J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A m e l i o r a t i v e e f f e c t b y c a l c i u m o n N a C l s a l i n i t y s t r e s s r e l a t e d t o r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s m e t a b o l i s m i n A m a r a n t h u s t r i c o l o r L . K e y w o r d s : A m a r a n t h u s t r i c o l o r L . , P h a s e o l u s v u l g a r i s L . , s u p e r o x i d e a n i o n , H 2 O 2 ; N a C l , C a C l 2 , s u p e r o x i d e d i s m u t a s e , a s c o r b a t e p e r o x i d a s e , c a t a l a s e , g l u t a t h i o n e r e d u c t a s e , l i p i d p e r o x i d a t i o n . A B S T R A C T : S o i l s a l i n i t y a f f e c t s p l a n t g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t b y w a y o f o s m o t i c i m b a l a n c e w h i c h i n d u c e s o x i d a t i v e d a m a g e i n p l a n t t i s s u e s . O x i d a t i v e s t r e s s i s c a u s e d b y i n c r e a s e d p r o d u c t i o n o f A c t i v e O x y g e n S p e c i e s ( A O S ) , s u c h a s O 2 , O H , H 2 O 2 a n d 1 O 2 t h e s e l e a d t o l i p i d p e r o x i d a t i o n , e n z y m e i n a c t i v a t i o n a n d o x i d a t i v e d a m a g e t o D N A . P l a n t s h a v e a n t i o x i d a n t d e f e n s e s y s t e m s t o p r o t e c t a g a i n s t t h e p r o d u c t i o n a n d a c t i o n o f t h e A O S s . P l a n t s w i t h h i g h l e v e l o f a n t i o x i d a n t s , e i t h e r c o n s t i t u t i v e o r i n d u c e d , h a v e b e e n r e p o r t e d t o p r o d u c e g r e a t e r r e s i s t a n c e t o t h i s o x i d a t i v e d a m a g e i n p l a n t c e l l s . A O S s y n t h e s i s a n d i t s s c a v e n g i n g w e r e i n v e s t i g a t e d i n t h e c o n t r o l , d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f N a C l a n d N a C l + C a C l 2 s t r e s s e d A m a r a n t h u s t r i c o l o r L . a n d P h a s e o l u s v u l g a r i s L . . A O S s u c h a s s u p e r o x i d e a n i o n a n d H 2 O 2 c o n t e n t s h o w e d a s t e a d y i n c r e a s e i n t h e p l a n t s o f a l l N a C l t r e a t e d m e d i a c o m p a r e d t o c o n t r o l . W h e n t h e s a l i n i z e d m e d i a w e r e s u p p l e m e n t e d w i t h C a C l 2 t h e A O S l e v e l d r a s t i c a l l y d e c r e a s e d c o m p a r e d t o t h e c o r r e s p o n d i n g p l a n t s g r o w n o n s a l t a l o n e . S i m i l a r l y , t h e a c t i v i t y o f a n t i o x i d a n t e n z y m e s s u c h a s s u p e r o x i d e d i s m u t a s e , a s c o r b a t e p e r o x i d a s e , c a t a l a s e a n d g l u t a t h i o n e r e d u c t a s e u n d e r s a l t s t r e s s w e r e h i g h e r i n N a C l + C a C l 2 s u p p l e m e n t e d m e d i a t h a n t h e p l a n t s o n t h e s a l i n i z e d m e d i a a l o n e . T h i s s u g g e s t e d t h a t t h e a l l e v i a t i o n e f f e c t o f c a l c i u m u n d e r s a l i n e c o n d i t i o n w a s t h r o u g h m o d u l a t i o n o f t h e e n z y m e c o m p l e x e s t h a t a c c e l e r a t e t h e r a t e o f a n t i o x i d a n t e n z y m e s b i o s y n t h e s i s u n d e r s a l t s t r e s s . S i m i l a r l y , t h e l e v e l o f l i p i d p e r o x i d a t i o n w a s f o u n d t o b e l o w e r i n p l a n t s o f a l l N a C l + C a C l 2 m e d i a t h a n c o n t r o l . 4 1 1 - 4 1 8 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 6 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : S u n u k u m a r S S , H a r i s h S R , M a n o j G S , S r e e l e k s h m i S G , R e m y a K r i s h n a n , L u b a i n a A S a n d M u r u g a n K . I n s t i t u t i o n : P l a n t B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r b i o l o g y L a b , D e p a r t m e n t o f B o t a n y , U n i v e r s i t y C o l l e g e , T h i r u v a n a n t h a p u r a m - 6 9 5 0 3 4 , K e r a l a , I n d i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : M u r u g a n K . E m a i l : h a r i m u r u k a n @ g m a i l . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 1 0 9 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 1 7 S e p 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 0 8 O c t 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 1 2 O c t 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : S u n u k u m a r S S , H a r i s h S R , M a n o j G S , S r e e l e k s h m i S G , R e m y a K r i s h n a n , L u b a i n a A S a n d M u r u g a n K . A m e l i o r a t i v e e f f e c t b y c a l c i u m o n N a C l s a l i n i t y s t r e s s r e l a t e d t o r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s m e t a b o l i s m i n A m a r a n t h u s t r i c o l o r L . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 1 1 - 4 1 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h P a p e r

I N T R O D U C T I O N S o i l s a l i n i t y i s a n i n e v i t a b l e p r o b l e m f o r a g r i c u l t u r e i n m o s t p a r t s o f t h e w o r l d . B e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e m e c h a n i s m s t h a t e n a b l e p l a n t s t o a d a p t t o s a l t s t r e s s i s n e c e s s a r y t o m a k e t h e b e s t u s e o f t h e s e s a l i n e s o i l s . C e l l u l a r m e c h a n i s m s a r e e s p e c i a l l y i m p o r t a n t t o g l y c o p h y t e s , i n w h i c h p h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l p r o c e s s e s c o n t r i b u t e t o t h e a d a p t a t i o n t o s a l t s t r e s s . I n r e c e n t y e a r s , b i o c h e m i c a l r e s p o n s e s o f p l a n t s t o s a l t s t r e s s h a v e b e e n s t u d i e d i n t e n s i v e l y . O n e o f t h e b i o c h e m i c a l c h a n g e s p o s s i b l y i n d u c e d b y s a l t s t r e s s i s t h e i n c r e a s e d p r o d u c t i o n o f A c t i v e O x y g e n S p e c i e s ( A O S ) ( Y i l d i r i m e t a l . , 2 0 0 6 ; V a i d y a n a t h a n e t a l . 2 0 0 3 ; M i c h a e l a e t a l . , 2 0 0 2 ) . R O S a r e h i g h l y r e a c t i v e a n d w h e n t h e c a p a c i t y o f p l a n t f o r s c a v e n g i n g i s l e s s t h a n R O S p r o d u c t i o n t h e y c a n s e r i o u s l y d i s r u p t n o r m a l m e t a b o l i s m t h r o u g h o x i d a t i v e d a m a g e s o f l i p i d s , p r o t e i n s a n d n u c l e i c a c i d s . P l a n t s p o s s e s a n u m b e r o f a n t i o x i d a n t s y s t e m s t h a t p r o t e c t t h e m f r o m t h e s e p o t e n t i a l c y t o t o x i c e f f e c t s . A n t i o x i d a n t e n z y m e s a r e t h e m o s t i m p o r t a n t c o m p o n e n t s i n t h e s c a v e n g i n g s y s t e m o f R O S . S u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( S O D ) i s a m a j o r s c a v e n g e r o f O 2 . a n d i t s e n z y m a t i c a c t i o n r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f H 2 O 2 . C a t a l a s e ( C A T ) , a s c o r b a t e p e r o x i d a s e ( A P X ) a n d a v a r i e t y o f g e n e r a l p e r o x i d a s e s c a t a l y z e t h e b r e a k d o w n o f H 2 O 2 . T h e r e f o r e , t h e s e e n z y m a t i c s y s t e m s e l i m i n a t e t h e d a m a g i n g e f f e c t s o f t o x i c o x y g e n s p e c i e s . P a r a q u a t i s a r e d o x - a c t i v e c o m p o u n d w i l d l y u s e d t o c o n t r o l e x i s t i n g v e g e t a t i o n ( S u n t r e s , 2 0 0 2 ; S k o ´ r z y n s k a - P o l i t e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h e m e c h a n i s m s o f p a r a q u a t t o x i c i t y i n v o l v e : 1 ) t h e g e n e r a t i o n o f t h e O 2 . i n t h e l i g h t , w h i c h c a n l e a d t o t h e f o r m a t i o n o f m o r e t o x i c A O S , s u c h a s O H 2 ) l i p i d p e r o x i d a t i o n w h i c h r e s u l t s i n t h e o x i d a t i v e d e g e n e r a t i o n o f c e l l u l a r p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s . T h e r e f o r e , t h e a i m o f t h i s w o r k w a s t o e v a l u a t e t h e e f f e c t s o f N a C l s t r e s s a n d i t s a l l e v i a t i o n b y c a l c i u m o n a c t i v e o x y g e n s p e c i e s f o r m a t i o n , t h e l i p i d p e r o x i d a t i o n a n d t h e a c t i v i t y o f a n t i o x i d a t i v e e n z y m e s i n A m a r a n t h u s t r i c o l o r L . a n d P h a s e o l u s v u l g a r i s L . i n o r d e r t o b e t t e r u n d e r s t a n d t h e i r d i f f e r e n c e s o n s a l t s t r e s s t o l e r a n c e . Q u a n t i f i c a t i o n o f s u p e r o x i d e a n i o n ( O 2 . - ) T h e O 2 . - p r o d u c t i o n r a t e w a s m e a s u r e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( J i a n g a n d Z h a n g , 2 0 0 2 ) w i t h s o m e m o d i f i c a t i o n s . 0 . 2 g l e a f t i s s u e w a s h o m o g e n i z e d i n 1 m l o f 5 0 m M T r i s H C l ( p H 7 . 5 ) a n d c e n t r i f u g e d a t 5 0 0 0 × g f o r 1 0 m i n a t 4 ° C . T h e r e a c t i o n m i x t u r e ( 1 m l ) c o n t a i n e d 2 0 0 m l s u p e r n a t a n t a n d 8 0 0 m l 0 . 5 m m 3 - b i s ( 2 - m e t h o x y - 4 - n i t r o - 5 - s u l f o p h e n y l ) - 2 H - t e t r a z o l i u m - 5 - c a r b o x a n i l i d e i n n e r s a l t ( X T T s o d i u m s a l t ) . T h e O 2 . - p r o d u c t i o n r a t e w a s c a l c u l a t e d u s i n g m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t 2 . 1 6 × 1 0 4 M - 1 c m - 1 . Q u a n t i f i c a t i o n o f h y d r o g e n p e r o x i d e ( H 2 O 2 ) H o r s e r a d i s h P O X - c a t a l y s e d o x i d a t i o n o f T M B w a s u s e d f o r t h e q u a n t i f i c a t i o n o f H 2 O 2 a n d w a s m e a s u r e d c o l o r i m e t r i c a l l y a t 4 5 0 n m ( G a l l a t e a n d P r a c h t , 1 9 8 5 ) , L i p i d P e r o x i d a t i o n T h e l e v e l o f l i p i d p e r o x i d a t i o n i n t h e c e l l s w a s m e a s u r e d i n t e r m s o f m a l o n d i a l d e h y d e c o n t e n t d e t e r m i n e d b y t h e t h i o b a r b i t u r i c a c i d r e a c t i o n a s d e s c r i b e d b y H e a t h a n d P a c k e r , ( 1 9 6 8 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n o f m a l o n d i a l d e h y d e w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t 1 5 5 m m / L . A n t i o x i d a n t e n z y m e e x t r a c t i o n a n d a s s a y O l d a n d y o u n g l e a v e s ( 0 . 5 g ) w e r e h o m o g e n i z e d i n 2 5 m m K - p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 8 ) c o n t a i n i n g 0 . 4 m m E D T A , 1 m M a s c o r b a t e a n d 2 % ( w / v ) p o l y v i n y l p o l y p y r r o l i d o n e ( P V P P ) . T h e h o m o g e n a t e w a s t h e n c e n t r i f u g e d a t 1 5 , 0 0 0 x g f o r 2 0 m i n a t 4 ° C . T h e f i l t e r e d s u p e r n a t a n t w a s u s e d a s a n e n z y m e e x t r a c t f o r A P X , C A T a n d G R ( Y a n a g i d a e t a l . 1 9 9 9 ) . . F o r S O D a s s a y , t h e e x t r a c t w a s d i a l y z e d o v e r n i g h t w i t h 1 0 m m K - p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 8 ) a t 4 ° C . T h e d i a l y z e d e x t r a c t w a s c e n t r i f u g e d a t 1 5 , 0 0 0 x g f o r 2 0 m i n a t 4 ° C . S u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( S O D ) a s s a y w a s c a l c u l a t e d f o l l o w i n g t h e f o r m u l a b e l o w ; ( V b / V s ) - 1 , w h e r e V b i s t h e r e a c t i o n r a t e o f t h e b l a n k a n d V s i s t h e r e a c t i o n r a t e o f t h e s a m p l e . C a t a l a s e ( C A T ) r e a c t i o n m i x t u r e c o n s i s t e d o f 5 0 m m K - p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) c o n t a i n i n g 1 0 m m H 2 O 2 ( 0 . 9 5 m l ) a n d e n z y m e e x t r a c t ( 0 . 0 5 m l ) w a s p r e p a r e d . I m m e d i a t e l y a f t e r a d d i n g t h e e n z y m e t o t h e b u f f e r , t h e i n i t i a l r a t e o f a b s o r b a n c e a t 2 4 0 n m w a s d e t e r m i n e d . T h e m o l a r a b s o r p t i o n c o e f f i c i e n t o f H 2 O 2 ( 0 . 0 4 / m m / c m ) w a s u s e d t o c a l c u l a t e t h e e n z y m e a c t i v i t y . G l u t a t h i o n e r e d u c t a s e ( G R ) a s s a y m i x t u r e c o n s i s t e d o f 1 0 0 m m K - p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 8 ) ( 0 . 2 5 m l ) , 1 0 m m o x i d i z e d g l u t a t h i o n e ( G S S G ) ( 0 . 0 5 m l ) , d i s t i l l e d w a t e r ( 0 . 4 8 m l ) , 1 m m N A D P H ( 0 . 1 2 m l ) a n d e n z y m e e x t r a c t ( 0 . 1 m l ) w a s p r e p a r e d . T h e a s s a y w a s s t a r t e d b y a d d i t i o n o f G S S G . G R a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d f r o m t h e r a t e o f N A D P H o x i d a t i o n m e a s u r i n g t h e d e c r e a s e o f a b s o r b a n c e a t 3 4 0 n m . T h e m o l a r a b s o r p t i o n c o e f f i c i e n t o f N A D P H ( 6 . 1 / m m / c m ) w a s u s e d t o c a l c u l a t e t h e e n z y m e a c t i v i t y . I n a s c o r b a t e p e r o x i d a s e ( A P X ) a s s a y , t h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n s i s t e d o f 1 0 0 m m K - p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) 4 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 1 1 - 4 1 8 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1

( 0 . 2 5 m l ) , 1 m M a s c o r b a t e ( 0 . 2 5 m l ) , 0 . 4 m m E D T A ( 0 . 2 5 m l ) , d i s t i l l e d w a t e r ( 0 . 1 9 m l ) , 1 0 m m H 2 O 2 ( 0 . 0 1 m l ) a n d e n z y m e e x t r a c t ( 0 . 0 5 m l ) w a s u s e d . T h e r e a c t i o n w a s s t a r t e d b y a d d i n g H 2 O 2 a n d t h e o x i d a t i o n r a t e o f a s c o r b a t e w a s m e a s u r e d b y t h e i n i t i a l r a t e o f d e c r e a s e o f a b s o r b a n c e a t 2 9 0 n m . T h e m o l a r a b s o r p t i o n c o e f f i c i e n t o f a s c o r b a t e ( 2 . 8 / m m / c m ) w a s u s e d t o c a l c u l a t e t h e e n z y m e a c t i v i t y . P a r a q u a t s e n s i t i v i t y a s s a y T e n d i s c s w i t h 4 m m d i a m e t e r w e r e e x c i s e d f r o m t h e N a C l a n d N a C l + C a C l 2 t r e a t e d l e a v e s a n d s o a k e d i n t o 3 m l o f 0 . 3 μ m o f p a r a q u a t ( 1 , 1 - d i m e t h y l - 4 , 4 - b i p i r i d i n i u m d i c h l o r i d e s a l t ) s o l u t i o n w i t h t h e i r a d a x i a l s i d e u p . P a r a q u a t s o a k e d t r e a t e d l e a v e s w e r e p r e i n c u b a t e d i n t h e d a r k f o r 1 h a n d t h e n i r r a d i a t e d w i t h f l u o r e s c e n t l i g h t ( 2 6 0 - 2 8 0 μ E / m 2 / s ) a t 2 5 ° C f o r 4 8 h . C h l o r o p h y l l c o n t e n t s i n t h e l e a f d i s c s w e r e d e t e r m i n e d w i t h t h e m o d i f i e d m e t h o d d e s c r i b e d b y C h a p p e l l e e t a l . ( 1 9 9 2 ) . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s T h e d a t a o b t a i n e d w e r e a n a l y z e d s t a t i s t i c a l l y a n d t h e r e s u l t s a r e p r e s e n t e d a s M e a n ± S t a n d a r d d e v i a t i o n . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N A p p l i c a t i o n o f e x t e r n a l N a C l + C a l c i u m ( 5 m M C a C l 2 ) e l e v a t e d g r e a t l y F W a n d D W c o m p a r e d t o N a C l a l o n e i n b o t h s p e c i e s , b u t d i f f e r e n t l y i . e . , F W o f r o o t a n d s h o o t i n A . t r i c o l o r r a n g e d b e t w e e n 0 . 4 t o 1 . 8 8 ; 0 . 5 8 2 f o l d r e s p e c t i v e l y w h e r e a s , i n P . v u l g a r i s i t w a s 0 . 6 8 - 0 . 8 3 ; 0 . 4 3 0 . 5 8 f o l d . S i m i l a r l y t h e D W o f r o o t a n d s h o o t i n A . t r i c o l o r w a s 0 . 7 4 - 1 . 4 7 a n d 0 . 6 3 1 . 6 f o l d . H o w e v e r , i n P . v u l g a r i s e x t e r n a l c a l c i u m t r e a t m e n t h a d l e s s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e o n F W a n d D W o f s h o o t i n c o m p a r i s o n w i t h t h e s a m e p a r a m e t e r s i n t h e c o n t r o l ( T a b l e 1 a & b ) . E x t e r n a l C a 2 + o n O 2 - a n d H 2 O 2 C o n t e n t T h e t r e n d o f O 2 - a n d H 2 O 2 c o n t e n t w a s r e m a r k a b l y d i f f e r e n t b e t w e e n t r e a t m e n t s c o n t a i n i n g e x t e r n a l c a l c i u m ( T a b l e 2 & 3 ) . O 2 - a n d H 2 O 2 c o n t e n t r e d u c e d m a r g i n a l l y i n s t r e s s m e d i a c o n t a i n i n g o n l y e x t e r n a l c a l c i u m ( 5 m m C a C l 2 ) , i n b o t h t h e s p e c i e s ( d a t a n o t s h o w n ) . B u t N a C l + C a C l 2 t r e a t e d p l a n t s s h o w s a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n O 2 - a n d H 2 O 2 c o n t e n t u p t o 2 0 0 m m N a C l i n A . t r i c o l o r a n d t h e r e a f t e r t h e f r e e r a d i c a l c o n t e n t s l i g h t l y i n c r e a s e d . I n P . v u l g a r i s , e x t e r n a l C a 2 + d i d n o t s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d O 2 - a n d H 2 O 2 c o n t e n t a f t e r 1 0 0 m m N a C l c o n c e n t r a t i o n . C a 2 + t r e a t m e n t o n M D A C o n t e n t A p p l i c a t i o n o f e x t e r n a l C a 2 + + N a C l c o u l d r e d u c e M D A c o n t e n t c o n s i d e r a b l y , c o m p a r e d w i t h N a C l s t r e s s m e d i a i n A . t r i c o l o r , w h e r e a s m a r g i n a l l y i n P . v u l g a r i s , c o m p a r e d w i t h t h o s e o f n o n - e x t e r n a l c a l c i u m m e d i u m c o n t a i n o n l y N a C l ( 1 5 0 m m ) ( T a b l e 4 ) . H o w e v e r , i n c o n t r o l , a p p l i c a t i o n o f e x t e r n a l c a l c i u m m a d e n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e t o M D A c o n t e n t c o m p a r e d w i t h n o n - e x t e r n a l C a 2 + m e d i a . P a r a q u a t a s s a y E f f e c t o f p a r a q u a t o n l e a f d i s c s p r e p a r i n g f r o m t h e s e e d l i n g s t r e a t e d w i t h N a C l + C a 2 + w e r e d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g c h l o r o p h y l l c o n t e n t s ( F i g . 1 A & B ) . C h l o r o p h y l l c o n t e n t s i n t h e y o u n g a n d o l d l e a f d i s c s o f A . t r i c o l o r b o t h o f n o n t r e a t e d a n d t r e a t e d w i t h 0 . 3 μ M p a r a q u a t s l i g h t l y i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g N a C l + C a 2 + c o n c e n t r a t i o n . I n c o n t r a s t , c h l o r o p h y l l c o n t e n t s i n t h e y o u n g a n d o l d l e a f d i s c s o f P . v u l g a r i s w e r e g r e a t l y r e d u c e d w i t h i n c r e a s i n g N a C l + C a 2 + c o n c e n t r a t i o n . C h l o r o p h y l l c o n t e n t s i n t h e d i s k s w e r e m e a s u r e d t o d e t e r m i n e t h e d e c o m p o s i t i o n o f t h e p i g m e n t c a u s e d b y g e n e r a t e d A O S . W i t h i n c r e a s i n g N a C l c o n c e n t r a t i o n s + 5 m m C a 2 + , c h l o r o p h y l l c o n t e n t s i n t h e d i s c s f r o m y o u n g a n d o l d l e a v e s o f J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 1 1 - 4 1 8 4 1 3 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1 N a C l C o n c . ( m M ) 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 R o o t F r e s h w e i g h t 4 . 1 ± 0 . 6 6 . 9 ± 0 . 3 4 . 2 ± 0 . 2 3 . 4 ± 0 . 2 2 . 4 ± 0 . 3 1 . 6 ± 0 . 2 D r y w e i g h t 0 . 3 8 ± 0 . 0 4 0 . 5 6 ± 0 . 7 0 . 4 2 ± 0 . 1 0 . 4 2 ± 0 . 1 0 . 3 5 ± 2 0 . 2 8 ± 0 . 1 S h o o t F r e s h w e i g h t 3 . 8 ± 0 . 4 7 . 6 ± 0 . 2 5 . 0 4 ± 0 . 2 5 . 4 ± 0 . 1 3 . 1 ± 0 . 6 2 . 2 ± 0 . 3 D r y w e i g h t 0 . 7 6 ± 0 . 1 1 . 2 ± 0 . 4 0 . 6 4 ± 0 . 3 0 . 6 1 ± 0 . 1 0 . 5 3 ± 1 0 . 4 8 ± 0 . 2 T a b l e 1 a . E f f e c t o f N a C l + C a C l 2 ( 5 m M ) o n f r e s h a n d d r y w e i g h t s ( g / p l a n t ) o f 1 4 d a y s o l d A . t r i c o l o r s e e d l i n g s . N a C l C o n c . ( m M ) 0 5 0 1 0 0 1 5 0 F r e s h w e i g h t 8 . 2 ± 0 . 3 6 . 8 ± 0 . 2 5 . 6 ± 0 . 4 D R o o t D r y w e i g h t 0 . 6 ± 0 . 8 9 0 . 4 5 ± 0 . 3 0 . 4 ± 0 . 2 D S h o o t F r e s h w e i g h t 7 . 2 ± 0 . 6 4 . 2 ± 0 . 2 3 ± 0 . 2 D D r y w e i g h t 0 . 8 6 ± 3 0 . 5 8 ± 0 . 1 0 . 4 ± 1 D T a b l e 1 b . E f f e c t o f N a C l + C a C l 2 ( 5 m M ) o n f r e s h a n d d r y w e i g h t s ( g / p l a n t ) o f 1 4 d a y s o l d P . v u l g a r i s s e e d l i n g s ( D = d e a d ) .

A . t r i c o l o r d i d n o t d e c r e a s e . O n t h e c o n t r a r y , t o l e r a n c e t o p a r a q u a t w a s s l i g h t l y h i g h e r i n N a C l + C a 2 + t r e a t e d p l a n t s . T h i s f i n d i n g i n d i c a t e s t h a t t h i s s p e c i e s h a s g r e a t e r t o l e r a n c e t o t h e t o x i c i t y o f A O S . A n t i o x i d a t i v e e n z y m e s y s t e m i n A . t r i c o l o r s e e m e d t o b e e f f e c t i v e f o r e l i m i n a t i o n o f A O S w h i c h a r i s e s f r o m s a l t s t r e s s . I n c a s e o f P . v u l g a r i s , i t w a s d i f f i c u l t t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e t r e a t e d p a r a q u a t c a u s e r e d u c t i o n o f c h l o r o p h y l l c o n t e n t w i t h t h e 5 0 a n d 1 0 0 m M N a C l t r e a t m e n t , b e c a u s e t h e l e a v e s s h o w e d c h l o r o s i s a n d n e c r o s i s . C a 2 + t r e a t m e n t o n A P X , S O D , C A T a n d G R T h e a n t i o x i d a n t e n z y m e a c t i v i t y t r e n d s i n t h e s p e c i e s w e r e s i m i l a r t o c o n t r o l p l a n t s c o n t a i n i n g o n l y e x t e r n a l c a l c i u m ( C a C l 2 ) . H o w e v e r , a p a r a m o u n t i n c r e a s e i n a c t i v i t i e s o f a n t i o x i d a n t m a c h i n e r y w a s o b s e r v e d i n t h e s p e c i e s w h e n t r e a t e d w i t h e x t e r n a l c a l c i u m + N a C l i . e . , S O D , C A T , a n d A P X a c t i v i t i e s w e r e h i g h e r t h a n i n m e d i a c o n t a i n o n l y N a C l ( T a b l e 5 a & b ) . G R s h o w e d s t e a d y a c t i v i t y i n a l l t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s i r r e s p e c t i v e o f t r e a t m e n t s . I n r e c e n t y e a r s , i t h a s b e e n w i d e l y n o t e d t h a t C a 2 + p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e a d a p t a t i o n o f p l a n t s t o a d v e r s e e n v i r o n m e n t s ( B o w l e r a n d F l u h r , 2 0 0 0 ) . I t w a s i n d i c a t e d t h a t C a 2 + h a d a p e r t a i n i n g r o l e i n p r e v e n t i n g c e l l m e m b r a n e i n j u r y a n d l e a k a g e a s w e l l a s s t a b i l i z i n g c e l l m e m b r a n e s t r u c t u r e u n d e r a d v e r s e e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s ( P i e e t a l . , 2 0 0 0 ) . I n v i t r o s t u d i e s o n t h e c e l l w a l l f o r m a t i o n i n s p r u c e h y p o c o t y l c u t t i n g s i n d i c a t e d t h a t C a 2 + w a s e s s e n t i a l a n d i t s a b s e n c e m a d e t h e w a l l m o r e s u s c e p t i b l e t o i n j u r y ( P r i c e e t a l . , 1 9 9 4 ) . S h a b a l a e t a l . , ( 1 9 9 7 ) o b s e r v e d t h a t h i g h e r C a 2 + c o n c e n t r a t i o n w a s i m p o r t a n t i n m a i n t a i n i n g c e l l m e m b r a n e i n t e g r i t y u n d e r w a t e r s t r e s s e d c o n d i t i o n s a n d t h a t w a s a f u n c t i o n s p e c i f i c t o C a 2 + . I n t h i s s t u d y , a p p l i c a t i o n o f e x t e r n a l c a l c i u m r e s u l t e d i n h i g h e r F W a n d D W c o n t e n t a n d l o w e r M D A c o n t e n t i n c e l l s c o m p a r e d w i t h t h e c o n t e n t s i n m e d i a w i t h o n l y N a C l . T h e d a t a s u g g e s t e d t h a t m o r e c o n c e n t r a t e d C a C l 2 t r e a t m e n t c o u l d s i g n i f i c a n t l y m i t i g a t e t h e d a m a g e o f N a C l s t r e s s , a n d t h e e f f e c t w a s s p e c i f i c t o C a 2 + m o d u l a t e d p r o t e i n s . O u r d a t a s h o w e d t h a t t h e a c t i v i t i e s o f S O D , C A T a n d A P X i n c e l l s r e m a i n e d r e l a t i v e l y s t e a d y u n d e r c o n t r o l c o n d i t i o n s c o m p a r e d w i t h t h o s e u n d e r N a C l s t r e s s c o n d i t i o n s . T h i s s u g g e s t s t h a t S O D , C A T a n d A P X p a r t i c i p a t e i n t h e r e g u l a t i n g m e c h a n i s m o f c e l l s a g a i n s t s a l t s t r e s s a n d w a s c o n s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t o f S h a b a l a e t a l . , ( 1 9 9 7 ) . T h e r e s u l t i n d i c a t e d t h a t e x t e r n a l c a l c i u m c o u l d e l e v a t e t h e a c t i v i t i e s o f S O D , C A T , a n d A P X i n c e l l s u n d e r N a C l s t r e s s c o n d i t i o n s . T h i s i n c r e a s e i s r e g a r d e d a s a n a d a p t i v e s i g n a l t o t r i g g e r g e n e e x p r e s s i o n a n d a c t i v a t e s o m e u n k n o w n b i o c h e m i c a l 4 1 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 1 1 - 4 1 8 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1 F i g . 1 A & B . E f f e c t s o f p a r a q u a t o n c h l o r o p h y l l c o n t e n t s i n l e a f d i s c s f r o m y o u n g l e a v e s ( A ) a n d o l d l e a v e s ( B ) o f A . t r i c o l o r a n d P . v u l g a r i s t r e a t e d b y 0 , 5 0 , 1 0 0 , 1 5 0 , 2 0 0 0 a n d 2 5 0 m M N a C l + 5 m m C a C l 2 f o r 1 2 d a y s . V e r t i c a l b a r s i n d i c a t e s t a n d a r d e r r o r s ( n = 3 ) . 0 μ m p a r a q u a t ; 0 . 3 μ m p a r a q u a t . N a C l C o n c . ( m M ) 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 A . t r i c o l o r 0 . 2 9 ± 0 . 0 8 0 . 4 5 ± 0 . 3 1 . 3 ± 0 . 3 1 . 9 ± 0 . 2 2 . 3 ± 0 . 3 3 . 2 ± 0 . 1 1 P . v u l g a r i s 0 . 1 5 ± 0 . 4 1 ± 0 . 0 5 2 . 4 ± 0 . 1 5 4 ± 0 . 5 2 D D T a b l e 2 . E f f e c t o f N a C l + C a C l 2 ( 5 m M ) o n S u p e r o x i d e a n i o n ( O 2 . - ) ( µ m o l m i n - 1 g - 1 ) o f 1 4 d a y s o l d s e e d l i n g s . ( D = d e a d ) . N a C l C o n c . ( m M ) 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 A . t r i c o l o r 0 . 7 ± 0 . 0 1 1 ± 0 . 2 2 1 . 7 ± 0 . 6 2 . 4 ± 0 . 6 2 . 9 ± 0 . 7 3 . 9 ± 0 . 2 P . v u l g a r i s 0 . 4 ± 0 . 1 3 2 . 2 ± 0 . 1 2 5 . 9 ± 0 . 2 3 1 2 . 4 ± 0 . 2 D D T a b l e 3 . E f f e c t o f N a C l + C a C l 2 ( 5 m M ) o n h y d r o g e n p e r o x i d e ( µ m o l m i n - 1 g - 1 ) o f 1 4 d a y s o l d s e e d l i n g s . ( D = d e a d )

e v e n t s t o e n a b l e p l a n t s t o a d a p t t o e n v i r o n m e n t a l s t r e s s ( R e n g e l , 1 9 9 2 ) . I n a d d i t i o n , t h e c a l c i u m r e c e p t o r p r o t e i n c a l m o d u l i n a n d o t h e r c a l c i u m - b i n d i n g p r o t e i n s h a v e b e e n f o u n d t o b e i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f p l a n t r e s p o n s e s t o e n v i r o n m e n t a l s t r e s s ( I s h i t a n i e t a l . 2 0 0 0 ) . C a 2 + i s a l s o a p r i m a r y s e c o n d m e s s e n g e r i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n a n d r e g u l a t e s p h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l p r o c e s s e s i n t h e r e s p o n s e s o f p l a n t s t o e x t r a c e l l u l a r a d v e r s e a b i o t i c e n v i r o n m e n t s ( B o w l e r a n d F l u h r , 2 0 0 0 ) . T h e i m p o r t a n t r o l e o f c a l c i u m s i g n a l s i n t h e t r a n s d u c t i o n o f e n v i r o n m e n t a l c h a n g e i n t o p l a n t r e s p o n s e h a s b e e n d o c u m e n t e d o v e r a w i d e r a n g e o f s t i m u l i ( S h a b a l a e t a l . , 1 9 9 7 ; R o m a n o e t a l . , 1 9 9 8 ) . M u c h o f t h e e v i d e n c e h a s s h o w n t h a t e x t e r n a l c a l c i u m t r e a t m e n t c a n i n c r e a s e t o l e r a n c e c a p a c i t y t o a d v e r s e e n v i r o n m e n t s i n v o l v i n g d r o u g h t ( B o w l e r a n d F l u h r , 2 0 0 0 ) , c o l d ( S h a b a l a a n d N e w m a n , 2 0 0 0 ) , h e a t , a n d s a l t s t r e s s ( W h i t e a n d B r o a d l e y , 2 0 0 3 ) . C a 2 + s i g n a l p a t t e r n s c a n o c c u r a s s i n g l e t r a n s i e n t s o r r e p e t i t i v e o s c i l l a t i o n s ( D e m i d c h i c k e t a l . , 2 0 0 2 a ; E l p h i c k e t a l . , 2 0 0 1 ) , a n d a l s o d i f f e r e n t s i g n a l i n g p a t t e r n s , s u c h a s o s c i l l a t i o n s a n d w a v e s , m a y a r i s e f r o m t h e s e l e c t i v e a c t i v a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t o r s . S p e c i a l c a l c i u m s i g n a l i n g c o m i n g f r o m d i f f e r e n t s t i m u l i / c o n d i t i o n s s h o u l d b e a m e c h a n i s m t h a t p e r c e i v e s a n d t r a n s u d e s d i f f e r e n t s i g n a l s s t i m u l i a n d c a u s e s d i f f e r e n t p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s i n p l a n t s . I n t h i s i n v e s t i g a t i o n , e x t e r n a l c a l c i u m t r e a t m e n t i n c r e a s e d t o t a l c a l c i u m c o n t e n t i n c e l l s . F o r d e t e r m i n i n g t h e s i g n a l r o l e o f C a 2 + , i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m i o n c o n t e n t a n d s u b c e l l u l a r l o c a t i o n s o f C a 2 + w i l l b e m e a s u r e d i n o u r n e x t i n v e s t i g a t i o n . A O S s s u c h a s O 2 . - a n d H 2 O 2 c o n t e n t i n N a C l s t r e s s e d A . t r i c o l o r w a s c o m p a r a t i v e l y m o r e t h a n c o n t r o l b u t i t s i n c r e a s e w a s m o r e o b v i o u s i n P . v u l g a r i s . T h u s a n u n a m b i g u o u s c o r r e l a t i o n w a s n o t i c e d b e t w e e n s a l t c o n c e n t r a t i o n s a n d R O S s c o n t e n t ( T a b l e 3 & 4 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e m a g n i t u d e o f R O S c o n t e n t i n A . t r i c o l o r w a s d e c r e a s e d b y s u p p l e m e n t i n g t h e s a l i n i z e d m e d i a w i t h C a C l 2 c o m p a r e d t o t h e p l a n t s w i t h c o r r e s p o n d i n g N a C l c o n c e n t r a t i o n s a n d w a s s i g n i f i c a n t a t 2 0 0 m M N a C l + C a C l 2 . T h e r e s u l t s a r e c o m p a r a b l e w i t h t h a t o f P h y l l a n t h u s a m a r u s a n d C a t h a r a n t h u s r o s e u s u n d e r w a t e r a n d s a l t s t r e s s ( J a l e e l e t a l . , 2 0 0 8 ; 2 0 0 7 b ) . T h e i n c r e a s e d R O S a c c u m u l a t i o n i n A r a b i d o p s i s r o o t a n d l e a f c e l l s h a s b e e n r e l a t e d t o t h e m a i n t e n a n c e o f a m o r e f a v o u r a b l e K + / N a + r a t i o i n t h e N a C l s t r e s s e d r o o t s s u p p l i e d w i t h c a l c i u m a n d i t w a s s u g g e s t e d t h a t t h e f a i l u r e t o m a i n t a i n a f a v o u r a b l e K + / N a + r a t i o c a n i n h i b i t e n z y m e f u n c t i o n s ( S h a b a l a e t a l . , 2 0 0 6 ) . S t u d i e s o n s a l t t o l e r a n c e i n p e a n u t r e v e a l s t h a t t h e K + / N a + r a t i o i n c r e a s e d a t a l l l e v e l s o f e x t e r n a l s a l i n i t y ( G i r i j a e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h e m e c h a n i s m l e a d i n g t o t h e i n c r e a s e i n a n t i o x i d a n t e n z y m e l e v e l s i n s a l i n i z e d p l a n t s b y c a l c i u m i s n o t c l e a r s t i l l . H o w e v e r , i t i s e v i d e n t f r o m t h e p r e s e n t s t u d y t h a t t h e A O X e n z y m e s s y n t h e s i s i s a c c e l e r a t e d b y s o m e C a + + d e p e n d e n t m e c h a n i s m s , m a y b e b y t h e f o r m a t i o n o f C a + + m o d u l a t e d p r o t e i n c o m p l e x e s i n t h e c y t o s o l , w h i c h m i g h t h a v e a c t i v a t e d e n z y m e s ; l e a d i n g t o s c a v e n g i n g o f R O S s ( J a l e e l e t a l . , 2 0 0 8 ) . C a + + i s r e p o r t e d t o r e d u c e t h e t o x i c e f f e c t o f N a C l s a l i n i t y . C a + + s u p p l e m e n t a t i o n s a p p a r e n t l y a l l e v i a t e N a C l s t r e s s , a t l e a s t i n p a r t , b y m o d u l a t i n g t h e e n z y m e p r o t e i n a n d a g r e a t e r r e d u c t i o n i n l i p i d p e r o x i d a t i o n t o m a i n t a i n l o w R O S l e v e l s w h i c h c a n b e e x p e c t e d t o c o n t r i b u t e f o r a n i d e a l l e v e l o s m o r e g u l a t i o n . O s m o t i c a d j u s t m e n t i s a n i m p o r t a n t m e c h a n i s m o f a p l a n t s t o l e r a n c e t o a s t r e s s e n v i r o n m e n t ( H a l f t e r e t a l . , 2 0 0 0 ) . O s m o t i c a d j u s t m e n t a n d o s m o t i c p o t e n t i a l i n c r e a s e d s l o w l y i n c e l l s u n d e r p r o l o n g e d s t r e s s , b u t w e r e n o t a f f e c t e d s i g n i f i c a n t l y b y e x t e r n a l C a 2 + t r e a t m e n t u n d e r s a l t s t r e s s c o n d i t i o n s . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e e f f e c t o f e x t e r n a l C a 2 + o n c e l l s w a s n o t d u e t o t h e r e g u l a t i o n o f o s m o t i c p o t e n t i a l o r o s m o t i c a d j u s t m e n t . T h u s , t h e p r e s e n t s t u d y s u g g e s t s t h a t A . t r i c o l o r h a s h i g h e r l e v e l s o f a n t i o x i d a t i v e e n z y m e s b o t h c o n s t i t u t i v e a n d i n d u c e d r e s u l t i n g i n g r e a t e r r e s i s t a n c e t o o x i d a t i v e d a m a g e c a u s e d b y N a C l s t r e s s a n d i s m i t i g a t e d e f f i c i e n t l y b y c a l c i u m s a l t s . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 1 1 - 4 1 8 4 1 5 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1 N a C l C o n c . 0 m M 5 0 m M 1 0 0 m M 1 5 0 m M 2 0 0 m M 2 5 0 m M A . t r i c o l o r 1 ± 0 . 0 1 1 . 3 ± 0 . 2 2 2 ± 0 . 6 2 . 8 ± 0 . 0 4 3 . 2 ± 0 . 9 4 . 2 ± 0 . 2 5 P . v u l g a r i s 0 . 5 ± 0 . 1 2 . 7 ± 0 . 3 6 ± 0 . 6 5 9 . 5 ± 0 . 4 D D T a b l e 4 . E f f e c t o f N a C l + C a C l 2 ( 5 m M ) o n L i p i d p e r o x i d a t i o n ( n m o l g - 1 ) i n N a C l + C a C l 2 ( 5 m M ) t r e a t e d A . t r i c o l o r a n d P . v u l g a r i s 1 4 d a y s a f t e r s t a r t i n g N a C l t r e a t m e n t s ( D = d e a d ) .

A C K N O W L E D G E M E N T S T h e a u t h o r s i n c e r e l y a c k n o w l e d g e s t h e U n i v e r s i t y G r a n t C o m m i s s i o n , N e w D e l h i f o r t h e f i n a n c i a l a s s i s t a n c e c o n n e c t e d w i t h t h e m i n o r p r o j e c t . R E F E R E N C E S B o w l e r C F l u h r R . 2 0 0 0 . T h e r o l e o f c a l c i u m a n d a c t i v a t e d o x y g e n s a s s i g n a l s f o r c o n t r o l l i n g c r o s s - t o l e r a n c e . T r e n d s P l a n t S c i . , 5 : 2 4 1 - 2 4 6 . C h a p p e l l e E W , K i m M S a n d M c M u r t r e y J E . 1 9 9 2 . R a t i o a n a l y s i s o f r e f l e c t a n c e s p e c t r a ( R A R S ) : a n a l g o r i t h m f o r t h e r e m o t e e s t i m a t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f c h l o r o p h y l l a , c h l o r o p h y l l b a n d c a r o t e n o i d s i n s o y b e a n l e a v e s . R e m o t e S e n s . E n v i r o n . , 3 9 : 2 3 9 - 2 4 7 . D e m i d c h i k V , B o w e n H C , M a a t h u i s F J M , S h a b a l a S N , T e s t e r M A , D a v i e s J M . 2 0 0 2 a . A r a b i d o p s i s t h a l i a n a r o o t n o n - s e l e c t i v e c a t i o n c h a n n e l s m e d i a t e c a l c i u m u p t a k e a n d a r e i n v o l v e d i n g r o w t h . P l a n t J 3 2 : 7 9 9 - 8 0 8 . 4 1 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 1 1 - 4 1 8 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1 T h e d a t a a r e t h e m e a n s o f f o u r r e p l i c a t e s ± S . E . T a b l e 5 a Y o u n g l e a v e s A . t r i c o l o r N a C l c o n c . ( m m ) S O D A P X C A T G R 0 6 7 2 ± 0 . 2 4 . 9 ± 0 . 7 4 4 2 ± 0 . 2 2 . 4 ± 0 . 0 9 5 0 1 2 8 9 ± 0 . 6 9 ± 0 . 8 6 9 8 ± 0 . 8 3 . 9 ± 0 . 6 1 0 0 1 4 0 6 ± 0 . 4 1 6 ± 0 . 5 7 4 4 ± 0 . 6 4 . 5 ± 0 . 9 1 5 0 1 4 9 8 ± 0 . 2 1 8 ± 0 . 4 9 2 4 ± 0 . 9 4 . 6 ± 0 . 8 2 0 0 1 5 2 2 ± 0 . 3 1 9 . 7 ± 1 9 4 7 ± 0 . 3 4 . 7 ± 0 . 2 N a C l c o n c . ( m m ) Y o u n g l e a v e s P . v u l g a r i s 0 2 0 7 ± 0 . 1 3 ± 0 . 0 3 1 5 8 ± 0 . 2 7 1 . 4 ± 0 . 0 9 5 0 3 8 8 ± 0 . 0 7 8 . 6 ± 0 . 0 7 2 3 1 ± 0 . 1 1 1 . 9 ± 0 . 1 5 1 0 0 2 2 3 ± 0 . 0 4 1 1 . 5 ± 0 . 0 6 2 0 1 ± 0 . 1 2 1 . 6 ± 0 . 4 3 1 5 0 1 5 6 ± 0 . 0 1 6 ± 0 . 0 9 1 9 6 ± 0 . 1 2 1 ± 0 . 2 4 2 0 0 D D D D T a b l e 5 b . O l d l e a v e s A . t r i c o l o r N a C l c o n c . ( m m ) S O D A P X C A T G R 0 3 3 2 ± 0 . 9 4 . 3 ± 0 . 1 7 3 6 9 ± 0 . 2 2 3 ± 0 . 9 5 0 5 1 2 ± 0 . 0 6 5 . 9 ± 0 2 . 8 4 8 1 ± 0 . 2 8 4 ± 0 . 0 5 1 0 0 6 9 9 ± 0 . 3 4 8 ± 0 . 3 5 5 1 4 ± 0 2 . 6 4 . 8 ± 0 . 0 6 1 5 0 8 0 3 ± 0 . 2 2 9 . 8 ± 0 . 4 4 5 6 7 ± 0 . 2 9 3 . 9 ± 0 . 0 7 2 0 0 8 2 0 ± 0 . 2 3 1 0 . 4 ± 0 . 8 1 5 7 7 ± 0 . 3 3 4 ± 0 . 0 2 N a C l c o n c . ( m m ) O l d l e a v e s P . v u l g a r i s 0 1 9 7 ± 4 2 2 . 4 ± 0 . 1 7 1 1 9 ± 0 . 1 2 1 . 8 ± 0 . 9 5 0 2 4 9 ± 0 . 2 6 5 ± 0 . 8 1 1 4 1 ± 0 . 2 8 2 . 3 ± 0 . 2 6 1 0 0 1 9 8 ± 0 . 6 4 5 . 4 . 9 ± 0 . 2 5 1 1 4 ± 0 . 1 6 1 . 8 ± 0 . 1 9 1 5 0 1 8 4 ± 0 . 8 2 4 . 7 ± 0 . 2 4 9 6 . 4 ± 0 . 3 9 1 . 4 ± 0 . 3 8 2 0 0 D D D D T a b l e 5 a & b . A n t i o x i d a n t e n z y m e s s u c h a s s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( S O D , U / g ) , A s c o r b a t e p e r o x i d a s e ( A P X , μ m o l A s A d e c o m p o s e d / g F W / m i n ) , G u a i a c o l p e r o x i d a s e ( P O X ) , C a t a l a s e ( C A T , μ m o l H 2 O 2 d e c o m p o s e d / g F W / m i n ) a n d G l u t a t h i o n e r e d u c t a s e ( G R , μ m o l N A D P H o x i d i z e d / g F W / m i n ) i n N a C l + C a C l 2 ( 5 m M ) t r e a t e d A . t r i c o l o r a n d P . v u l g a r i s 1 4 d a y s a f t e r s t a r t i n g t r e a t m e n t s .

E l p h i c k C H , S a n d e r s D , M a a t h u i s F J M . 2 0 0 1 . C r i t i c a l r o l e o f d i v a l e n t c a t i o n s a n d N a + e f f l u x i n A r a b i d o p s i s t h a l i a n a s a l t t o l e r a n c e . P l a n t C e l l E n v i r o n . , 2 4 : 7 3 3 - 7 4 0 . G a l l a t i H a n d P r a c h t I . 1 9 8 5 . H o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e : k i n e t i c s t u d i e s a n d o p t i m i z a t i o n o f p e r o x i d a s e a c t i v i t y d e t e r m i n a t i o n u s i n g t h e s u b s t r a t e s H 2 O 2 a n d 3 , 3 ' , 5 , 5 ' - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e . J . C l i n . C h e m . C l i n . B i o c h e m . , 2 3 : 4 5 3 - 4 6 0 . G i r i j a C , S m i t h B N , a n d S w a m y P M . 2 0 0 2 . I n t e r a c t i v e e f f e c t s o f s o d i u m c h l o r i d e a n d c a l c i u m c h l o r i d e o n t h e a c c u m u l a t i o n o f p r o l i n e a n d g l y c i n e b e t a i n e i n p e a n u t ( A r a c h i s h y p o g a e a L . ) . E n v i r o n . E x p . B o t . , 4 7 : 1 - 1 0 . H a l f t e r U , I s h i t a n i M , Z h u J K . 2 0 0 0 . T h e A r a b i d o p s i s S O S 2 p r o t e i n k i n a s e p h y s i c a l l y i n t e r a c t s w i t h a n d i s a c t i v a t e d b y t h e c a l c i u m - b i n d i n g p r o t e i n S O S 3 . P r o c N a t l A c a d S c i U S A . 9 7 : 3 7 3 5 - 3 7 4 0 . H e a t h R L , P a c k e r L . 1 9 6 8 . P h o t o p e r o x i d a t i o n i n i s o l a t e d c h l o r o p l a s t s . I . K i n e t i c s a n d s t o i c h i o m e t r y o f f a t t y a c i d p e r o x i d a t i o n . A r c h B i o c h e m B i o p h y s 1 2 5 : 1 8 9 - 9 8 . I s h i t a n i M , L i u J P , H a l f t e r U , K i m C S , S h i W M , Z h u J K . 2 0 0 0 . S O S 3 f u n c t i o n i n p l a n t s a l t t o l e r a n c e r e q u i r e s N - m y r i s t o y l a t i o n a n d c a l c i u m b i n d i n g . P l a n t C e l l 1 2 : 1 6 6 7 - 1 6 7 7 . J a l e e l C A , A s h o k k i s h o r e k u m a r , P a r a m a s i v a m M a n i v a n n a n , B e e m a r a o S a n k a r , M u t h i a h G o m a t h i n a y a g a m , R a j a r a m P a n n e e r s e l v a m . 2 0 0 8 . S a l t s t r e s s m i t i g a t i o n b y c a l c i u m c h l o r i d e i n P h y l l a n t h u s a m a r u s A c t a B o t . C r o a t . , 6 7 ( 1 ) : 5 3 - 6 2 . J a l e e l C A , G o p i R , M a n i v a n n a n P , P a n n e e r s e l v a m R . 2 0 0 7 b . A n t i o x i d a t i v e p o t e n t i a l s a s a p r o t e c t i v e m e c h a n i s m i n C a t h a r a n t h u s r o s e u s ( L . ) G . D o n . p l a n t s u n d e r s a l i n i t y s t r e s s . T u r . J . B o t 3 1 : 2 4 5 - 2 5 1 . J i a n g M , Z h a n g J . 2 0 0 2 . A . I n v o l v e m e n t o f p l a s m a m e m b r a n e N A D P H o x i d a s e i n a b s c i s i c a c i d - a n d w a t e r s t r e s s - i n d u c e d a n t i o x i d a n t d e f e n s e i n l e a v e s o f m a i z e s e e d l i n g s . P l a n t a 2 1 5 : 1 0 2 2 - 1 0 3 0 . M i c h a e l a S c h m i t z - E i b e r g e r , R o l a n d H a e f s , G e o r g N o g a . 2 0 0 2 . C a l c i u m d e f i c i e n c y I n f l u e n c e o n t h e a n t i o x i d a t i v e d e f e n s e s y s t e m i n t o m a t o p l a n t s J . P l a n t P h y s i o l . , 1 5 9 : 7 3 3 - 7 4 2 . P e i Z M , M u r a t a Y , B e n n i n g G . , T h o m i n e S , K l u s e n e r B , A l l e n G J , G r i l l E , S c h r o e d e r J I . 2 0 0 0 . C a l c i u m c h a n n e l s a c t i v a t e d b y h y d r o g e n p e r o x i d e m e d i a t e a b s c i s i c a c i d s i g n a l l i n g i n g u a r d c e l l s . N a t u r e 4 0 6 : 7 3 1 - 7 3 4 . P r i c e A H , T a y l o r A , R i p l e y S J , G r i f f i t h s A , T r e w a v a s A J a n d K n i g h t M R . 1 9 9 4 . O x i d a t i v e s i g n a l s i n t o b a c c o i n c r e a s e c y t o s o l i c c a l c i u m . P l a n t C e l l 6 : 1 3 0 1 - 1 3 1 0 . R e n g e l Z . 1 9 9 2 . T h e r o l e o f c a l c i u m i n s a l t t o x i c i t y . P l a n t C e l l E n v i r o n . , 1 5 : 6 2 5 - 6 3 2 . R o m a n o L A , M i e d e m a H , A s s m a n n S M . 1 9 9 8 . C a 2 + - p e r m e a b l e , o u t w a r d l y - r e c t i f y i n g K + c h a n n e l s i n m e s o p h y l l c e l l s o f A r a b i d o p s i s t h a l i a n a . P l a n t C e l l P h y s i o l . , 3 9 : 1 1 3 3 - 1 1 4 4 . S h a b a l a S , D e m i d c h i k V , S h a b a l a L , C u i n T A , S m i t h S J , M i l l e r A J , D a v i e s J M , N e w m a n I A . 2 0 0 6 . E x t r a c e l l u l a r C a 2 + A m e l i o r a t e s N a C l - I n d u c e d K 1 L o s s f r o m A r a b i d o p s i s R o o t a n d L e a f C e l l s b y C o n t r o l l i n g P l a s m a M e m b r a n e K + P e r m e a b l e C h a n n e l s P l a n t P h y s i o l o g y , A u g u s t 1 4 1 : 1 6 5 3 - 1 6 6 5 . S h a b a l a S , N e w m a n I . 2 0 0 0 . S a l i n i t y e f f e c t s o n t h e a c t i v i t y o f p l a s m a m e m b r a n e H + a n d C a 2 + t r a n s p o r t e r s i n b e a n l e a f m e s o p h y l l : m a s k i n g r o l e o f t h e c e l l w a l l . A n n B o t ( L o n d ) 8 5 : 6 8 1 - 6 8 6 . S h a b a l a S N , N e w m a n I A , M o r r i s J . 1 9 9 7 . O s c i l l a t i o n s i n H + a n d C a 2 + i o n f l u x e s a r o u n d t h e e l o n g a t i o n r e g i o n o f c o r n r o o t s a n d e f f e c t s o f e x t e r n a l p H . P l a n t P h y s i o l . , 1 1 3 : 1 1 1 - 1 1 8 . S k o ´ r z y n s k a - P o l i t E , T u k e n d o r f A , S e l s t a m E , B a s z y n s k i T . 1 9 9 8 . C a l c i u m m o d i f i e s C d e f f e c t o n r u n n e r b e a n p l a n t s E n v i r o n m e n t a l a n d E x p e r i m e n t a l B o t a n y 4 0 : 2 7 5 - 2 8 6 . S u n t r e s Z E . 2 0 0 2 . R o l e o f a n t i o x i d a n t s i n p a r a q u a t t o x i c i t y . T o x i c o l o g y 1 8 0 : 6 5 - 7 7 . V a i d y a n a t h a n H , S i v a k u m a r P , C h a k r a b a r t y R a n d T h o m a s G . 2 0 0 3 . S c a v e n g i n g o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s i n N a C l - s t r e s s e d r i c e ( O r y z a s a t i v a L . ) - d i f f e r e n t i a l r e s p o n s e i n s a l t - t o l e r a n t a n d J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 1 1 - 4 1 8 4 1 7 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1

s e n s i t i v e v a r i e t i e s . P l a n t S c i . 1 6 5 : 1 4 1 1 - 1 4 1 8 . W h i t e P J , B r o a d l e y M R . 2 0 0 3 . C a l c i u m i n p l a n t s . A n n B o t ( L o n d ) 9 2 : 4 8 7 - 5 1 1 . Y a n a g i d a M , M a t s u m o t o H a n d U s u i K . 1 9 9 9 . R e s p o n s e s o f a n t i o x i d a t i v e s y s t e m s t o o x y f l u o r f e n a n d t h e i r r o l e i n h e r b i c i d a l t o l e r a n c e o f p l a n t s . J . W e e d S c i . T e c h . , 4 4 : 6 7 - 7 6 . 4 1 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 1 1 - 4 1 8 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1