 0 1 ; C o r d i n a e t a l . , 1 9 9 3 ) . D e h y d r o g e n a s e s a r e t h e g r o u p o f e n d o c e l l u l a r e n z y m e s t h a t a r e p r e s e n t i n a l l l i v i n g c e l l s a n d a r e i n v o l v e d i n c a t a l y z i n g b i o l o g i c a l o x i d a t i o n o f o r g a n i c c o m p o u n d s . T h e y t r a n s f e r h y d r o g e n a n d e l e c t r o n s t h r o u g h a c h a i n o f i n t e r m e d i a t e e l e c t r o n c a r r i e r s t o o x y g e n a s a f i n a l e l e c t r o n a c c e p t o r w h i c h t h e n c o m b i n e s w i t h t h e m a n d f o r m w a t e r ( G h a l y a n d M a h o m o u d , 2 0 0 6 ) . T e t r a z o l i u m s a l t s a r e r e d u c e d b y v i a b l e c e l l s a n d n o t b y d e a d c e l l s . T h i s p r o p e r t y h a s b e e n u s e d i n a g r i c u l t u r e t o a s s e s s s e e d v i a b i l i t y ( A l t m a n , 1 9 7 6 ; B r e w e r , 1 9 4 9 ) a n d s i n c e t h e n m a n y o t h e r a p p l i c a t i o n s w e r e r e p o r t e d i n c l u d i n g t h e u s e o f t r i p h e n y l t e t r a z o l i u m c h l o r i d e ( T T C ) i n m i c r o b i o l o g y ( H u r w i t z a n d M c M c a r t h y , 1 9 8 6 ; J o n e s a n d P r a s a d , 1 9 6 9 ) . T h i s p a p e r a i m s a t a s s e s s i n g t h e v i a b i l i t y r e s p o n s e s o f r e f i n e r y e f f l u e n t b a c t e r i a b a s e d o n t h e r e d u c t i o n o f 2 , 3 , 5 - t r i p h e n y l t e t r a z o l i u m c h l o r i d e b y d e h y d r o g e n a s e e n z y m e a c t i v i t y a f t e r e x p o s u r e t o i n c r e a s i n g d o s e s o f p h e n o l . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f b a c t e r i a l s t r a i n s B a c t e r i a l s t r a i n s u s e d i n t h i s s t u d y w e r e i s o l a t e d f r o m t h e o u t l e t o f b i o l o g i c a l t r e a t m e n t u n i t ( R o t a r y b i o d i s k , R B D ) o f e f f l u e n t f r o m N i g e r i a o i l 5 9 5 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 8 : 5 9 4 - 6 0 2 N w a n y a n w u e t a l . , 2 0 1 1

r e f i n e r y c o m p a n y , P o r t H a r c o u r t , N i g e r i a . T h e y w e r e i s o l a t e d b a s e d o n t h e m o r p h o l o g i c a l , b i o c h e m i c a l a n d s u g a r f e r m e n t a t i o n t e s t s . A l l m i c r o b i a l i s o l a t i o n s w e r e p e r f o r m e d o n m i n e r a l s a l t s m e d i u m ( M S M ) c o n t a i n i n g ( g / l ) : K 2 H P O 4 , 0 . 7 5 0 ; K H 2 P O 4 , 0 . 8 4 0 ; ( N H 4 ) 2 S O 4 , 0 . 4 0 0 ; M g S O 4 . 7 H 2 O , 0 . 0 6 0 ; N a C l , 0 . 0 6 0 ; C a C l 2 , 0 . 0 6 0 ; F e C l 3 . 6 H 2 O , 0 . 0 6 0 . P h e n o l ( 2 . 5 m M ) w a s u s e d a s a s o l e s o u r c e o f c a r b o n a n d e n e r g y . 1 5 . 0 g o f a g a r w a s a d d e d a n d t h e p H a d j u s t e d t o 6 . 9 u s i n g p h o s p h a t e b u f f e r s . T h i s w a s f o l l o w e d b y t h e a d d i t i o n o f s t e r i l e a l i q u o t o f k e t o c o n a z o l e ( 5 0 µ g / m l ) i n t o t h e m e d i u m a f t e r s t e r i l i z a t i o n t o e x c l u d e f u n g i . T h e m e d i u m w a s t h e n p o u r e d i n t o P e t r i d i s h e s . B a c t e r i a l s t r a i n s w e r e i s o l a t e d b y s p r e a d i n g a l i q u o t s o f d e c i m a l l y d i l u t e d ( 1 0 - 4 ) e f f l u e n t s a m p l e o n t o t h e s u r f a c e o f t h e m e d i u m a n d i n c u b a t e d a t 3 0 o C f o r 7 2 h ( K a h r u e t a l . , 2 0 0 2 ) . M o r p h o l o g i c a l l y d i s t i n c t s t r a i n s w e r e i s o l a t e d a n d w e r e i n d i v i d u a l l y p u r i f i e d o n n u t r i e n t a g a r . C h a r a c t e r i z a t i o n s w e r e d o n e u s i n g s t a n d a r d m i c r o b i o l o g i c a l m e t h o d s . I d e n t i f i c a t i o n t o t h e g e n u s l e v e l f o l l o w e d t h e s c h e m e s o f H o l t e t a l . ( 1 9 9 4 ) . C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e r e f i n e r y w a s t e w a t e r w h i c h i s t h e s o u r c e o f t h e o r g a n i s m s a r e d e s c r i b e d i n T a b l e 1 . T h e p H , T o t a l D i s s o l v e s S o l i d s ( T D S ) , C h e m i c a l O x y g e n D e m a n d ( C O D ) , T o t a l H y d r o c a r b o n ( T H C ) , P h e n o l c o n c e n t r a t i o n a n d P h o s p h a t e ( P O 4 2 - ) a n d N i t r a t e ( N O 3 - ) i n t h e w a s t e w a t e r s a m p l e w e r e d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o t h e s t a n d a r d m e t h o d s ( A P H A , 1 9 9 8 ) . H e a v y m e t a l s i n t h e s a m p l e s w e r e e s t i m a t e d u s i n g A t o m i c A b s o r p t i o n S p e c t r o p h o t o m e t e r ( P e r k i n s E l m e r 3 1 1 0 , W a l t h a n , M a s s a c h u s e t t s , U S A ) T e s t c h e m i c a l s T h e f o l l o w i n g i t e m s w e r e p u r c h a s e d f r o m t h e i n d i c a t e d s o u r c e s : 2 , 3 , 5 - T r i p h e n y l T e t r a z o l i u m C h l o r i d e ( T T C ) ; p h e n o l ( C 6 H 5 O H , 9 9 % p u r e ) f r o m s i g m a c h e m i c a l C o ( S t . L o u i s , M o , U S A ) . A m y l a l c o h o l f r o m W a k o P u r e , c h e m i c a l i n d u s t r i e s O s a k a , J a p a n ) ; n u t r i e n t b r o t h a n d g l u c o s e f r o m D i f c o ( A l d r i c h c h e m i c a l c o m p a n y , M i l w a u k e e , W i s c o n s i n , U S A ) . P r e p a r a t i o n o f i n o c u l u m S e e d c u l t u r e s o f t h e s e l e c t e d b a c t e r i a l s t r a i n s w e r e g r o w n i n 1 0 0 m l n u t r i e n t b r o t h m e d i u m ( 0 . 8 % ) i n 2 5 0 m l E r l e n m e y e r f l a s k s , c o v e r e d w i t h c o t t o n w o o l w r a p p e d i n A l u m i n u m f o i l a n d i n c u b a t e d o n a r o t a r y s h a k e r ( 1 5 0 r p m ) f o r 2 4 h a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 8 ± 2 o C ) . C e l l s w e r e r e c o v e r e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 4 , 0 0 0 r p m f o r 1 5 m i n . H a r v e s t e d c e l l s w e r e w a s h e d t w i c e i n d e i o n i z e d d i s t i l l e d w a t e r t o a v o i d c a r r y o v e r a n d r e s u s p e n d e d i n t h e s a m e d e i o n i z e d d i s t i l l e d w a t e r . T h e r e s u s p e n d e d c e l l s w e r e s t a n d a r d i z e d i n a s p e c t r o p h o t o m e t e r t o a n o p t i c a l d e n s i t y o f 0 . 9 0 a t 5 4 0 n m . T h e d r y w e i g h t o f t h e s t a n d a r d i z e d c e l l s w a s d e t e r m i n e d b y d r y i n g 1 5 m l o f t h e c e l l s u s p e n s i o n s t o a c o n s t a n t w e i g h t i n a n o v e n ( G e l l a n k a m p . E n g l a n d ) a t 1 1 0 o C . T h e s t a n d a r d i z e d c e l l s u s p e n s i o n s w e r e u s e d a s i n o c u l u m i n t h e a s s a y . P r e p a r a t i o n a n d t r e a t m e n t o f i n o c u l u m w i t h t e s t c h e m i c a l E x p o s u r e ( c o n t a c t ) p e r i o d a s s a y t e c h n i q u e a s d e s c r i b e d b y H i d a l g o e t a l . , ( 2 0 0 2 ) w a s e m p l o y e d w i t h l i t t l e m o d i f i c a t i o n . B r i e f l y , a r a n g e o f i n c r e a s i n g d o s e s o f e x p o s u r e s o l u t i o n ( p h e n o l ) w a s p r e p a r e d i n 1 . 6 5 m l o f p h y s i o l o g i c a l s a l i n e ( 0 . 8 5 % ) m e d i u m i n s e p a r a t e 1 5 . 0 m l s c r e w c a p p e d t e s t g l a s s t u b e s a r r a n g e d i n f o u r g r o u p s t h a t r e p r e s e n t v a r i o u s e x p o s u r e t i m e p e r i o d . A l i q u o t s ( 0 . 3 5 m l ) o f t h e b a c t e r i a l s u s p e n s i o n s w e r e s e e d e d i n t o t h e t r i p l i c a t e g l a s s t u b e s b r i n g i n g t h e t o t a l v o l u m e o f t h e m i x t u r e i n t h e t u b e s t o 2 . 0 m l t o o b t a i n f i n a l p h e n o l c o n c e n t r a t i o n s o f 2 5 0 , 5 0 0 , 7 5 0 , 1 0 0 0 , 1 5 0 0 a n d 2 0 0 0 m g / l i n d i f f e r e n t t u b e s . T h e t u b e s w e r e i n c u b a t e d o n a r o t a r y i n c u b a t o r ( 1 5 0 r p m ) a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 8 ± 2 o C ) f o r a p p r o p r i a t e e x p o s u r e t i m e p e r i o d . T h e c o n t r o l c o n s i s t e d o f t h e o r g a n i s m a n d p h y s i o l o g i c a l s a l i n e m e d i u m w i t h o u t t h e t o x i c a n t ( p h e n o l ) . O n c e t h e e x p o s u r e p e r i o d ( c o n t a c t t i m e ) t o p h e n o l h a d e l a p s e d ( 1 , 2 , 3 o r 4 h ) , t h e m e d i u m w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n f o r 1 5 m i n a n d t h e p e l l e t e d c e l l s a r e w a s h e d t w i c e w i t h d e i o n i z e d d i s t i l l e d w a t e r . T h e r e a f t e r , 2 . 0 m l o f J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 8 : 5 9 4 - 6 0 2 5 9 6 N w a n y a n w u e t a l . , 2 0 1 1 T a b l e 1 : C h a r a c t e r i s t i c s o f B i o l o g i c a l t r e a t e d e f f l u e n t o f t h e o i l r e f i n e r y s a m p l e s P a r a m e t e r / u n i t W a s t e w a t e r ( v a l u e ) p H 7 . 6 4 T D S ( m g / l ) 2 5 0 T H C ( m g / l ) 1 5 . 0 B O D ( m g / l ) 8 . 0 C O D ( m g / l ) 7 6 . 0 P h e n o l ( m g / l ) 1 3 . 6 P O 4 2 - ( m g / l ) 0 . 1 4 N O 3 - ( m g / l ) 1 . 2 0 C u 2 + ( m g / l ) < 0 . 0 1 P b 3 + ( m g / l ) < 0 . 0 1