J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y L a b o r a t o r y t o x i c i t y e v a l u a t i o n o f D i f l u b e n z u r o n , a c h i t i n - s y n t h e s i s i n h i b i t o r , a g a i n s t A n o p h e l e s d a r l i n g i ( D i p t e r a , C u l i c i d a e ) . K e y w o r d s : I G R , l a r v i c i d e , m o s q u i t o , p e s t i c i d e , v e c t o r c o n t r o l . A B S T R A C T : W e e v a l u a t e d D i f l u b e n z u r o n t o x i c i t y a g a i n s t l a r v a e a n d p u p a e o f A n o p h e l e s d a r l i n g i . A s e r i e s o f b i o a s s a y s w e r e d e v e l o p e d t o a s s e s s t h e l e t h a l c o n c e n t r a t i o n s L C 5 0 a n d L C 9 0 t o l a r v a e a f t e r t w o e x p o s u r e p e r i o d s ( 2 4 a n d 4 8 h o u r s ) , a n d t o e v a l u a t e i t s t o x i c i t y t o 2 0 - m i n u t e - a n d 2 4 - h o u r - o l d p u p a e . T h e L C 5 0 a n d L C 9 0 o b t a i n e d w e r e 0 . 0 0 6 a n d 0 . 0 1 3 p p m , r e s p e c t i v e l y . F o r c o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 0 1 t o 0 . 1 p p m , a m o r t a l i t y o f 1 0 0 % w a s o b s e r v e d , m a i n l y d u r i n g t h e l a r v a l s t a g e . W i t h c o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n 0 . 0 0 9 a n d 0 . 0 0 1 p p m , m o r t a l i t y v a r i e d f r o m 1 . 7 % t o 2 5 . 8 % i n t h e l a r v a l s t a g e ; f r o m 2 1 . 7 % t o 4 4 . 2 % i n t h e p u p a l s t a g e ; a n d f r o m 1 5 . 0 % t o 4 . 2 % i n a d u l t s . N o d i f f e r e n t i a t i o n i n e m e r g e n c e i n h i b i t i o n w a s o b s e r v e d b e t w e e n t h e e x p o s u r e p e r i o d s o f 2 4 ( 8 2 . 0 % ) a n d 4 8 h o u r s ( 8 6 . 7 % ) . T h e s e r e s u l t s r e v e a l e d t h a t t h e m i n i m u m e x p o s u r e p e r i o d o f 2 4 h o u r s s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t s e m e r g e n c e . T h e 2 0 - m i n u t e - o l d p u p a e w e r e m o r e s u s c e p t i b l e t h a n t h e 2 4 - h o u r - o l d o n e s ( 6 1 . 1 % e m e r g e n c e i n h i b i t i o n , a g a i n s t 9 3 . 0 % o f t h e f o r m e r ) . D i f l u b e n z u r o n t o x i c i t y t o p u p a e i n d i c a t e s t h a t t h i s i n s e c t i c i d e m a y a l s o a c t b y c o n t a c t . T h e s e r e s u l t s s h o w e d t h a t A . d a r l i n g i l a r v a e a n d p u p a e a r e s u s c e p t i b l e t o t h e i n h i b i t o r y a c t i o n o f D i f l u b e n z u r o n . 4 4 4 - 4 5 0 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 6 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : C o s t a F M , T a d e i W P . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : C o s t a F M W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 1 0 4 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 1 5 S e p 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 0 9 O c t 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 1 4 O c t 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : C o s t a F M , T a d e i W P . L a b o r a t o r y t o x i c i t y e v a l u a t i o n o f D i f l u b e n z u r o n , a c h i t i n - s y n t h e s i s i n h i b i t o r , a g a i n s t A n o p h e l e s d a r l i n g i ( D i p t e r a , C u l i c i d a e ) . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 4 4 - 4 5 0 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h P a p e r

I N T R O D U C T I O N I n s e c t g r o w t h r e g u l a t o r s ( I G R ) a r e a g r o u p o f i n s e c t i c i d e s w i t h a h e t e r o g e n e o u s c h e m i c a l n a t u r e t h a t i n t e r f e r e w i t h p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s e s s e n t i a l f o r i n s e c t d e v e l o p m e n t . T h e y g e n e r a l l y c a u s e p h y s i o l o g i c a l a n d m o r p h o l o g i c a l a l t e r a t i o n s t o i n s e c t s , m a i n l y d u r i n g t h e i m m a t u r e s t a g e s , h i n d e r i n g d e v e l o p m e n t t o t h e a d u l t . T h e s e c o m p o u n d s i n c l u d e j u v e n i l e h o r m o n e m i m i c s , a n t i j u v e n i l e h o r m o n e a n a l o g s , a n d c h i t i n - s y n t h e s i s i n h i b i t o r s ( E i s l e r , 1 9 9 2 ) . D i f l u b e n z u r o n w a s t h e f i r s t I G R s y n t h e s i z e d , a n d c u r r e n t l y i s t h e i n s e c t i c i d e t h a t i s m o s t s t u d i e d a n d u s e d a g a i n s t i n s e c t p e s t s . D i f l u b e n z u r o n i s a b e n z o y l p h e n y l u r e a - d e r i v e d i n s e c t i c i d e t h a t a c t s b y i n t e r f e r i n g w i t h c h i t i n s y n t h e s i s a n d d e p o s i t i o n i n t h e i n s e c t c u t i c l e ( C o h e n , 1 9 8 7 ) . I m m a t u r e s t a g e s a r e m o r e s u s c e p t i b l e t o t h i s i n s e c t i c i d e b e c a u s e o f t h e i r s u c c e s s i v e m o l t s . A l a r g e p r o p o r t i o n o f l a r v a e e x p o s e d t o D i f l u b e n z u r o n d i e d u r i n g m o l t i n g , b e c a u s e t h e y c a n n o t c a s t t h e i r e x u v i a . S o m e p u p a e m a y s u r v i v e b u t e v e n t u a l l y d i e i n s u b s e q u e n t s t a g e s ( M u l l a , 1 9 9 5 ) . T h e W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n h a s r e c o m m e n d e d t h e u s e o f D i f l u b e n z u r o n f o r t h e c o n t r o l o f m o s q u i t o v e c t o r s s i n c e 1 9 8 2 . D i f l u b e n z u r o n i n v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s , f r o m 0 . 0 0 1 t o 0 . 0 0 2 p p m , i s h i g h l y t o x i c t o m o s q u i t o l a r v a e ( M u l l a , 1 9 9 5 ) . T h e u s e o f D i f l u b e n z u r o n i s r e c o m m e n d e d f o r s p e c i a l s i t u a t i o n s , m o s t l y i n d i s t u r b e d e n v i r o n m e n t s , b e c a u s e t h i s c o m p o u n d a l s o a d v e r s e l y a f f e c t s o t h e r o r g a n i s m s t h a t a r e p h y l o g e n e t i c a l l y c l o s e t o m o s q u i t o e s , o r e v e n t h o s e c o e x i s t i n g i n t h e s a m e h a b i t a t . D i f l u b e n z u r o n t o x i c i t y t o v e r t e b r a t e s a n d h u m a n s i s c o n s i d e r e d l o w ( M u l l a , 1 9 9 5 ; F l o o r e , 2 0 0 6 ) . M a n y m o s q u i t o s p e c i e s h a v e b e e n t a r g e t e d b y r e s e a r c h o n t h e p o t e n t i a l i n s e c t i c i d e e f f e c t o f D i f l u b e n z u r o n ; m e m b e r s o f A n o p h e l e s , C u l e x a n d A e d e s a r e t h e m o s t f r e q u e n t l y s t u d i e d . L a b o r a t o r y - e s t i m a t e d D i f l u b e n z u r o n C L 9 0 l e t h a l c o n c e n t r a t i o n s f o r A n o p h e l e s a l b i m a n u s W i e d m a n , 1 8 2 0 , C u l e x q u i n q u e f a s c i a t u s S a y , 1 8 2 3 , a n d A e d e s a e g y p t i L i n n a e u s , 1 7 6 2 a r e 0 . 0 0 1 , 0 . 0 0 2 a n d 0 . 0 0 3 5 p p m , r e s p e c t i v e l y ( M u l l a e t a l . , 1 9 7 4 ; M u l l a , 1 9 9 5 ; F o u r n e t e t a l . , 1 9 9 3 ) . W e s t u d i e d A n o p h e l e s d a r l i n g i R o o t , 1 9 2 6 , a w i l d m o s q u i t o w i t h a n t h r o p o p h i l i c h a b i t s , w h i c h i s t h e m a i n v e c t o r o f t h e t h r e e P l a s m o d i u m s p e c i e s t h a t c a u s e s h u m a n m a l a r i a i n B r a z i l ( T a d e i e t a l . , 1 9 9 8 ) . A n o p h e l e s d a r l i n g i i s t h e m a i n v e c t o r o f m a l a r i a i n t h e A m a z o n , e s p e c i a l l y i n a r e a s u n d e r g o i n g s e v e r e e n v i r o n m e n t a l d i s t u r b a n c e f r o m t h e e x p l o i t a t i o n o f n a t u r a l r e s o u r c e s ( s u c h a s w o o d , o r e s , a n d o i l e x t r a c t i o n ) , r u r a l s e t t l e m e n t p r o j e c t s , a n d f i s h f a r m i n g ( T a d e i e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h e a i m o f t h i s s t u d y w a s t o e v a l u a t e t h e i n s e c t i c i d a l a c t i v i t y o f D i f l u b e n z u r o n a g a i n s t l a r v a e a n d p u p a e o f A . d a r l i n g i , u n d e r l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S M o s q u i t o f i e l d c o l l e c t i o n a n d l a b o r a t o r y b r e e d i n g . F e m a l e s o f A . d a r l i n g i w e r e c o l l e c t e d i n t w o l o c a l i t i e s n e a r M a n a u s , A m a z o n a s , B r a z i l : P u r a q u e q u a r a ( 3 ° 3 8 . 6 3 S ; 5 9 ° 5 3 3 7 . 5 2 W ) a n d B r a s i l e i r i n h o ( 3 º 2 1 0 . 4 7 S ; 5 9 º 5 2 1 7 . 2 2 W ) . T h e f e m a l e s w e r e p l a c e d i n t o 3 5 0 - m L p a r a f f i n e d c u p s , s e a l e d w i t h a t u l l e m e s h . T h e y w e r e t h e n t a k e n t o t h e l a b o r a t o r y a n d f e d w i t h d o m e s t i c d u c k ( C a i r i n a m o s c h a t a L i n n a e u s , 1 7 5 8 ) b l o o d m e a l a n d 1 0 % g l u c o s e s o l u t i o n . A f t e r f e e d i n g , m o s q u i t o e s w e r e i n d i v i d u a l l y t r a n s f e r r e d t o 5 0 - m l d i s p o s a b l e c u p s . M o i s t e n e d c o t t o n a n d f i l t e r p a p e r w e r e p l a c e d o n t h e b o t t o m s o f t h e c u p s t o f u n c t i o n a s s u b s t r a t e s f o r e g g l a y i n g . A f t e r e c l o s i o n , l a r v a e w e r e r a i s e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o l o g y d e s c r i b e d b y S c a r p a s s a & T a d e i ( 1 9 9 0 ) , u n t i l t h e y r e a c h e d t h e a p p r o p r i a t e a g e s f o r t h e b i o a s s a y s . E x p e r i m e n t a l d e s i g n . O b t a i n i n g D i f l u b e n z u r o n L C 5 0 a n d L C 9 0 l e t h a l c o n c e n t r a t i o n s D i f l u b e n z u r o n ( 1 - ( 4 - c h l o r o p h e n y l ) - 3 - ( 2 , 6 - d i f l u o r o b e n z o y l ) u r e a ) s e r i a l d i l u t i o n s w e r e m a d e i n D M S O ( d i m e t h y l s u l f o x i d e ) , t o o b t a i n t h e c o n c e n t r a t i o n s r e q u i r e d f o r t h e b i o a s s a y s . T h e m e t h o d o l o g y f o l l o w e d t h a t d e s c r i b e d b y M u l l a e t a l . ( 1 9 7 4 ) , w i t h s o m e a d j u s t m e n t s . G r o u p s o f 4 0 e a r l y 4 t h - i n s t a r l a r v a e w e r e p l a c e d i n 1 0 0 - m l p l a s t i c j a r s . E a c h j a r c o n t a i n e d 2 0 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e r , f i s h m e a l , a n d t h e c o r r e s p o n d i n g d o s e o f D i f l u b e n z u r o n f o r e a c h b i o a s s a y . E a c h j a r h a d i t s s i d e w a l l s p o l i s h e d a n d i t s e n t r a n c e c o v e r e d w i t h t u l l e , i n o r d e r t o p r e v e n t t h e e m e r g e d m o s q u i t o e s f r o m p e r c h i n g a n d f l y i n g . F o r e a c h c o n c e n t r a t i o n e v a l u a t e d , t h r e e r e p l i c a t e s o f 4 0 i n d i v i d u a l s w e r e m a d e , t o t a l i n g 1 2 0 e x p o s e d i n d i v i d u a l s p e r b i o a s s a y . T h e s a m e c o n d i t i o n s w e r e a d o p t e d f o r t h e c o n t r o l g r o u p , w h i c h r e c e i v e d o n l y 0 . 5 p p m D M S O . D e a d a n d e m e r g e d i n d i v i d u a l s w e r e r e m o v e d a n d c o u n t e d d a i l y , a n d t h e s t a g e o f e a c h w a s r e c o r d e d . T h e m o s q u i t o e s c o n s i d e r e d a l i v e w e r e o n l y t h o s e t h a t c o m p l e t e l y e m e r g e d . T h i s 4 4 5 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 4 4 - 4 5 0 C o s t a e t a l . , 2 0 1 1

p r o c e s s w a s r e p e a t e d u n t i l t h e t o t a l n u m b e r o f e x p o s e d i n d i v i d u a l s w a s r e a c h e d . L a r v a e e x p o s u r e p e r i o d s t o D i f l u b e n z u r o n L C 5 0 T w o e x p o s u r e p e r i o d s o f e a r l y 4 t h - i n s t a r l a r v a e t o D i f l u b e n z u r o n L C 5 0 w e r e e v a l u a t e d : i n 2 4 a n d 4 8 h o u r s . F o r e a c h e x p o s u r e p e r i o d , t h e e x p e r i m e n t w a s c a r r i e d o u t i n p l a s t i c c u p s c o n t a i n i n g 5 0 m L d i s t i l l e d w a t e r , m e a l , 1 0 A . d a r l i n g i l a r v a e , a n d t h e c o r r e s p o n d i n g i n s e c t i c i d e d o s e ( L C 5 0 ) . E a c h e x p e r i m e n t h a d f i v e r e p l i c a t e s , a n d a l l r e p l i c a t e s h a d a c o n t r o l g r o u p t h a t r e c e i v e d o n l y 0 . 5 p p m D M S O . T h e e x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e d t h r e e d i f f e r e n t t i m e s . L a r v a e w e r e k e p t i n t h e c u p s o n l y f o r t h e r e s p e c t i v e e x p o s u r e p e r i o d . A f t e r w a r d , t h e y w e r e i n d i v i d u a l l y t r a n s f e r r e d t o d e p r e s s i o n s l i d e s , w a s h e d t h r e e t i m e s i n d i s t i l l e d w a t e r , a n d f i n a l l y p l a c e d i n 5 0 - m l c u p s w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d m e a l . E a c h c u p w a s c o v e r e d w i t h t u l l e . D e a d i n d i v i d u a l s a n d e m e r g e d a d u l t s w e r e r e m o v e d a n d c o u n t e d d a i l y , u n t i l t h e t o t a l n u m b e r o f e x p o s e d i n d i v i d u a l s w a s r e a c h e d . P u p a e s u s c e p t i b i l i t y t o D i f l u b e n z u r o n P u p a e s u s c e p t i b i l i t y t e s t s w e r e c a r r i e d o u t o n l y w i t h 0 . 1 p p m D i f l u b e n z u r o n . T h i s c o n c e n t r a t i o n w a s s e l e c t e d b a s e d o n t h e r e s u l t s o f p r e l i m i n a r y b i o a s s a y s w i t h l o w e r c o n c e n t r a t i o n s . P u p a e w e r e d i v i d e d i n t o t w o g r o u p s : 1 ) p u p a e a g e d u p t o 2 0 m i n u t e s a f t e r m o l t i n g ; a n d 2 ) p u p a e a g e d u p t o 2 4 h o u r s a f t e r m o l t i n g . T h e e x p e r i m e n t w a s c a r r i e d o u t i n c u p s c o n t a i n i n g 1 0 p u p a e o f t h e s a m e a g e , 5 0 m l d i s t i l l e d w a t e r , a n d t h e c o r r e s p o n d i n g d o s e o f i n s e c t i c i d e n e c e s s a r y t o r e a c h t h e d e s i r e d c o n c e n t r a t i o n . T h e e x p e r i m e n t h a d t h r e e r e p l i c a t e s , a n d t h e c o n t r o l g r o u p r e c e i v e d o n l y D M S O . E a c h c u p w a s c o v e r e d w i t h t u l l e t o p r e v e n t t h e a d u l t s f r o m d i s p e r s i n g a f t e r t h e i r e m e r g e n c e . T h e e x p e r i m e n t w a s r e p e a t e d t h r e e d i f f e r e n t t i m e s . T h e c o n t e n t s o f t h e c u p s w e r e i n s p e c t e d d a i l y , d e a d p u p a e , d e a d a n d l i v i n g a d u l t s w e r e r e m o v e d . T h e m o s q u i t o e s c o u n t e d a s a l i v e w e r e o n l y t h o s e t h a t w e r e c o m p l e t e l y c a s t f r o m t h e i r e x u v i a . T h e e x p e r i m e n t c o n t i n u e d u n t i l t h e l a s t p u p a o r a d u l t d i e d , o r u n t i l t h e l a s t a d u l t c o m p l e t e l y e m e r g e d . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s T o o b t a i n L C 5 0 a n d L C 9 0 l e t h a l c o n c e n t r a t i o n s , t h e m o r t a l i t y d a t a w e r e c o r r e c t e d b y m e a n s o f A b b o t t s f o r m u l a ( A b b o t t , 1 9 2 5 ) . T h e d a t a w e r e t h e n s u b m i t t e d t o a p r o b i t a n a l y s i s , u s i n g t h e p r o g r a m P o l o P C ( L e O r a S o f t w a r e , 1 9 8 7 ) . T h e m e a n p e r c e n t a g e s o f l a r v a l , p u p a l a n d a d u l t m o r t a l i t y w i t h t h e d i f f e r e n t D i f l u b e n z u r o n c o n c e n t r a t i o n s e v a l u a t e d w e r e s u b m i t t e d t o a K r u s k a l - W a l l i s t e s t o r H - t e s t ( K W - H ) , u s i n g a p r o b a b i l i t y l e v e l o f 0 . 0 5 a s t h e c r i t i c a l l e v e l o f s i g n i f i c a n c e i n a l l t e s t s . M e a n p u p a l m o r t a l i t y i n t h e s u s c e p t i b i l i t y a n d l a r v a e - e x p o s u r e - p e r i o d t e s t s w e r e c o n v e r t e d t o a r c s i n e χ , a n d t h e n s u b m i t t e d t o o n e - w a y A N O V A a n d a p o s t - h o c T u k e y - H S D t e s t t o d e t e r m i n e t h e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n g r o u p m e a n s . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N T h e d a t a f o r D i f l u b e n z u r o n l e t h a l c o n c e n t r a t i o n s t o A . d a r l i n g i a r e s h o w n i n T a b l e I . T h e L C 5 0 a n d L C 9 0 l e t h a l c o n c e n t r a t i o n s o b t a i n e d i n t h e b i o a s s a y s w e r e 0 . 0 0 6 a n d 0 . 0 1 3 p p m , r e s p e c t i v e l y . A t o t a l o f 1 1 t e s t e d c o n c e n t r a t i o n s c a u s e d m o r t a l i t y i n t h e l a r v a l , p u p a l a n d a d u l t s t a g e s ( F i g u r e 1 ) . T h e m o r t a l i t y o f l a r v a e , p u p a e a n d a d u l t s d i f f e r e d s i g n i f i c a n t l y f r o m t h e c o n t r o l g r o u p a t a l l c o n c e n t r a t i o n s e v a l u a t e d ( F 3 . 1 1 = 4 . 9 9 ; P = 0 . 0 0 1 ) . A t c o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n 0 . 0 1 t o 0 . 1 p p m ( t h e h i g h e s t u s e d ) , m o s q u i t o m o r t a l i t y r e a c h e d 1 0 0 % . T h e h i g h e s t p e r c e n t a g e s o c c u r r e d d u r i n g t h e l a r v a l s t a g e s w e r e 6 4 . 2 t o 9 7 . 5 % ( F i g . 1 A ) . M o r t a l i t y d u r i n g t h e p u p a l s t a g e r a n g e d f r o m 3 5 . 0 t o 2 . 5 % ( F i g . 1 B ) . T h e h i g h e s t p u p a l m o r t a l i t y w a s r e c o r d e d w i t h t h e c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 0 1 p p m ( 3 5 . 0 % ) , t h e o n l y c o n c e n t r a t i o n t h a t c a u s e d m o r t a l i t y d u r i n g t h e a d u l t p h a s e 0 . 8 % ( F i g . 1 C ) . A t c o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n 0 . 0 0 9 a n d 0 . 0 1 p p m , m o r t a l i t y w a s o b s e r v e d i n a l l t h r e e s t a g e s . M o r t a l i t y r a n g e d f r o m 1 . 7 t o 2 5 . 8 % d u r i n g t h e l a r v a l s t a g e ( F i g . 1 A ) , f r o m 2 1 . 7 % t o 4 4 . 2 % d u r i n g t h e p u p a l s t a g e ( F i g . 1 B ) , a n d f r o m 1 5 . 0 % t o 4 . 2 % d u r i n g t h e a d u l t s t a g e ( f i g . 1 C ) . T h e h i g h e s t m o r t a l i t y f o r p u p a e a n d a d u l t s w a s r e c o r d e d w i t h t h e c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 0 0 9 p p m ( 4 4 . 2 % a n d 1 5 . 0 % , r e s p e c t i v e l y ) . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 4 4 - 4 5 0 4 4 6 C o s t a e t a l . , 2 0 1 1 L e t h a l c o n c e n t r a t i o n s p p m ( C I 9 5 % ) L C 5 0 0 . 0 0 6 ( 0 . 0 0 5 0 . 0 0 7 ) L C 9 0 0 . 0 1 3 ( 0 . 0 1 0 0 . 0 1 9 ) R e g r e s s i o n e q u a t i o n y = 8 . 4 6 + 5 + 3 . 7 9 * l o g x T a b l e I . D i f l u b e n z u r o n l e t h a l c o n c e n t r a t i o n s L C 5 0 a n d L C 9 0 f o r 4 t h i n s t a r l a r v a e o f A n o p h e l e s d a r l i n g i , u n d e r l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s . C o n f i d e n c e I n t e r v a l ( C I ) = 9 5 % .

T h e d a t a f r o m t h e e x p o s u r e t e s t s o f e a r l y 4 t h - i n s t a r l a r v a e t o D i f l u b e n z u r o n f o r 2 4 a n d 4 8 h o u r s a r e s h o w n i n T a b l e I I . L a r v a l m o r t a l i t y d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y b e t w e e n t h e t w o e x p o s u r e p e r i o d s . T h e c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 0 0 6 p p m D i f l u b e n z u r o n w a s v e r y e f f e c t i v e w i t h i n t h e e x p o s u r e p e r i o d o f 2 4 h o u r s . E m e r g e n c e i n h i b i t i o n m e a n p e r c e n t a g e w a s 8 2 % f o r 2 4 - h o u r s e x p o s u r e , a n d 8 6 . 7 % f o r 4 8 - h o u r s e x p o s u r e . I n b o t h t r e a t m e n t s , t h e b u l k o f m o r t a l i t y o c c u r r e d d u r i n g t h e l a r v a - t o - p u p a m o l t , a l t h o u g h m o r t a l i t y d u r i n g t h e p u p a - t o - a d u l t m o l t w a s a l s o o b s e r v e d . T h e u s e o f i n s e c t i c i d e s w i t h l o w t o x i c i t y , h i g h r e s i d u a l e f f e c t a n d h i g h s p e c i f i c i t y h a s b e e n m u c h e m p h a s i z e d r e c e n t l y . A p r o d u c t w i t h t h e s e 4 4 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 4 4 - 4 5 0 C o s t a e t a l . , 2 0 1 1 E x p o s u r e p e r i o d ( h o u r s ) n E m e r g e n c e i n h i b i t i o n ( % ) * 2 4 1 5 0 8 2 . 0 ± 2 . 0 a C o n t r o l 2 4 3 0 6 . 7 ± 5 . 8 b 4 8 1 5 0 8 6 . 7 ± 6 . 1 a C o n t r o l 4 8 3 0 2 0 . 0 ± 0 . 0 b T a b l e I I . M e a n p e r c e n t a g e o f e m e r g e n c e i n h i b i t i o n f o r t w o 4 t h i n s t a r l a r v a e o f A n o p h e l e s d a r l i n g i e x p o s e d f o r 2 4 a n d 4 8 h o u r s t o 0 . 0 0 6 p p m - c o n c e n t r a t e d D i f l u b e n z u r o n ( L C 5 0 ) , u n d e r l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s . M e a n s f o l l o w e d b y t h e s a m e l e t t e r a r e n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t ( P < 0 . 0 5 ) . F i g u r e 1 . M e a n p e r c e n t a g e s o f l a r v a l ( A ) ( K W - H ( 1 1 . 4 4 ) = 3 8 . 5 4 ; P < 0 . 0 0 1 ) , p u p a l ( B ) ( K W - H ( 1 1 . 4 4 ) = 3 0 . 3 4 ; P < 0 . 0 0 1 ) , a n d a d u l t m o r t a l i t y ( C ) ( K W - H ( 1 1 . 4 4 ) = 3 2 . 7 6 ; P < 0 . 0 0 1 ) f o r t h e c o n c e n t r a t i o n s o f D i f l u b e n z u r o n e v a l u a t e d i n t h e b i o a s s a y s a g a i n s t 4 t h - i n s t a r l a r v a e o f A n o p h e l e s d a r l i n g i .

f e a t u r e s p r o v i d e s e f f e c t i v e c o n t r o l o f p o p u l a t i o n s o f i n s e c t p e s t s , m a i n l y t h o s e o f m e d i c a l i m p o r t a n c e ( s u c h a s c u l i c i d s ) , a n d a l s o p r o v i d e s e n v i r o n m e n t a l p r o t e c t i o n ( R e s e n d e & G a m a , 2 0 0 6 ) . C o n s e q u e n t l y , t h e u s e o f D i f l u b e n z u r o n a n d o t h e r I G R s f o r t h e c o n t r o l o f m o s q u i t o e s h a s b e e n t h o r o u g h l y e v a l u a t e d i n m a n y c o u n t r i e s i n c l u d i n g B r a z i l . H o w e v e r , b e c a u s e t h e s e i n s e c t i c i d e s a d v e r s e l y a f f e c t a r t h r o p o d f a u n a , t h e i r u s e i s r e c o m m e n d e d o n l y f o r c e r t a i n l i m i t e d h a b i t a t s w i t h o u t v u l n e r a b l e e n v i r o n m e n t s ( F l o o r e , 2 0 0 6 ) . D i f l u b e n z u r o n w a s s h o w n t o b e h i g h l y t o x i c t o 4 t h - i n s t a r A . d a r l i n g i l a r v a e , i n h i b i t i n g e m e r g e n c e a t l o w c o n c e n t r a t i o n s . T h e L C 5 0 a n d L C 9 0 r e s u l t s o b t a i n e d i n t h i s s t u d y a r e s i m i l a r t o r e s u l t s p r e v i o u s l y o b t a i n e d f o r o t h e r a n o p h e l i n e s u n d e r s i m i l a r c o n d i t i o n s . J a k o b ( 1 9 7 3 ) r e p o r t e d L C 9 5 l e t h a l c o n c e n t r a t i o n s f o r A n o p h e l e s a l b i m a n u s a n d A n o p h e l e s s t e p h e n s i o f 0 . 0 0 1 p p m a n d 0 . 0 0 2 5 p p m , r e s p e c t i v e l y . M u l l a e t a l . ( 1 9 7 4 ) e s t i m a t e d t h e L C 9 0 f o r A . a l b i m a n u s o f 0 . 0 0 1 p p m . L o w e e t a l . ( 1 9 7 5 ) o b t a i n e d a n L C 9 0 o f 0 . 0 0 9 8 p p m f o r t h e s a m e s p e c i e s , a n d 0 . 0 0 4 p p m f o r A n o p h e l e s q u a d r i m a c u l a t u s S a y , 1 9 1 2 . T h e s e s t u d i e s r e p o r t e d n o v a l u e s f o r t h e L C 5 0 l e t h a l c o n c e n t r a t i o n . A l i & N a y a r ( 1 9 8 7 ) e s t i m a t e d f o r A . a l b i m a n u s a n d A . q u a d r i m a c u l a t u s , L C 5 0 s o f 0 . 0 0 1 4 2 p p m a n d 0 . 0 0 1 4 p p m , r e s p e c t i v e l y . D a m e e t a l . ( 1 9 7 6 ) , w o r k i n g w i t h a D D T - s u s c e p t i b l e a n d a r e s i s t a n t s t r a i n o f A . q u a d r i m a c u l a t u s , o b s e r v e d D i f l u b e n z u r o n L C 5 0 a n d L C 9 0 r a n g i n g f r o m 0 . 0 0 2 t o 0 . 0 0 4 p p m , r e s p e c t i v e l y . T h e r e s u l t s o b t a i n e d i n t h i s s t u d y i n d i c a t e t h a t A . d a r l i n g i s e e m s t o b e l e s s s u s c e p t i b l e t o D i f l u b e n z u r o n t h a n o t h e r p r e v i o u s l y s t u d i e d a n o p h e l i n e s . T h i s d i f f e r e n c e m a y b e a r e s u l t o f t h e h i g h h e t e r o g e n e i t y o b s e r v e d a m o n g t h e i n d i v i d u a l s f r o m t h e f i r s t g e n e r a t i o n ( F 1 ) u s e d i n t h e b i o a s s a y s . A n o p h e l e s d a r l i n g i i s a w i l d s p e c i e s , a n d a l l a t t e m p t s t o b r e e d i t i n t h e l a b o r a t o r y f o r m o r e t h a n o n e g e n e r a t i o n h a v e f a i l e d . T h e p r e v i o u s i n v e s t i g a t i o n s m e n t i o n e d o f o t h e r a n o p h e l i n e s p e c i e s u s e d s t r a i n s b r e d f o r y e a r s u n d e r l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s , r e s u l t i n g i n i n d i v i d u a l s t h a t w e r e e v e n m o r e s u s c e p t i b l e , m a i n l y t o i n s e c t i c i d e s s u c h a s D i f l u b e n z u r o n . I n r e l a t i o n t o l a r v a l , p u p a l a n d a d u l t m o r t a l i t y , o u r r e s u l t s c o n f i r m t h o s e o f M u l l a e t a l . ( 1 9 7 4 ) , w h o o b s e r v e d t h a t h i g h D i f l u b e n z u r o n c o n c e n t r a t i o n s c a u s e d g r e a t m o r t a l i t y t o A . a l b i m a n u s d u r i n g t h e l a r v a l p h a s e . L o w e r c o n c e n t r a t i o n s c a u s e d m o r t a l i t y d u r i n g p u p a l a n d a d u l t p h a s e s . T h e r e f o r e , l o w c o n c e n t r a t i o n s o f D i f l u b e n z u r o n r e t a r d i n d i v i d u a l m o r t a l i t y . T h e w a y t h a t t h e l a r v a e d i e d , e s p e c i a l l y i n t h e p u p a a n d a d u l t e m e r g e n c e p h a s e s ( d u r i n g m o l t i n g ) , r e v e a l s t h e p o t e n t i a l e f f e c t o f D i f l u b e n z u r o n t o i n t e r f e r e w i t h p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s d u r i n g c u t i c l e c h i t i n d e p o s i t i o n . B o r g e s e t a l . ( 2 0 0 4 ) d e s c r i b e d s e v e r e i n j u r i e s t o t h e c u t i c l e a n d e p i d e r m a l c e l l s o f A e d e s a e g y p t i , w h i c h c a u s e d l a r v a e d e a t h a t t h e t i m e o f m o l t i n g . O u r r e s u l t s a l s o s h o w e d t h a t D i f l u b e n z u r o n i s e f f e c t i v e f o r b o t h e x p o s u r e p e r i o d s e v a l u a t e d . B e c a u s e n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e w a s o b s e r v e d w h e n c o m p a r i n g t h e e x p o s u r e i n t e r v a l s ( 2 4 a n d 4 8 h o u r s ) , i t i s c o n c l u d e d t h a t t h e s t r e s s c a u s e d t o t h e m o s q u i t o e s d u r i n g t h e i r r e m o v a l a n d w a s h i n g h a d l i t t l e o r n o i n f l u e n c e o n i n d i v i d u a l m o r t a l i t y . A c c o r d i n g t o t h e s e r e s u l t s , i t i s e v i d e n t t h a t t h e m i n i m a l e x p o s u r e p e r i o d o f 2 4 h o u r s i s s u f f i c i e n t t o i n h i b i t m o s q u i t o e m e r g e n c e . T h e r e s u l t s o b t a i n e d i n t h i s s t u d y i n d i c a t e t h a t D i f l u b e n z u r o n a c t i n g f o r a m i n i m u m o f 2 4 h o u r s a g a i n s t A . d a r l i n g i l a r v a e i s h i g h l y e f f e c t i v e i n i n h i b i t i n g e m e r g e n c e . S a c h e r ( 1 9 7 1 ) d e m o n s t r a t e d a 9 5 % e m e r g e n c e i n h i b i t i o n w h e n u s i n g I G R M O N - 0 5 8 5 C L 9 0 o f 0 . 1 p p m a g a i n s t 4 t h - i n s t a r A e . a e g y p t i l a r v a e . I n t h e s a m e s t u d y , S a c h e r o b s e r v e d a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n a d u l t e m e r g e n c e w h e n i n d i v i d u a l s w e r e e x p o s e d t o t h e i n s e c t i c i d e f o r o n l y t h r e e h o u r s . T h e i n t e r f e r e n c e w i t h A . d a r l i n g i d e v e l o p m e n t a n d c o n s e c u t i v e e m e r g e n c e o f a d u l t s a f t e r 2 4 h o u r s o f e x p o s u r e t o D i f l u b e n z u r o n r e v e a l s i t s a b i l i t y t o p e n e t r a t e w i t h i n t h e l a r v a b o d y a n d i t s r a p i d i n t e r f e r e n c e w i t h t h e b i o c h e m i c a l m e c h a n i s m s o f c h i t i n m e t a b o l i s m . A l t h o u g h t h i s s t u d y s h o w e d t h e e f f i c i e n c y o f D i f l u b e n z u r o n a f t e r 2 4 h o u r s o f e x p o s u r e t o l a r v a e , f u r t h e r s t u d i e s a r e n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e t h e m i n i m a l e x p o s u r e p e r i o d w h e r e t h i s i n s e c t i c i d e i n t e r f e r e s w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f A . d a r l i n g i l a r v a e . T h e r e s u l t s f o r t h e p u p a e s u s c e p t i b i l i t y t e s t s a r e s h o w n i n T a b l e I I I . T h e D i f l u b e n z u r o n c o n c e n t r a t i o n e v a l u a t e d c a u s e d t o x i c i t y t o p u p a e . T h e r e w a s a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e t o x i c i t y t o p u p a e b e t w e e n t h e t w o a g e s t e s t e d , w i t h t h e 2 0 - m i n u t e - o l d p u p a e b e i n g m o r e s u s c e p t i b l e t o t h e i n s e c t i c i d e . P u p a l e m e r g e n c e i n h i b i t i o n w a s 9 3 . 0 % f o r 2 0 - m i n u t e - o l d p u p a e , a n d 6 1 . 1 % f o r 2 4 - h o u r - o l d p u p a e . A m o n g t h e 2 0 - m i n u t e - o l d p u p a e , t h e m o r t a l i t y w a s h i g h e r d u r i n g t h e p u p a l s t a g e t h a n a m o n g a d u l t s . F o r t h e 2 4 - h o u r - o l d p u p a e , m o r t a l i t y w a s h i g h e r a t m o l t i n g o n s e t ; t h e d e a t h s o f a d u l t s J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 4 4 - 4 5 0 4 4 8 C o s t a e t a l . , 2 0 1 1

m a k i n g p u p a e x u v i a a p o l y s i s i n d i f f e r e n t e m e r g e n c e l e v e l s , a n d e v e n o f i n d i v i d u a l s t h a t r e m a i n e d a t t a c h e d t o t h e e x u v i a b y p o s t e r i o r t a r s i w e r e o b s e r v e d . T h e 0 . 1 p p m c o n c e n t r a t i o n i n h i b i t e d t h e e m e r g e n c e o f b o t h p u p a l a g e s s t u d i e d . A c c o r d i n g t o M u l l a e t a l . ( 1 9 7 4 ) , C u l e x q u i n q u e f a s c i a t u s p u p a e e x p o s e d t o c o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 3 p p m s h o w e d 9 0 % e m e r g e n c e i n h i b i t i o n . A r r e d o n d o - J i m é n e z & V a l d e z - D e l g a d o ( 2 0 0 6 ) , w o r k i n g w i t h N o v a l u r o n ( a l s o b e n z o y l p h e n y l u r e a - d e r i v e d ) , o b t a i n e d 5 0 % e m e r g e n c e i n h i b i t i o n f o r p u p a e o f A . a l b i m a n u s a n d A n o p h e l e s p s e u d o p u n c t i p e n n i s T h e o b a l d , 1 9 0 1 , u s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f 2 . 9 2 a n d 6 . 6 4 p p m . T h e s e r e s u l t s a l l o w u s t o a s s u m e t h a t t h e D i f l u b e n z u r o n a c t i o n b y c o n t a c t h a s s i g n i f i c a n t i m p o r t a n c e f o r t h e c o n t r o l o f m o s q u i t o e s i n t h e p u p a l s t a g e . G r o s c u r t a n d J o n g s m a n ( 1 9 8 4 ) p o i n t e d o u t t h a t t h e d i f f u s i o n o f D i f l u b e n z u r o n t o t h e t e g u m e n t b y t o p i c a l a p p l i c a t i o n i s g e n e r a l l y t e n f o l d l e s s e f f e c t i v e t h a n b y i n g e s t i o n . B e c a u s e n o e m e r g e n c e i n h i b i t i o n w a s o b s e r v e d d u r i n g p r e l i m i n a r y t e s t s w i t h l o w e r c o n c e n t r a t i o n s , w e d e c i d e d t o u s e t h e c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 p p m , w h i c h i s 2 0 t i m e s h i g h e r t h a n t h e L C 5 0 . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t D i f l u b e n z u r o n p u p i c i d e a c t i v i t y d e p e n d s o n f e a t u r e s s u c h a s : i n s e c t i c i d e c o n c e n t r a t i o n t o b e u s e d , p u p a a g e , a n d e x p o s u r e t i m e . Y o u n g p u p a e w e r e m o r e s u s c e p t i b l e t o D i f l u b e n z u r o n t h a n w e r e o n e - d a y - o l d p u p a e . T h i s p r o b a b l y o c c u r r e d b e c a u s e o l d e r p u p a e h a v e m o r e c o n s o l i d a t e d p h y s i o l o g i c a l e v e n t s i n v o l v e d i n t e g u m e n t c h i t i n d e p o s i t i o n t h a n d o t h e y o u n g e r p u p a e , a n d t h e r e f o r e a r e l e s s s u b j e c t t o i n t e r f e r e n c e f r o m t h e i n s e c t i c i d e ( E i s l e r , 1 9 9 2 ) . A C K N O W L E D G E M E N T S . T h e a u t h o r s t h a n k t h e C o n s e l h o N a c i o n a l d e D e s e n v o l v i m e n t o C i e n t í f i c o e T e c n o l ó g i c o ( C N P q ) f o r g r a n t s , t h e I n s t i t u t o N a c i o n a l d e P e s q u i s a s d a A m a z ô n i a ( I N P A ) f o r s u p p o r t i n g t h e r e s e a r c h ( P P I p r o j e c t ) , t h e F u n d a ç ã o d e V i g i l â n c i a e m S a ú d e d o E s t a d o d o A m a z o n a s ( F V S ) f o r s a m p l i n g s u p p o r t , t h e c o m p a n y C h a m p i o n F a r m o q u í m i c o f o r p r o v i d i n g t e c h n i c a l g r a d e D i f l u b e n z u r o n , a n d P r o f e s s o r M . S c . F l á v i o A . L . F o n s e c a f o r a s s i s t i n g w i t h t h e s t a t i s t i c a l a n a l y s i s . R E F E R E N C E S A b b o t t W S . 1 9 2 5 . A m e t h o d o f c o m p u t i n g t h e e f f e c t i v e n e s s o f a n i n s e c t i c i d e . J E c o n E n t o m o l . 1 8 : 2 6 5 - 2 6 7 . A l i A , N a y a r J K . 1 9 8 7 . L a b o r a t o r y t o x i c i t y o f a n e w b e n z o y l p h e n y l u r e a I n s e c t G r o w t h R e g u l a t o r ( U C - 8 4 5 7 2 ) a g a i n s t m o s q u i t o e s a n d c h i r o n o m i d m i d g e s . J A m M o s q C o n t A s s o c . , 3 : 3 0 9 - 3 1 1 . A r r e d o n d o - J i m é n e z J I , V a l d e z - D e l g a d o K M . 2 0 0 6 . E f f e c t o f N o v a l u r o n ( R i m o n ® ) o n t h e o s q u i t o e s A n o p h e l e s a l b i m a n u s , A n o p h e l e s p s e u d o p u n c t i p e n n i s , A e d e s a e g y p t i , A e d e s a l b o p i c t u s a n d C u l e x q u i n q u e f a s c i a t u s f r o m C h i a p a s , M e x i c o . M e d V e t E n t o m o l . , 2 0 : 3 7 7 - 3 8 7 . B o r g e s R A , C a v a s i n G M , S i l v a I G , A r r u d a W , O l i v e i r a E S F , S i l v a H H G , M a r t i n s F . 2 0 0 4 . M o r t a l i d a d e e a l t e r a ç õ e s m o r f o l ó g i c a s p r o v o c a d a s p e l a a ç ã o i n i b i d o r a d o D i f l u b e n z u r o n n a e c d i s e d e l a r v a s d e A e d e s a e g y p t i ( D i p t e r a , C u l i c i d a e ) . R e v P a t o l T r o p i . , 3 3 : 9 1 - 1 0 4 . C o h e n E . 1 9 8 7 . C h i t i n b i o c h e m i s t r y : s y n t h e s i s a n d i n h i b i t i o n . A n n u R e v E n t o l . , 3 2 2 : 7 1 - 9 3 . D a m e A D , L o w R E , W i c h t e r m a n G J , C a m e r o n A L , B a l d w i n K F , M i l l e r T W . 1 9 7 6 . L a b o r a t o r y a n d f i e l d a s s e s s m e n t o f I n s e c t G r o w t h R e g u l a t o r s f o r m o s q u i t o c o n t r o l . M o s q N e w s 3 6 : 4 6 2 - 4 7 2 . E i s l e r R . 1 9 9 2 . D i f l u b e n z u r o n h a z a r d s t o f i s h , w i l d l i f e , a n d i n v e r t e b r a t e s : a s y n o p t i c r e v i e w . U . S . F i s h a n d W i l d l i f e S e r v i c e . C o n t a m i n a n t H a z a r d R e v i e w R e p o r t 2 5 . 4 - 9 . F l o o r e T G . 2 0 0 6 . M o s q u i t o l a r v a l c o n t r o l p r a c t i c e : p a s t a n d p r e s e n t . J A m M o s q C o n t A s s o c . , 2 2 : 5 2 7 - 5 3 3 . 4 4 9 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 4 4 - 4 5 0 C o s t a e t a l . , 2 0 1 1 P u p a a g e n E m e r g e n c e i n h i b i t i o n ( % ) * 2 0 m i n u t e s 9 0 9 3 . 0 ± 6 . 7 a C o n t r o l 2 0 m i n u t e s 3 0 1 6 . 7 ± 5 . 8 b c 2 4 h o u r s 9 0 6 1 . 1 ± 1 9 . 2 b C o n t r o l 2 4 h o u r s 3 0 3 . 3 ± 5 . 8 d T a b l e I I I . M e a n p e r c e n t a g e o f e m e r g e n c e i n h i b i t i o n o f t w o a g e s o f p u p a e o f A n o p h e l e s d a r l i n g i e x p o s e d t o 0 . 1 p p m - c o n c e n t r a t e d D i f l u b e n z u r o n , u n d e r l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s . * M e a n s f o l l o w e d b y t h e s a m e l e t t e r a r e n o t s t a t i s t i - c a l l y d i f f e r e n t ( P < 0 . 0 5 ) .

F o u r n e t F , S a n i e r C , M o n t e n y N . 1 9 9 3 . E f f e c t s o f t h e i n s e c t g r o w t h r e g u l a t o r s O M S 2 0 1 7 a n d D i f l u b e n z u r o n o n t h e r e p r o d u c t i v e p o t e n t i a l o f A e d e s a e g y p t i . J A m M o s q C o n t A s s o c . , 9 : 4 2 6 - 4 3 0 . G r o s c u r t A C , J o n g s m a n B . 1 9 8 4 . M o d e o f a c t i o n a n d i n s e c t i c i d a l p r o p e r t i e s o f d i f l u b e n z u r o n 7 8 - 7 8 . I n : W r i g h t J E . ( e d ) . C h i t i n a n d B e n z o y l p h e n y l u r e a s I V . S e r i e s e n t o m o l o g i c a , v . 3 8 . K . A c a d e m i c P u b l i s h e r s . 6 3 2 . J a k o b W L . 1 9 7 3 . D e v e l o p m e n t a l i n h i b i t i o n o f m o s q u i t o e s a n d t h e h o u s e f l y b y u r e a a n a l o g u e s . J M e d E n t o m o l . , 1 0 : 4 5 2 - 4 5 5 . L e O r a S o f t w a r e . 1 9 8 7 . P O L O - P C : A u s e r s g u i d e t o p r o b i t o r l o g a n a l y s i s . B e r k e l e y , C A , U S A : L e O r a S o f t w a r e 2 2 . L o w e R E , S c h w a r z M , C a m e r o n A L , D a m e D A . 1 9 7 5 . E v a l u a t i o n o f n e w l y s y n t h e s i z e d I n s e c t G r o w t h R e g u l a t o r s a g a i n s t A n o p h e l e s q u a d r i m a c u l a t u s , A n o p h e l e s a l b i m a n u s , a n d A e d e s t a e n i o r h y n c h u s . M o s q N e w s 3 5 : 5 6 1 - 5 6 3 . M u l l a M S . 1 9 9 5 . T h e f u t u r e o f i n s e c t g r o w t h r e g u l a t o r s i n v e c t o r c o n t r o l . J A m M o s q C o n t A s s o c . , 1 1 : 2 6 9 - 2 7 3 . M u l l a M S , D a r w a z e h H A , N o r l a n d R L . 1 9 7 4 . I n s e c t G r o w t h R e g u l a t o r s : E v a l u a t i o n P r o c e d u r e s a n d A c t i v i t y a g a i n s t M o s q u i t o e s . J E c o n E n t o m o l . , 6 7 : 3 2 9 - 3 3 2 . R e s e n d e M C , G a m a R A . 2 0 0 6 . P e r s i s t ê n c i a e e f i c á c i a d o r e g u l a d o r d e c r e s c i m e n t o p y r i p r o x i f e n e m c o n d i ç õ e s d e l a b o r a t ó r i o p a r a A e d e s a e g y p t i . R e v S o c B r a s M e d T r o p . , 3 9 : 7 2 - 7 5 . S a c h e r R M . 1 9 7 1 . A m o s q u i t o l a r v i c i d e w i t h f a v o r a b l e e n v i r o m e n t a l p r o p e r t i e s . M o s q N e w s . 3 1 : 5 1 3 - 5 1 6 . S c a r p a s s a V M , T a d e i W P . 1 9 9 0 . B i o l o g i a d e a n o f e l i n o s a m a z ô n i c o s . X I I I . E s t u d o s d o c i c l o b i o l ó g i c o d e A n o p h e l e s n u n e z t o v a r i ( D i p t e r a , C u l i c i d a d e ) . A c t a A m a z . , 2 0 : 9 5 - 1 1 8 . T a d e i W P , R o d r i g u e s I B , S a n t o s J M M , R a f a e l M S , P a s s o s R A , C o s t a F M , P i n t o R C , O l i v e i r a A E M . 2 0 0 7 . E n t o m o l o g i a e c o n t r o l e d e v e t o r e s : o p a p e l d a e n t o m o l o g i a n o c o n t r o l e d a m a l a r i a . R e v B r a s M e d T r o p . , 4 0 ( 2 ) : 2 3 - 2 6 . T a d e i W P , T h a t c h e r B D , S a n t o s J M M , S c a r p a s s a V M , R o d r i g u e s I B , R a f a e l M S . 1 9 9 8 . E c o l o g i c a l o b s e r v a t i o n s o n a n o p h e l i n e v e c t o r s o f m a l a r i a i n t h e B r a z i l i a n A m a z o n . A m J T r o p M e d H y g . , 5 9 : 3 2 5 - 3 3 5 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 6 : 4 4 4 - 4 5 0 4 5 0 C o s t a e t a l . , 2 0 1 1