J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y I d e n t i f i c a t i o n o f g e n e s f o r c o l d h a r d i n e s s i n J a p a n e s e s p u r g e K e y w o r d s : P a c h y s a n d r a t e r m i n a l i s , c a r b o n i c a n h y d r a s e , g l y c o l a t e o x i d a s e , N A D H P - d e p e n d e n t h y d r o x y p y r u v a t e r e d u c t a s e , P s b R , r e a l - t i m e P C R , e n z y m e a c t i v i t y . A B S T R A C T : P a c h y s a n d r a t e r m i n a l i s S i e b e t Z u c c i s a c o l d h a r d y , b u t h e a t s u s c e p t i b l e e v e r g r e e n p e r e n n i a l p l a n t . I n t h i s s t u d y t r a n s c r i p t a b u n d a n c e a n d e n z y m e a c t i v i t y w e r e m e a s u r e d f o r g e n e s p r e v i o u s l y s h o w n t o b e d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d b y t e m p e r a t u r e s t r e s s t o i d e n t i f y t h o s e g e n e s t h a t m a y b e u s e f u l f o r i m p r o v i n g t e m p e r a t u r e s t r e s s t o l e r a n c e . R o o t e d s e e d l i n g s w e r e t r e a t e d a t c o l d ( 4 o C ) , h e a t ( 3 8 o C ) a n d c o n t r o l c o n d i t i o n ( 2 2 o C ) f o r f o u r d , a n d y o u n g l e a v e s w e r e c o l l e c t e d d a i l y f r o m e a c h t r e a t m e n t . I n t h e p h o t o r e s p i r a t o r y p a t h w a y , g l y c o l a t e o x i d a s e s h o w e d h i g h e r l e v e l o f t r a n s c r i p t a n d e n z y m e a c t i v i t y w h e n p l a n t s w e r e s u b j e c t e d t o c o l d t h a n h e a t s t r e s s ; t h e e n z y m e a c t i v i t y o f N A D P H - d e p e n d e n t h y d r o x y p y r u v a t e r e d u c t a s e w a s s u p p r e s s e d b y t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t s w h e r e a s t h e t r a n s c r i p t l e v e l f l u c t u a t e d d u r i n g t h e t r e a t m e n t p e r i o d . F o r t h e p l a s t i d a l - t a r g e t e d p r o t e i n s , c a r b o n i c a n h y d r a s e w a s i n d u c e d b y c o l d , b u t s u p p r e s s e d b y h e a t t e m p e r a t u r e . T h e t r e a t e d p l a n t s c o n t a i n e d h i g h e r t r a n s c r i p t l e v e l o f p h o t o s y s t e m I I 1 0 k D P s b R a n d R u b i s c o a c t i v a s e c o m p a r e d t o t h e c o n t r o l . R e s u l t s f r o m t h i s s t u d y h a v e s h o w n t h a t g e n e e x p r e s s i o n a n d e n z y m e a c t i v i t y o f g l y c o l a t e o x i d a s e a n d c a r b o n i c a n h y d r a s e w e r e c o r r e l a t e d w i t h t h e c o l d h a r d i n e s s a n d h e a t s u s c e p t i b i l i t y o f J a p a n e s e s p u r g e , t h u s t h e s e t w o g e n e s m a y b e g o o d c a n d i d a t e g e n e s f o r c o l d t o l e r a n c e i n t h i s s p e c i e s . 5 7 1 - 5 7 9 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 7 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : S u p i n g Z h o u , J i n g Z h o u , R o g e r S a u v e I n s t i t u t i o n : D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s , S c h o o l o f A g r i c u l t u r e a n d C o n s u m e r S c i e n c e s , T e n n e s s e e S t a t e U n i v e r s i t y , 3 5 0 0 J o h n A M e r r i t t B l v d , N a s h v i l l e , T N 3 7 2 0 9 . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : S u p i n g Z h o u E m a i l : z s u p i n g @ t n s t a t e . e d u W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 9 7 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 3 1 A u g 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 1 0 S e p 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 2 8 N o v 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : S u p i n g Z h o u , J i n g Z h o u , R o g e r S a u v e I d e n t i f i c a t i o n o f g e n e s f o r c o l d h a r d i n e s s i n J a p a n e s e s p u r g e J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 7 1 - 5 7 9 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h P a p e r

I N T R O D U C T I O N T e m p e r a t u r e i s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s t h a t a f f e c t p l a n t g r o w t h a n d c r o p p r o d u c t i v i t y ( C r o s a t t i e t a l . , 1 9 9 9 ) . D u r i n g t h e e a r l y s p r i n g s e a s o n , c h i l l i n g t e m p e r a t u r e ( 0 t o 1 2 o C ) a n d b r i g h t s u n l i g h t c a n c a u s e s i g n i f i c a n t d a m a g e s ( l e a f n e c r o s i s a n d s u n b u r n ) t o m a n y c h i l l i n g s u s c e p t i b l e c r o p s . S u c h d a m a g e c a n r e s u l t i n s i g n i f i c a n t e c o n o m i c l o s s e s . P r o l o n g e d a n d e x c e s s i v e l y h e a t p e r i o d i n t h e s u m m e r s e a s o n c a n a l s o c a u s e d a m a g e s t o m a n y l a n d s c a p e p l a n t s . B r o a d e n i n g t h e t e m p e r a t u r e r a n g e t h a t a p l a n t c a n t o l e r a t e c o u l d m a k e s i g n i f i c a n t c o n t r i b u t i o n s t o a g r i c u l t u r e . N o r m a l l y , p l a n t s p e c i e s a r e e i t h e r c o l d t o l e r a n t a n d h e a t s u s c e p t i b l e o r h e a t t o l e r a n t a n d c o l d s u s c e p t i b l e . F o r e v e r g r e e n l a n d s c a p e p l a n t s i n p a r t i c u l a r , i t i s i m p o r t a n t f o r t h e i r f o l i a g e t o m a i n t a i n t i s s u e i n t e g r i t y d e s p i t e r a p i d t e m p e r a t u r e f l u c t u a t i o n d u r i n g t h e i r g r o w i n g s e a s o n . G e n e s t h a t c o n f e r t o l e r a n c e t o e x t r e m e l y c o l d o r h e a t t e m p e r a t u r e s c a n b e u s e d f o r d e v e l o p i n g t o l e r a n t v a r i e t i e s u s i n g m a r k e r - a s s i s t e d b r e e d i n g a n d g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n a p p r o a c h . P h o t o s y n t h e s i s a n d c a r b o n f i x a t i o n a r e v e r y s e n s i t i v e t o t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s . F o r m o s t o f t e m p e r a t e C 3 p l a n t s , t h e p e a k C O 2 a s s i m i l a t i o n o f t e n o c c u r s a t 2 5 t o 3 0 ° C . I n c r e a s i n g l e a f t e m p e r a t u r e b e y o n d t h i s r a n g e i n h i b i t s p h o t o s y n t h e s i s . O n t h e o t h e r h a n d , c h i l l i n g - s u s c e p t i b l e s p e c i e s w o u l d e x p e r i e n c e 3 0 - 6 0 % r e d u c t i o n i n p h o t o s y n t h e t i c a c t i v i t y w h e n a i r t e m p e r a t u r e i s b e l o w 1 0 o C ( L e v i t t , 1 9 8 0 ; P o w l e s , 1 9 8 4 ) . R i b u l o s e - 1 , 5 - b i s p h o s p h a t e c a r b o x y l a s e o x y g e n a s e ( R u b i s c o ) i s a b i f u n c t i o n a l e n z y m e , i t c a t a l y z e s e i t h e r t h e c a r b o x y l a t i o n o r t h e o x y g e n a t i o n o f r i b u l o s e - 1 , 5 - b i s p h o s p h a t e w i t h c a r b o n d i o x i d e o r o x y g e n . I n C 3 p l a n t s , a s t e m p e r a t u r e i n c r e a s e s , t h e r a t i o o f d i s s o l v e d O 2 / C O 2 a n d t h e s p e c i f i c i t y o f r i b u l o s e 1 , 5 b i s p h o s p h a t e c a r b o x y l a s e / o x y g e n a s e ( R u b i s c o ) f o r O 2 i n c r e a s e s , t h u s f a v o r i n g t h e o x y g e n a s e a c t v i t i y ( M o n s o n e t a l , 1 9 8 2 ) . T h e o x y g e n a s e r e a c t i o n o f R u b i s c o s y n t h e s i z e s v e r y l a r g e a m o u n t s o f 2 - p h o s p h o g l y c o l a t e ( 2 - P G ) ( A n d r e w s e t a l . , 1 9 7 1 ; B o w e s e t a l . , 1 9 7 1 ) . T h e 2 - P G m o l e c u l e c a n n o t b e u s e d b y p l a n t s f o r b i o s y n t h e t i c r e a c t i o n s ; i t i s a p o t e n t i n h i b i t o r o f c h l o r o p l a s t i c f u n c t i o n ( A n d e r s o n , 1 9 7 1 ; R i z h s k y e t a l . , 2 0 0 2 ) . I n p l a n t s , t h e t o x i c 2 - P G m o l e c u l e s a r e c o n v e r t e d i n t o 3 - p h o s p h o g l y c e r i c a c i d ( 3 - P G A ) t h r o u g h p h o t o r e s p i r a t o r y p a t h w a y . O n t h e o t h e r h a n d , c o l d s t r e s s u n d e r l i g h t e d c o n d i t i o n i n d u c e s p h o t o c h e m i c a l d a m a g e s ( p h o t o i n h i b i t i o n ) t o t h e p h o t o s y n t h e t i c m a c h i n e r y , t h e e x c e s s i v e p h o t o c h e m i c a l e n e r g y i s d i s s i p a t e d t h r o u g h t h e p h o t o r e s p i r a t o r y p a t h w a y f o r a v o i d i n g d a m a g e s t o p h o t o s y s t e m I ( P S I ) a n d P S I I ( K u d o h a n d S o n o i k e , 2 0 0 2 ; T a k a h a s h i n e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h u s w h e n p l a n t s a r e g r o w i n g u n d e r s t r e s s c o n d i t i o n s , p h o t o r e s p i r a t i o n p l a y a k e y r o l e i n p r o t e c t i n g t h e s t r u c t u r a l i n t e g r i t y o f p h o t o s y n t h e t i c a p p a r a t u s ( O s m o n d e t a l . , 1 9 9 7 ; P a r k e t a l . , 1 9 9 6 ; ) , s e r v i n g a s a n a l t e r n a t i v e e l e c t r o n s i n k a n d l o w e r s t h e q u a n t u m y i e l d o f p h o t o s y n t h e s i s ( W e i s a n d B e r r y , 1 9 8 8 ) , a n d g e n e r a t i n g i n t e r m e d i a t e s f o r s y n t h e s i s o f p o l y a m i n e s a n d o t h e r p r o t e c t i o n s u b s t a n c e s . T r a n s g e n i c r i c e p l a n t s w i t h h i g h e r p h o t o r e s p i r a t o r y a c t i v i t y s h o w e d e n h a n c e d t o l e r a n c e t o s a l t a n d c h i l l i n g s t r e s s ( H o s h i d a e t a l . , 2 0 0 0 ) . P h o t o r e s p i r a t o r y p a t h w a y i n v o l v e s t h r e e t y p e s o f o r g a n e l l e s : c h l o r o p l a s t s , p e r o x i s o m e s a n d m i t o c h o n d r i a . I n l e a f p e r o x i s o m e s , g l y c o l a t e o x i d a s e i s t h e f i r s t e n z y m e t o r e c e i v e g l y c o l a t e f o r m e d f r o m 2 - P G i n c h l o r o p l a s t , a n d c o n v e r t t h e t o x i c m o l e c u l e i n t o g l y o x y l a t e . H y d r o x y p y r u v a t e r e d u c t a s e i s t h e l a s t e n z y m e t o c a t a l y z e t h e c o n v e r s i o n o f p y r u v a t e i n t o g l y c e r a t e w h i c h e n t e r s t h e c h l o r o p l a s t t o r e c y c l e t h e g l y c o l a t e c a r b o n b a c k i n t o t h e C a l v i n c y c l e . W i t h i n t h e c h l o r o p l a s t , c a r b o n i c a n h y d r a s e c a t a l y z e s t h e h y d r a t i o n o f C O 2 t o b i c a r b o n a t e , t h u s i n c r e a s i n g t h e l o c a l a v a i l a b i l i t y o f C O 2 a t t h e c a r b o x y l a t i o n r e a c t i o n s i t e o f r i b u l o s e - 1 , 5 - b i s p h o s p h a t e c a r b o x y l a s e o x y g e n a s e ( R u b i s c o ) ( G r a h a m a n d R e e d , 1 9 7 1 ) . W h e n c o t t o n p l a n t s w e r e s u b j e c t e d h e a t t r e a t m e n t , t h e l o w r a t e o f p h o t o s y n t h e s i s c o i n c i d e d w i t h r e d u c e d c a r b o n a t e a c t i v i t y ( D o w n t o n a n d S l a t y e r , 1 9 7 2 ) . T r a n s c r i p t e x p r e s s i o n o f t h i s g e n e w a s s u p p r e s s e d b y c o l d s t r e s s i n t h e w a r m s e a s o n c r o p c h i c k p e a ( C i c e r a r i e t i n u m ) ( M a n t r i e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h e 1 0 - k D a P s b R p r o t e i n i s e s s e n t i a l f o r s t a b l e a s s e m b l y o f t h e o x y g e n - e v o l v i n g c o m p l e x i n P S I I ( S u o r s a e t a l . , 2 0 0 6 ) ; i t i s a l s o o n e o f t h e p r i m a r y t a r g e t s o f t h e r m a l d a m a g e i n p l a n t s ( A l l a h v e r d i y e v e t a l . , 2 0 0 7 ) . R u b i s c o a c t i v a s e f u n c t i o n s a s c h a p e r o n e t o p r o m o t e a n d m a i n t a i n t h e c a t a l y t i c a c t i v i t y o f R u b i s c o ( P o r t i s , 2 0 0 3 ) . R e d u c t i o n o f R u b i s c o a c t i v a s e a c t i v i t y l i m i t s t h e R u b i s c o a c t i v a t i o n a n d , t h e r e f o r e , t h e C O 2 a s s i m i l a t i o n r a t e s a t h i g h t e m p e r a t u r e s ( Y a m o r i a n d v o n C a e m m e r e r , 2 0 0 9 ) . J a p a n e s e s p u r g e ( P a c h y s a n d r a t e r m i n a l i s ) i s a c o l d h a r d y e v e r g r e e n p e r e n n i a l i n t h e b o x w o o d f a m i l y , B u x a c e a e . P l a n t s c a n o v e r w i n t e r a t b e l o w - 3 3 ° C i n U S D A z o n e 5 ( A ) ( S a g e b u d , 2 0 1 1 ) . N e w g r o w t h 5 7 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 7 1 - 5 7 9 Z h o u e t a l . , 2 0 1 1

o c c u r s w h e n t e m p e r a t u r e i s a t 1 0 t o 2 2 o C i n s p r i n g , e a r l y s u m m e r a n d f a l l . I n c u b a t o r e x p e r i m e n t i n o u r l a b o r a t o r y f o u n d t h a t w h e n p l a n t s w e r e e x p o s e d t o t e m p e r a t u r e b e l o w 0 o C , l e a v e s w e r e f r o z e n , b u t t h e y r e c o v e r e d w i t h o u t a n y s i g n o f d a m a g e s s o o n a f t e r b e i n g t r a n s f e r r e d t o w a r m e r t e m p e r a t u r e ( u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h e s p e c i e s i s s u s c e p t i b l e t o h e a t s t r e s s . P l a n t s n o r m a l l y c e a s e p u t t i n g o u t n e w g r o w t h w h e n a i r t e m p e r a t u r e r i s e s a b o v e 3 0 ° C , l e a v e s b e c o m e v e r y c h l o r o t i c a t a b o v e 3 5 ° C u n d e r f u l l s u n c o n d i t i o n . F i v e g e n e s w e r e i s o l a t e d f r o m c o l d - t r e a t e d l e a v e s o f J a p a n e s e s p u r g e b y c D N A d i f f e r e n t i a l d i s p l a y a n d r a c e - P C R ( Z h o u e t a l . , 2 0 0 5 , 2 0 0 6 ) . T h e s e g e n e s a r e g l y c o l a t e o x i d a s e ( P t G O X , a c c e s s i o n D Q 4 4 2 2 8 6 ) a n d N A D P H - d e p e n d e n t h y d r o x y p y r u v a t e r e d u c t a s e ( P t H P R , a c c e s s i o n D Q 4 4 2 2 8 7 ) i n t h e p h o t o r e s p i r a t i o n p a t h w a y , p h o t o s y s t e m I I P s b R ( P t P s b R , a c c e s s i o n D Q 7 8 1 3 0 6 ) , p l a s t i d a l β - c a r b o n i c a n h y d r a s e ( P t C A , a c c e s s i o n D Q 7 8 1 3 0 8 ) , a n d R u b i s c o a c t i v a s e ( P t R C A , a c c e s s i o n D Q 4 8 6 9 0 5 ) . I n t h i s s t u d y , g e n e e x p r e s s i o n a n d / o r e n z y m e a c t i v i t y i n l e a v e s o f p l a n t s t r e a t e d u n d e r c o l d ( 4 o C ) o r h e a t ( 3 8 o C ) t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s w e r e m e a s u r e d t o a s s o c i a t e m o l e c u l a r a n d b i o c h e m i c a l c h a n g e s t o p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e s , a n d t o i d e n t i f y c a n d i d a t e g e n e s f o r c o l d t o l e r a n c e i n J a p a n e s e s p u r g e . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S P l a n t m a t e r i a l p r e p a r a t i o n a n d t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t s : R o o t e d c u t t i n g s b e a r i n g f o u r - s i x d a r k g r e e n m a t u r e l e a v e s w e r e o b t a i n e d f r o m C l a s s i c G r o u n d C o v e r s ( A t h e n s , G A ) . U p o n a r r i v a l , t h e s e p l a n t s w e r e m a i n t a i n e d i n t h e s h a d e i n a g r e e n h o u s e a t T e n n e s s e e S t a t e U n i v e r s i t y ( N a s h v i l l e ) . T h e n , t h e y w e r e p l a c e d i n i n c u b a t o r s w h i c h w e r e p r o g r a m m e d a t 2 2 ± 1 ° C w i t h a 1 2 - h p h o t o p e r i o d p r o v i d e d b y f l u o r e s c e n t l i g h t s ( 1 0 0 µ m o l . m 2 . s 1 p h o t o s y n t h e t i c a l l y a c t i v e r a d i a t i o n s ) f o r f o u r d . F o r t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t , t h e i n c u b a t o r w a s r e p r o g r a m m e d a t 4 ± 1 ° C ( f o r c o l d t r e a t m e n t ) o r 3 8 ± 1 ° C ( f o r h e a t t r e a t m e n t ) . F o r t h e c o n t r o l t r e a t m e n t , p l a n t s w e r e m a i n t a i n e d a t 2 2 ± 1 ° C . T h e l i g h t - d a r k c y c l e w a s u n c h a n g e d f o r t h e t r e a t m e n t s . S h o r t d u r a t i o n s o f c o l d o r h e a t o f t e n s h o w l i t t l e o r n o d a m a g e t o p l a n t s , b u t e x p o s u r e t o u n f a v o r a b l e t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s f o r a l o n g l e n g t h o f t i m e c a n b e d e v a s t a t i n g t o s u s c e p t i b l e s p e c i e s . T h e e x p e r i m e n t w a s d e s i g n e d t o a n a l y z e d a i l y c h a n g e s o v e r a f o u r d p e r i o d , i n o r d e r t o i d e n t i f y t h e m e c h a n i s m s t h a t r e s u l t i n t o l e r a n c e f o r l e n g t h y t e m p e r a t u r e s t r e s s c o n d i t i o n s . L e a f s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d a f t e r 1 d , 2 d a n d 3 d a n d 4 d o f i n c u b a t i o n . L e a f s a m p l e s c o l l e c t e d f r o m t h e d a y b e f o r e t h e b e g i n n i n g o f t h e e x p e r i m e n t w e r e r e p o r t e d a s z e r o h o u r . T o a v o i d e f f e c t s o f c i r c a d i a n r h y t h m s , a l l t i s s u e s w e r e h a r v e s t e d a t 9 0 0 H R ; f i v e h o u r a f t e r t h e l i g h t c y c l e b e g a n . T h e t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t e x p e r i m e n t w a s r e p e a t e d t w i c e . T h e t o p t w o f u l l y - e x p a n d e d l i g h t - g r e e n y o u n g l e a v e s w e r e h a r v e s t e d w h i l e p l a n t s w e r e i n t h e i n c u b a t o r s . L e a v e s f r o m f o u r p l a n t s w e r e p o o l e d t o f o r m o n e b i o l o g i c a l r e p l i c a t e a n d t h r e e r e p l i c a t e s w e r e h a r v e s t e d a t e a c h c o l l e c t i o n p e r i o d . S a m p l e s w e r e f r o z e n i n l i q u i d n i t r o g e n a n d s t o r e d a t - 8 0 o C i m m e d i a t e l y a f t e r h a r v e s t i n g f r o m p l a n t s . E n z y m e a n d t o t a l R N A w e r e e x t r a c t e d s o o n a f t e r c o m p l e t i o n o f t h e t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t e x p e r i m e n t . E n z y m e e x t r a c t i o n a n d a c t i v i t y a s s a y : E x c e p t a s n o t e d , a l l c h e m i c a l s u s e d w e r e o b t a i n e d f r o m S i g m a ( S t . L o u i s , M O ) . F o r e n z y m e e x t r a c t i o n , l e a f t i s s u e s a m p l e s w e r e g r o u n d i n t o a f i n e p o w d e r u n d e r l i q u i d n i t r o g e n . T h e p o w d e r ( 2 0 0 m g ) w a s r e s u s p e n d e d i n 2 m l o f p r e c h i l l e d 5 0 m M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) w i t h 1 m M p o l y e t h y l e n e g l y c o l ( m o l e c u l a r w e i g h t : 8 0 0 0 ) , 8 % p o l y v i n y l p y r o l y d o n e ( m o l e c u l a r w e i g h t : 4 0 , 0 0 0 ) , a n d 0 . 0 1 % T r i t o n X - 1 0 0 . P r o t e i n e x t r a c t i o n w a s c a r r i e d o u t b y i n c u b a t i n g t h e m i x t u r e f o r n i n e h o u r s a t 4 o C w h i l e b e i n g c o n s t a n t l y m i x e d o n a r o t a r y m i x e r . A f t e r t w o c e n t r i f u g a t i o n s a t 1 2 , 0 0 0 g n a n d 4 o C f o r 1 0 m i n , t h e c l e a r s u p e r n a t a n t t h a t c o n t a i n e d e n z y m e s w a s i m m e d i a t e l y u s e d f o r a n a l y s i s o f e n z y m e a c t i v i t y d e s c r i b e d s u b s e q u e n t l y . M e a s u r e m e n t o f c a r b o n i c a n h y d r a s e w a s d o n e b y f o l l o w i n g t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y I y e r e t a l ( 2 0 0 6 ) w i t h m i n o r m o d i f i c a t i o n s ( S i g m a , 1 9 9 4 ) . T h e r e a c t i o n s o l u t i o n c o n t a i n e d 2 0 m M T r i s - s u l f a t e b u f f e r , p H 7 . 6 , a n d 3 m M p - n i t r o p h e n y l a c e t a t e ( M P B i o m e d i c a l s , S o l o n , O H ) . T h e a b s o r b a n c e a t 3 4 8 n m w a s d e t e c t e d e v e r y m i n f o r 1 0 m i n s . C a t a l y t i c a c t i v i t y o f c a r b o n a t e a n h y d r a s e w a s d e t e r m i n e d f o l l o w i n g t h e f o r m a t i o n o f p - n i t r o p h e n o l ( e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t o f 5 m M - 1 . c m - 1 ) ( I y e r e t a l , 2 0 0 6 ; S i g m a , 1 9 9 4 ) . G l y c o l a t e o x i d a s e w a s a s s a y e d e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d b y F e i e r a b e n d a n d B e e v e r s ( 1 9 7 2 ) b y t h e i n c r e a s e o f a b s o r p t i o n a t 3 2 4 n m e v e r y m i n f o r 1 0 m i n . T h e a s s a y m i x t u r e c o n t a i n e d 3 3 m M t r i e t h a n o l e a m i n e b u f f e r , p H , 7 . 8 ; 2 . 7 m M E D T A , p H 7 . 8 ; 0 . 0 0 8 3 % T r i t o n X - 1 0 0 ; 0 . 2 m M f l a v i n J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 7 1 - 5 7 9 5 7 3 Z h o u e t a l . , 2 0 1 1

m o n o n u c l e o t i d e ( F M N ) ; 3 . 3 m M p h e n y l h y d r a z i n e - H C l , p H 6 . 8 a n d 5 m M g l y c o l i c a c i d ( n e u t r a l i z e d t o p H 7 . 0 w i t h 1 M N a O H ) . G l y c o l a t e o x i d a s e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d b y f o l l o w i n g t h e f o r m a t i o n o f g l y o x y l a t e p h e n y l h y d r a z o n e ( e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t o f 1 7 m M - 1 . c m - 1 ) . F o r h y d r o x y p y r u v a t e r e d u c t a s e , t h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n e d 2 5 m M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r , p H 5 . 8 ; 0 . 0 1 % T r i t o n X - 1 0 0 , 0 . 2 m M N A D H ; 1 m M d i t h i o t h r e i t o l a n d 2 0 m M s o d i u m g l y o x y l a t e . A f t e r t h e a d d i t i o n o f N A D H , t h e a b s o r b a n c e a t 3 2 4 n m w a s m e a s u r e d e v e r y m i n f o r 2 0 m i n . E n z y m e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d b y f o l l o w i n g t h e o x i d a t i o n o f N A D H ( e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t o f 6 . 2 m M - 1 . c m - 1 ) ( B o o k e r e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e B i o r a d P r o t e i n A s s a y r e a g e n t ( B i o r a d , H e r c u l e s , C A ) . A s t a n d a r d c u r v e w a s c o n s t r u c t e d w i t h b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) . A l l a b s o r b a n c e m e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d o n a S p e c t r a M a x M 5 ( M o l e c u l a r D e v i c e s , S u n n y v a l e , C A ) , u s i n g C o s t a r 3 6 3 5 U V t r a n s p a r e n t p l a t e s ( C o r n i n g I n c o r p o r a t e d , C o r n i n g , N Y ) . T h e a b s o r b a n c e i n e a c h w e l l w a s n o r m a l i z e d t o a p a t h l e n g t h o f 1 c m u s i n g t h e f a c t o r y - s t o r e d v a l u e s i n t h e S O F T M A X ® P R O S O F T W A R E ( V e r s i o n 5 , M o l e c u l a r D e v i c e s ) . Q u a n t i t a t i v e - r e v e r s e - t r a n s c r i p t a s e - p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( q - R T - P C R ) . T o t a l R N A w a s i s o l a t e d u s i n g R N A P u r e R e a g e n t a n d g e n o m i c D N A w a s r e m o v e d w i t h D N a s e I i n t h e M e s s e n g e r C l e a n K i t ( G e n h u n t e r , N a s h v i l l e , T N ) . R N A s a m p l e s w e r e a n a l y z e d a n d q u a n t i f i e d u s i n g a N a n o D r o p ® N D - 1 0 0 0 s p e c t r o p h o t o m e t e r ( N a n o D r o p T e c h n o l o g i e s , R o c k l a n d , D E ) . Q - R T P C R a s s a y w a s d o n e u s i n g a t w o - s t e p p r o c e d u r e . I n t h e f i r s t s t e p , R N A w a s t r a n s c r i b e d i n t o c D N A u s i n g O l i g o - d T p r i m e r s f o r t a r g e t g e n e s a n d r a n d o m p r i m e r s f o r r R N A u s i n g t h e T a q m a n R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n R e a g e n t s ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A ) f o l l o w i n g t h e m a n u f a c t o r y s m a n u a l . R e a l - t i m e P C R p r i m e r s w e r e d e s i g n e d u s i n g t h e P r i m e r E x p r e s s v e r s i o n 2 . 0 s o f t w a r e ( A p p l i e d B i o S y s t e m s ) . I n i t i a l l y t h r e e p a i r s o f p r i m e r s w e r e t e s t e d f o r e a c h g e n e i n c l u d i n g t h e h o u s e k e e p i n g g e n e . A f t e r e x a m i n i n g t h e P C R p r o d u c t s o n 2 % a g a r o s e g e l , t h e p r i m e r p a i r t h a t p r o d u c e d o n e s i n g l e b a n d o f t h e e x p e c t e d s i z e w a s s e l e c t e d f o r q - P C R a n a l y s i s . T h e 1 8 S r i b o s o m a l R N A ( 1 8 S r R N A ) w a s s e l e c t e d a s t h e h o u s e k e e p i n g g e n e t o n o r m a l i z e t h e r e a l - t i m e P C R d a t a . I t s p r i m e r s w e r e d e s i g n e d a g a i n s t a n A r a b i d o p s i s 1 8 S R N A s e q u e n c e f r o m t h e G e n B a n k ( N C - 0 0 3 0 7 1 , r e g i o n : 3 7 0 6 . . 5 5 1 3 ) . T h e f o r w a r d / r e v e r s e p r i m e r s w e r e 5 - C A T C A G C T C G C G T T G A C T A C - 3 / 5 - C A C T T C A C C G G A T C A T T C A A - 3 , r e s p e c t i v e l y , w h i c h p r o d u c e s a n a m p l i c o n o f 1 1 0 b p . T h e f o r w a r d / r e v e r s e p r i m e r s f o r t a r g e t g e n e s w e r e d e s i g n e d a g a i n s t t h e o p e n r e a d i n g f r a m e r e g i o n . T h e p r i m e r s e q u e n c e s w e r e P t p s b R - 5 - G A G C T T G A G G G A T G G T C T T G - 3 / 5 - C A C C A C T T G G A G A C C A A T C A - 3 , a m p l i c o n s i z e 1 3 7 b p ; P t C A - 5 - G A C G A T G G G A C C A C C T C T A C - 3 / 5 - C C G A A C T C A G C T T T C A C C T T - 3 , a m p l i c o n s i z e 8 5 b p ; P t R C A - 5 - G T T C A G C T C C C C G G T A T G T A - 3 / 5 - C G G A T A A G A G G G G C A T A C A A - 3 , a m p l i c o n s i z e 9 7 b p ; P t G O X - 5 - G T T T G T G G A T G G T G G G A T T C - 3 / 5 - C A G C A C A G G T C G T C C A A T A A - 3 , a m p l i c o n s i z e 9 1 b p ; a n d P t H P R - 5 - T G A G G A C G A G C C T T A C A T G A - 3 / 5 - C A G C T A G A G T C G C C A T T C C T - 3 , a m p l i c o n s i z e 1 1 2 b p . A l l p r i m e r s w e r e s y n t h e s i z e d b y I n v i t r o g e n ( C a r l s b a d , C A ) . I n a p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t , t h e c o p y n u m b e r o f 1 8 S R N A i n t h e s a m p l e s w a s f o u n d t o b e 2 0 - 2 5 f o l d h i g h e r t h a n t a r g e t g e n e s . I n t h e a s s a y , t h e q P C R m i x t u r e ( 3 0 µ l ) c o n t a i n e d c D N A ( e q u a l t o 1 0 0 n g t o t a l R N A f o r t a r g e t g e n e s , a n d 1 0 n g f o r 1 8 S R N A ) , p r i m e r m i x ( 2 5 0 n M e a c h ) a n d 2 x P C R m a s t e r m i x s u p p l i e d i n t h e S Y B R - g r e e n P C R m i x / R T k i t ( A p p l i e d B i o S y s t e m s ) . P C R a m p l i f i c a t i o n w a s p e r f o r m e d u s i n g a p r o g r a m c o n s i s t i n g o f 4 0 c y c l e s o f 9 4 o C , 3 0 s , a n d 6 0 o C , 1 m i n o n a 7 0 0 0 R e a l T i m e P C R S y s t e m ( A p p l i e d B i o s y s t e m s ) . A t t h e e n d o f t h e P C R c y c l e s , a l l d a t a w e r e a n a l y z e d w i t h t h e A B I P r i s m 7 0 0 0 S D S s o f t w a r e ( A p p l i e d B i o s y s t e m s ) a n d p r e s e n t e d a s C t v a l u e . T o c h e c k t h e s p e c i f i c i t y o f a n n e a l i n g o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e s , d i s s o c i a t i o n k i n e t i c s w a s p e r f o r m e d b y t h e i n s t r u m e n t a t t h e e n d o f e a c h P C R r u n . D a t a f r o m c o n t r o l s a m p l e s ( 2 2 o C ) w e r e u s e d a s t h e r e f e r e n c e t o d e t e r m i n e t h e r e l a t i v e g e n e e x p r e s s i o n u n d e r t r e a t e d c o n d i t i o n s . T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n ( f o l d c h a n g e ) c o m p a r e d t o c o n t r o l w a s e s t i m a t e d u s i n g 2 - Δ Δ C T , w h e r e Δ Δ C t = Δ C t ( 4 o C o r 3 8 o C ) - Δ C t ( 2 2 o C ) . R a n g e s o f f o l d g i v e n f o r e a c h t r e a t m e n t w e r e d e t e r m i n e d a s 2 - Δ Δ C T + s f o r u p p e r l i m i t , a n d 2 - Δ Δ C t s f o r l o w e r l i m i t , w h e r e s = t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n o f t h e Δ Δ C t v a l u e s a m o n g t h e s i x b i o l o g i c a l r e p l i c a t e s ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , 1 9 9 7 ) . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d u s i n g t h e S t u d e n t s t - t e s t f u n c t i o n ( p a i r e d a n d o n e t a i l - 5 7 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 7 1 - 5 7 9 Z h o u e t a l . , 2 0 1 1

d i s t r i b u t i o n ) i n M i c r o s o f t E x c e l 2 0 0 7 , a n d t h e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e w a s d e t e r m i n e d a t P < 0 . 0 5 l e v e l . R E S U L T S E f f e c t o f t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t s o n s t a b l e e x p r e s s i o n o f t h e i n t e r n a l r e f e r e n c e g e n e : T h e s t a b i l i t y o f i n t e r n a l r e f e r e n c e g e n e e x p r e s s i o n i s a p r e r e q u i s i t e t o s t a n d a r d i z e t h e t a r g e t g e n e e x p r e s s i o n d a t a . T h e C t v a l u e s o f t h e 1 8 S R N A g e n e w e r e c o m p a r e d t o d e t e r m i n e t h e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s u n d e r w h i c h e x p r e s s i o n l e v e l s o f t h e h o u s e k e e p i n g g e n e r e m a i n e d c o n s t a n t . A f t e r f o u r d t r e a t m e n t , C t v a l u e o f h e a t t r e a t e d s a m p l e i n c r e a s e d b y n e a r l y o n e c y c l e ( w h i c h e q u a l s t o t w o - f o l d c h a n g e ) c o m p a r e d t o c o n t r o l ( 2 2 o C ) a n d c o l d t r e a t m e n t ( 4 o C ) ( T a b l e 1 ) . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e 1 8 S R N A g e n e t r a n s c r i p t i o n w a s a f f e c t e d b y h e a t s t r e s s a f t e r 4 d o f t r e a t m e n t , a n d q - P C R a n a l y s i s s h o u l d o n l y b e p e r f o r m e d f o r t r e a t m e n t s l a s t i n g t h r e e d . T e m p e r a t u r e e f f e c t s o n g e n e t r a n s c r i p t i o n T h e t w o g e n e s i n t h e p h o t o r e s p i r a t o r y p a t h w a y s h o w e d d i f f e r e n t e x p r e s s i o n p a t t e r n s u n d e r c o l d o r h e a t t r e a t m e n t s . F o r t h e g l y c o l a t e o x i d a s e , t h e t r a n s c r i p t l e v e l i n c r e a s e d 1 . 8 - f o l d a f t e r o n e d o f t r e a t m e n t , f o l l o w e d b y g r a d u a l d e c r e a s e t o n e a r t h e c o n t r o l l e v e l a f t e r 2 - 3 d o f c o l d t r e a t m e n t . T h e t r a n s c r i p t l e v e l i n h e a t t r e a t e d l e a v e s w a s d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ( - 2 - f o l d ) a f t e r t h r e e d ( F i g . 1 A ) . F o r t h e h y d r o x y p y r u v a t e r e d u c t a s e , a f t e r o n e d o f t r e a t m e n t , t r a n s c r i p t l e v e l w a s e n h a n c e d ( 2 . 5 - f o l d ) b y c o l d , b u t s u p p r e s s e d ( - 1 . 3 - f o l d ) b y h e a t t r e a t m e n t . D u r i n g t h e r e m a i n i n g t w o d , g e n e e x p r e s s i o n i n c o l d o r h e a t t r e a t e d t i s s u e s f o l l o w e d t h e s a m e p a t t e r n , t h e t r a n s c r i p t l e v e l d e c l i n e d ( - 2 - f o l d ) a f t e r t w o d b u t i n c r e a s e d ( > 2 . 5 - f o l d ) a f t e r t h r e e d ( F i g . 1 B ) o f t r e a t m e n t . F o r t h e c a r b o n i c a c t i v a t a s e , t r a n s c r i p t l e v e l i n c r e a s e d a f t e r o n e d f o l l o w e d b y g r a d u a l d e c l i n e t o t h e c o n t r o l l e v e l i n c o l d t r e a t m e n t . U n d e r h e a t t r e a t m e n t , t h e t r a n s c r i p t l e v e l r e m a i n e d s t a b l e a f t e r o n e d , f o l l o w e d b y r a p i d d e c l i n e d u r i n g t h e n e x t t w o d ( F i g . 1 C ) . F o r R u b i s c o a c t i v a s e , t r a n s c r i p t l e v e l h a d a d r a s t i c i n c r e a s e ( 6 - f o l d ) a f t e r o n e d , a f a l l b a c k t o 2 . 6 - f o l d a t t w o d , a n d a m o r e d r a s t i c i n c r e a s e ( 8 - f o l d ) a f t e r t h r e e d u n d e r h e a t t r e a t m e n t c o n d i t i o n . T h e s a m e g e n e w a s a l s o i n d u c e d b y c o l d t e m p e r a t u r e , b u t s i g n i f i c a n t i n c r e a s e ( f o l d ) o f t r a n s c r i p t a b u n d a n c e w a s d e l a y e d t o a f t e r 3 t h r e e d o f i n c u b a t i o n ( F i g . 1 D ) . G e n e e x p r e s s i o n o f P t p s b R g e n e w a s i n d u c e d b y t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t s , t h e t r a n s c r i p t l e v e l i n t r e a t e d t i s s u e s w a s 1 . 5 t o 2 . 5 f o l d h i g h e r t h a n t h e c o n t r o l ( F i g . 1 E ) . T e m p e r a t u r e e f f e c t s o n e n z y m e a c t i v i t y C o l d t r e a t m e n t a c t i v a t e d e n z y m e a c t i v i t y o f g l y c o l a t e o x i d a s e , e n z y m e a c t i v i t y i n c r e a s e d b y 2 . 5 - 4 u n i t s c o m p a r e d t o t h e u n t r e a t e d c o n t r o l a f t e r t w o d a n d t h r e e d i n c u b a t i o n , r e s p e c t i v e l y . A s c o l d t r e a t m e n t e x t e n d e d t o t h r e e d , t h e e n z y m e a c t i v i t y s t a r t e d t o d r o p t o t h e c o n t r o l l e v e l a n d r e m a i n e d a t t h e s a m e l e v e l a f t e r f o u r d ( F i g . 2 A ) . G l y c o l a t e o x i d a s e a c t i v i t y w a s s u p p r e s s e d b u t n o t s i g n i f i c a n t l y b y h e a t t r e a t m e n t . F o r h y d r o x y p y r u v a t e r e d u c a t a s e , e n z y m e a c t i v i t y f l u c t u a t e d d a i l y d u r i n g t h e e x p e r i m e n t , b u t i t w a s a l w a y s l o w e r i n t h e t r e a t e d t i s s u e s t h a n t h o s e i n t h e c o n t r o l ( F i g . 2 B ) . F o r t h e c a r b o n i c a c t i v a t e , t h e e n z y m e a c t i v i t y w a s i n d u c e d a f t e r o n e d o f c o l d t r e a t m e n t , w h i c h w a s f o l l o w e d b y g r a d u a l d e c l i n i n g t o t h e c o n t r o l l e v e l . I n t h e c o n t r a r y h e a t s u p p r e s s e d c a r b o n i c a c t i v a s e . T h e e n z y m e a c t i v i t y w a s r e d u c e d b y 1 , 1 . 5 , a n d 2 . 0 u n i t s a f t e r 1 , 2 a n d 3 d o f h e a t t r e a t m e n t ( F i g . 2 C ) . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 7 1 - 5 7 9 5 7 5 Z h o u e t a l . , 2 0 1 1 T r e a t m e n t T i m e p e r i o d y 0 h x 1 d 2 d 3 d 4 d 2 2 o C 1 8 . 9 8 ± 0 . 2 9 a w 1 8 . 8 3 ± 0 . 1 5 a 1 8 . 9 5 ± 0 . 0 9 a 1 8 . 9 0 ± 0 . 1 5 a 1 8 . 8 5 ± 0 . 0 5 a 4 o C 1 8 . 9 8 ± 0 . 2 9 a 1 8 . 7 9 ± 0 . 1 2 a 1 8 . 7 1 ± 0 . 1 1 a 1 8 . 9 5 ± 0 . 2 4 a 1 8 . 8 9 ± 0 . 1 2 a 3 8 o C 1 8 . 9 8 ± 0 . 2 9 a 1 8 . 9 7 ± 0 . 0 6 a 1 8 . 8 2 ± 0 . 0 4 a 1 8 . 9 8 ± 0 . 0 9 b 1 9 . 9 5 ± 0 . 1 5 T a b l e 1 T h e C t z v a l u e o f 1 8 S r R N A i n l e a v e s o f P a c h y s a n d r a t e r m i n a l i s u n d e r c o l d a n d h e a t t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t s z T h e c y c l e t h r e s h o l d ( C t ) w h i c h i s d e f i n e d a s t h e n u m b e r o f c y c l e s r e q u i r e d f o r t h e f l u o r e s c e n t s i g n a l t o c r o s s t h e t h r e s h o l d i n a q u a n t i t a t i v e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n a s s a y . y N u m b e r o f d a y s u n d e r t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t . x S a m p l e s c o l l e c t e d b e f o r e t h e t r e a t m e n t . w C t v a l u e : m e a n ± S D ( s t a n d a r d d e v i a t i o n a m o n g t h r e e b i o l o g i c a l r e p l i c a t e s a m p l e s ) . A n y t w o m e a n s w i t h i n a r o w n o t f o l l o w e d b y t h e s a m e l e t t e r a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t P < 0 . 0 5 b y t h e S t u d e n t s t - t e s t f u n c t i o n ( p a i r e d a n d o n e t a i l - d i s t r i b u t i o n ) .

D I S C U S S I O N G l y c o l a t e o x i d a s e i s t h e f i r s t e n z y m e i n p h o t o r e s p i r a t o r y p a t h w a y , i t i s l o c a l i z e d i n p e r o x i s o m e s i n g r e e n l e a v e s o f h i g h e r p l a n t s ( Z e l i t c h e t a l . , 2 0 0 9 ) . S u f f i c i e n t a c t i v i t i e s o f g l y c o l a t e o x i d a s e a r e r e q u i r e d t o m a i n t a i n n o r m a l a c t i v i t i e s o f p h o t o s y n t h e t i c s y s t e m ( F o c k a n d K r o t k o v , 1 9 6 9 ; Y a m a g u c h i a n d N i s h i m u r a , 2 0 0 0 ) . I n t h i s s t u d y , w e h a v e f o u n d t h a t g l y c o l a t e o x i d a s e w a s i n d u c e d b y c o l d b u t s u p p r e s s e d b y h e a t t r e a t m e n t . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t p l a n t s g r o w i n g u n d e r c o l d o r h e a t s t r e s s c o n d i t i o n s a r e u s i n g 5 7 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 7 1 - 5 7 9 Z h o u e t a l . , 2 0 1 1 A : g l y c o l a t e o x i d a s e B : N A D P H - d e p e n d e n t h y d r o x y p y r u v a t e r e d u c t a s e C : c a r b o n i c a c t i v a s e D : R u b i s c o a c t i v a s e E : p h o t o s y s t e m I I P s b R . F i g . 1 . E f f e c t o f t e m p e r a t u r e s t r e s s o n t r a n s c r i p t a b u n d a n c e i n J a p a n e s e s p u r g e . R o o t e d c u t t i n g s o f P a c h y s a n d r a t e r m i n a l i s w e r e t r e a t e d a t c o l d ( 4 o C ) o r h e a t ( 3 8 o C ) c o n d i t i o n s f o r 1 , 2 , 3 a n d 4 d . T h e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f g e n e t r a n s c r i p t s w a s c o m p a r e d b e t w e e n c o l d ( 4 o C ) a n d h e a t ( 3 8 o C ) t o t h a t o f c o n t r o l ( 2 2 o C ) i n y o u n g l e a v e s a f t e r 1 d , 2 d , a n d 3 d o f t r e a t m e n t s . V a l u e s a r e g i v e n i n f o l d c h a n g e f r o m t r e a t e d t i s s u e s t o t h e c o n t r o l . B a r s i n d i c a t e t h e u p p e r a n d l o w e r r a n g e s o f t h e f o l d v a l u e s . V a l u e s o f f o l d s a n d r a n g e s w e r e d e t e r m i n e d b y e v a l u a t i n g t h e e x p r e s s i o n : 2 - Δ Δ C T w i t h Δ Δ C t + s a n d Δ Δ C t s , w h e r e s = t h e s t a n - d a r d d e v i a t i o n o f t h e Δ Δ C t v a l u e s a m o n g t h e s i x b i o l o g i c a l r e p l i c a t e s f o r e a c h t r e a t m e n t .

s e p a r a t e r e g u l a t o r y m e c h a n i s m f o r g l y c o l a t e o x i d a s e . N A D H - d e p e n d e n t h y d r o x y p y r u v a t e r e d u c t a s e i s a n o t h e r e n z y m e i n t h e s a m e p a t h w a y . W h i l e t h e g e n e t r a n s c r i p t l e v e l h a d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e a f t e r 3 d i n c u b a t i o n u n d e r c o l d o r h e a t c o n d i t i o n s , t h e e n z y m e a c t i v i t y d e c l i n e d i n t h e t r e a t e d t i s s u e s . T h e r e i s a d i s p a r i t y b e t w e e n t r a n s c r i p t a n d e n z y m e a c t i v i t y f o r t h i s g e n e . N A D H - d e p e n d e n t h y d r o x y p y r u v a t e r e d u c t a s e a c t i v i t y i s n o t t o t a l l y c o n f i n e d t o t h e p e r o x i s o m a l c o m p a r t m e n t i n p l a n t c e l l s . T h e e n z y m e i s l o c a l i z e d i n t h e c y t o s o l ( 7 0 % i n P i s u m s a t i v u m L . ) , c h l o r o p l a s t a n d p e r o x i s o m e s ( K l e c z k o w s k i e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n t h i s s t u d y , t h e p r o t e i n w a s e x t r a c t e d f r o m w h o l e l e a f t i s s u e s , t h u s t h e m e a s u r e m e n t v a l u e i s t h e t o t a l c e l l u l a r e n z y m e a c t i v i t y . R e d u c t i o n i n e n z y m e a c t i v i t y o f N A D H - d e p e n d e n t h y d r o x y p y r u v a t e r e d u c t a s e m a y n o t n e c e s s a r i l y a f f e c t t h e p h o t o r e s p i r a t o r y p a t h w a y . C a r b o n i c a n h y d r a s e s c a t a l y z e s t h e r e v e r s i b l e h y d r a t i o n o f c a r b o n d i o x i d e , f a c i l i t a t i n g t h e d i f f u s i o n o f i n o r g a n i c c a r b o n i n t o t h e c e l l a n d a l l o w i n g t h e a c c u m u l a t e d i n o r g a n i c c a r b o n w i t h i n t h e c e l l t o g e n e r a t e h i g h e r l e v e l s o f C O 2 a r o u n d J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 7 1 - 5 7 9 5 7 7 Z h o u e t a l . , 2 0 1 1 A : G l y c o l a t e o x i d a s e . A b s o r b a n c e a t A 3 2 4 w a s r e c o r e d e d e v e r y m i n f o r 2 0 m i n , a n d e n z y m e a c i t i v t y w a s d e t e r m i n e d f o l l o w i n g f o r m a t i o n o f g l y o x y l a t e p h e n y l h y d r a z o n e ( e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t o f 1 7 m M - 1 . c m - 1 ) . E n z y m e a c t i v i t y i s s h o w n a s u n i t s / m g p r o t e i n . B : N A D P H - d e p e n d e n t h y d r o x y p y r u v a t e r e d u c t a s e . A b s o r b a n c e a t A 3 2 4 w a s r e c o r e d e d e v e r y m i n f o r 2 0 m i n , e n z y m e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d b y f o l l o w i n g t h e o x i d a t i o n o f N A D H ( e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t o f 6 . 2 m M - 1 . c m - 1 ) ( B o o k e r e t a l . , 1 9 9 7 ) . E n z y m e a c t i v i t y i s s h o w n a s u n i t s / m g p r o t e i n . C : C a r b o n i c a c t i v a s e . A b s o r b a n c e a t A 3 4 8 w a s r e c o r e d e d e v e r y m i n f o r 1 0 m i n , a n d e n z y m e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d f o l l o w i n g t h e f o r m a t i o n o f p - n i t r o p h e n o l ( e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t o f 5 m M - 1 . c m - 1 ) . E n z y m e a c t i v i t y i s s h o w n a s u n i t s / m g p r o t e i n . F i g . 2 . E f f e c t s o f t e m p e r a t u r e o n e n z y m e a c t i v i t y i n J a p a n e s e s p u r g e . R o o t e d c u t t i n g s o f P a c h y s a n d r a t e r m i n a l i s w e r e t r e a t e d a t c o l d ( 4 o C ) a n d h e a t ( 3 8 o C ) c o n d i t i o n s f o r 1 , 2 , 3 a n d 4 d . E n z y m e a c t i v i t y i n y o u n g l e a v e s a f t e r 1 d , 2 d , a n d 3 d o f t r e a t m e n t s w e r e m e a s u r e d . M e a n s ( v a l u e s o n t h e Y - a x i s ) ± s t a n d a r d d e v i a t i o n ( s t a n d a r d e r r o r b a r s ) f r o m s i x b i o l o g i c a l r e p l i c a t e s a r e s h o w n .

R u b i s c o ( V i l l a r d e t a l . , 1 9 9 7 ) . S i m i l a r t o g l y c o l a t e o x i d a s e , c a r b o n i c a n h y d r a s e w a s i n d u c e d b y c o l d , a n d s u p p r e s s e d b y h e a t s t r e s s i n J a p a n e s e s p u r g e . T h e r e s p o n s e o f c a r b o n i c a n h y d r a s e g e n e c o r r e l a t e s t o t h e c o l d h a r d i n e s s a n d h e a t s u s c e p t i b i l i t y p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f t h e s p e c i e s . E x p r e s s i o n o f t h e 1 0 k D a p o l y p e p t i d e P s b R a n d R u b i s c o a c t i v a s e w a s i n d u c e d u n d e r c o l d o r h e a t t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s . T h e i n d u c t i o n b y t h e t w o t e m p e r a t u r e e x t r e m e s i n d i c a t e s t h a t t h e s e g e n e s a r e n o t d i r e c t l y i n v o l v e d i n c o l d t o l e r a n c e ; i n s t e a d t h e y a r e m o r e l i k e l y c o m p o n e n t s o f t h e g e n e r a l r e s p o n s e m e c h a n i s m s t o v a r i o u s s t r e s s c o n d i t i o n s i n J a p a n e s e s p u r g e . T o l e r a n c e o f p l a n t s t o e n v i r o n m e n t a l s t r e s s i s r e g u l a t e d b y a c o m p l e x m o l e c u l a r n e t w o r k c o n s i s t i n g o f m u l t i p l e g e n e s . I n t h i s s t u d y , a d i s t i n c t i v e r e s p o n s e t o c o l d o r h e a t t e m p e r a t u r e w a s i d e n t i f i e d f o r g l y c o l a t e o x i d a s e a n d c a r b o n i c a n h y d r a s e , w h i c h c o r r e l a t e s w i t h t h e c o l d h a r d i n e s s a n d h e a t s u s c e p t i b i l i t y o f J a p a n e s e s p u r g e . T h e s e t w o g e n e s m a y b e g o o d c a n d i d a t e g e n e s f o r s e l e c t i o n a n d b r e e d i n g f o r c o l d t o l e r a n c e o f n u r s e r y c r o p s . L I T E R A T U R E C I T E D A l l a h v e r d i y e v Y F , M . M a m e d o v b , S . S u o r s a a , S . S t y r i n g b , I . V a s s c , a n d E . M . A r o a . 2 0 0 7 . I n s i g h t s i n t o t h e f u n c t i o n o f P s b R p r o t e i n i n A r a b i d o p s i s t h a l i a n a . B i o c h i m i c a B i o p h y s i c a A c t a ( B B A ) B i o e n e r g e t i c s 1 7 6 7 : 6 7 7 6 8 5 . A n d e r s o n L E . 1 9 7 1 . C h l o r o p l a s t a n d c y t o p l a s m i c e n z y m e s . I I . P e a l e a f t r i o s e p h o s p h a t e i s o m e r a s e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 2 3 5 : 2 3 7 - 2 4 4 . A n d r e w s T J , L o r i m e r G H a n d N E . T o l b e r t . 1 9 7 1 . R i b u l o s e d i p h o s p h a t e o x y g e n a s e . I . s y n t h e s i s o f p h o s p h o g l y c o l a t e b y f r a c t i o n - I p r o t e i n o f l e a v e s . B i o c h e m i s t r y 1 2 : 1 1 - 1 8 . A p p l i e d B i o s y s t e m s . 1 9 9 7 . R e l a t i v e q u a n t i t a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n . A B I P R I S M 7 7 0 0 S e q u e n c e D e t e c t i o n S y s t e m U s e r B u l l e t i n 2 : 1 1 - 1 5 . B o o k e r F L , R e i d C D , B r u n s c h o n - H a r t i S , F i s c u s E L a n d M i l l e r J E . 1 9 9 7 . P h o t o s y n t h e s i s a n d p h o t o r e s p i r a t i o n i n s o y b e a n [ G l y c i n e m a x ( L . ) M e r r . ] c h r o n i c a l l y e x p o s e d t o e l e v a t e d c a r b o n d i o x i d e a n d o z o n e . J . E x p t . B o t . 4 8 : 1 8 4 3 - 1 8 5 2 . B o w e s G , O g r e n W L a n d H a g e m a n R H . 1 9 7 1 . P h o s p h o g l y c o l a t e p r o d u c t i o n c a t a l y s e d b y r i b u l o s e d i p h o s p h a t e c a r b o x y l a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 4 5 : 7 1 6 - 7 2 2 . C r o s a t t i C , D e L a u r e t o P , B a s s i R a n d C a t t i v e l l i L . 1 9 9 9 . T h e I n t e r a c t i o n b e t w e e n c o l d a n d l i g h t c o n t r o l s t h e e x p r e s s i o n o f t h e c o l d - r e g u l a t e d b a r l e y g e n e c o r 1 4 b a n d t h e a c c u m u l a t i o n o f t h e c o r r e s p o n d i n g p r o t e i n . P l a n t P h y s i o l . 1 1 9 : 6 7 1 - 6 8 0 . D o w n t o n J a n d R S l a t y e r . 1 9 7 2 . T e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e o f p h o t o s y n t h e s i s i n c o t t o n . P l a n t P h y s i o l . 5 0 : 5 1 8 5 2 2 . F e i e r a b e n d J a n d B e e v e r s . H . 1 9 7 2 . D e v e l o p m e n t a l s t u d i e s o n m i c r o b o d i e s i n w h e a t l e a v e s : I I . o n t o g e n y o f p a r t i c u l a t e e n z y m e a s s o c i a t i o n s . P l a n t P h y s i o l . 4 9 : 2 8 - 3 2 . F o c k H a n d K r o t k o v G . 1 9 6 9 . R e l a t i o n b e t w e e n p h o t o r e s p i r a t i o n a n d g l y c o l a t e o x i d a s e a c t i v i t y i n s u n f l o w e r a n d r e d k i d n e y b e a n l e a v e s . C a n . J . B o t . 4 7 : 2 3 7 - 2 4 0 . G r a h a m D a n d R e e d M L . 1 9 7 1 . C a r b o n i c a n h y d r a s e a n d t h e r e g u l a t i o n o f p h o t o s y n t h e s i s . N a t u r e N e w B i o l . 2 3 1 : 8 1 - 8 3 . H o s h i d a H , T a n a k a Y , H i b i n o T , H a y a s h i Y , T a n a k a A , T a k a b e T a n d T a k a b e T . 2 0 0 0 . E n h a n c e d t o l e r a n c e t o s a l t s t r e s s i n t r a n s g e n i c r i c e t h a t o v e r e x p r e s s e s c h l o r o p l a s t g l u t a m i n e s y n t h e t a s e . P l a n t M o l . B i o l . , 4 3 : 1 0 3 - 1 1 1 . I y e r R , B a r r e s e A A , P a r a k h S , P a r k e r C N a n d T r i p p B C . 2 0 0 6 . I n h i b i t i o n p r o f i l i n g o f h u m a n c a r b o n i c a n h y d r a s e I I b y h i g h - t h r o u g h p u t s c r e e n i n g o f s t r u c t u r a l l y d i v e r s e , b i o l o g i c a l l y a c t i v e c o m p o u n d s . J . B i o m o l . S c r e e n 1 1 : 7 8 2 - 7 9 1 . K l e c z k o w s k i L A , G i v a n C V , H o d g s o n J M a n d R a n d a l l D D . 1 9 8 8 . S u b c e l l u l a r l o c a t i o n o f N A D P H - d e p e n d e n t h y d r o x y p y r u v a t e r e d u c t a s e a c t i v i t y i n l e a f p r o t o p l a s t s o f P i s u m s a t i v u m L . a n d i t s r o l e i n p h o t o r e s p i r a t o r y m e t a b o l i s m . P l a n t P h y s i o l . 8 8 : 1 1 8 2 - 1 1 8 5 . K u d o h H a n d S o n o i k e K . 2 0 0 2 . I r r e v e r s i b l e d a m a g e t o p h o t o s y s t e m I b y c h i l l i n g i n t h e l i g h t : c a u s e o f t h e d e g r a d a t i o n o f c h l o r o p h y l l a f t e r r e t u r n i n g t o n o r m a l g r o w t h t e m p e r a t u r e . P l a n t a 2 1 5 : 5 4 1 - 5 4 8 . 5 7 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 7 1 - 5 7 9 Z h o u e t a l . , 2 0 1 1

L e v i t t J . 1 9 8 0 . R e s p o n s e s o f p l a n t s t o e n v i r o n m e n t a l s t r e s s e s . C h i l l i n g , f r e e z i n g a n d h i g h t e m p e r a t u r e s t r e s s e s . 2 n d e d . A c a d e m i c P r e s s , N . Y . M a n t r i N , F o r d R , C o r a m T a n d P a n g E . 2 0 0 7 . T r a n s c r i p t i o n a l p r o f i l i n g o f c h i c k p e a g e n e s d i f f e r e n t i a l l y r e g u l a t e d i n r e s p o n s e t o h i g h s a l i n i t y , c o l d a n d d r o u g h t . B M C G e n o m i c s 8 : 3 0 3 . d o i : 1 0 . 1 1 8 6 / 1 4 7 1 - 2 1 6 4 - 8 - 3 0 3 . M o n s o n R K , J r . L i t t l e j o h n R O a n d I I I W i l l i a m s . G J . 1 9 8 2 . T h e q u a n t u m y i e l d f o r C O 2 u p t a k e i n C 3 a n d C 4 g r a s s e s . P h o t o s y n . R e s . 3 : 1 5 3 - 1 5 9 . O s m o n d B , B a d g e r M , M a x w e l l K , B j ö r k m a n O . a n d L e e g o o d . R C . 1 9 9 7 . T o o m a n y p h o t o n s : p h o t o r e s p i r a t i o n , p h o t o i n i b i t i o n a n d p h o t o o x i d a t i o n . T r e n d s P l a n t S c i . 2 : 1 1 9 - 1 2 1 . P a r k Y I , C h o w W S , O s m o n d C B a n d A n d e r s o n J M . 1 9 9 6 . E l e c t r o n t r a n s p o r t t o o x y g e n m i t i g a t e s a g a i n s t p h o t o i n a c t i v a t i o n o f p h o t o s y s t e m I I i n v i v o . P h o t o s y n . R e s . 5 0 : 2 3 - 3 2 . P o r t i s A R . J r . 2 0 0 3 . R u b i s c o a c t i v a s e - R u b i s c o ' s c a t a l y t i c c h a p e r o n e . P h o t o s y n . R e s . 7 5 : 1 1 2 7 . P o w l e s S B . 1 9 8 4 . P h o t o i n h i b i t i o n o f p h o t o s y n t h e s i s i n d u c e d b y v i s i b l e l i g h t . A n n . R e v . P l a n t P h y s i o l . 3 5 : 1 5 - 4 4 . R i z h s k y L , L i a n g H a n d M i t t l e r R . 2 0 0 2 . T h e c o m b i n e d e f f e c t o f d r o u g h t s t r e s s a n d h e a t s h o c k o n g e n e e x p r e s s i o n i n t o b a c c o . P l a n t P h y s i o l . 1 3 0 : 1 1 4 3 1 1 5 1 . S a g e b u d . 2 0 1 1 . J a p a n e s e P a c h y s a n d r a ( P a c h y s a n d r a t e r m i n a l i s ) . 1 3 M a y 2 0 1 1 . < h t t p : / / w w w . s a g e b u d . c o m / j a p a n e s e - p a c h y s a n d r a - p a c h y s a n d r a - t e r m i n a l i s / > . S i g m a . 1 9 9 4 . E n z y m a t i c A s s a y o f c a r b o n a t e a n h y d r a s e ( E C 4 . 2 . 1 . 1 ) . 1 3 M a y 2 0 1 1 . < w w w . s i g m a a l d r i c h . c o m / e t c / m e d i a l i b / d o c s / S i g m a / G e n e r a l I n f o r m a t i o n / c a r b o n i c a n h y d r a s e c s r d . P a r . 0 0 0 1 . F i l e . d a t / c a r b o n i c a n h y d r a s e c s r d . p d f > . S u o r s a M , S i r p i ö S , A l l a h v e r d i y e v a Y , P a a k k a r i n e n V , M a m e d o v S . S t y r i n g a n d A r o E M . 2 0 0 6 . P s b R , a m i s s i n g l i n k i n t h e a s s e m b l y o f t h e o x y g e n - e v o l v i n g c o m p l e x o f p l a n t p h o t o s y s t e m I I . J . B i o l . C h e m . 2 8 1 : 1 4 5 - 1 5 0 . T a k a h a s h i n S , B a u w e H a n d M B a d g e r . 2 0 0 7 . I m p a i r m e n t o f t h e p h o t o r e s p i r a t o r y p a t h w a y a c c e l e r a t e s p h o t o i n h i b i t i o n o f p h o t o s y s t e m I I b y s u p p r e s s i o n o f r e p a i r p r o c e s s a n d n o t a c c e l e r a t i o n o f d a m a g e p r o c e s s i n A r a b i d o p s i s t h a l i a n a . P l a n t P h y s i o l . 1 4 4 : 4 8 7 - 4 9 4 . V i l l a r d P , E r i k s s o n M a n d S a m u e l s s o n G . 1 9 9 7 . C a r b o n d i o x i d e a n d l i g h t r e g u l a t i o n o f p r o m o t e r s c o n t r o l l i n g t h e e x p r e s s i o n o f m i t o c h o n d r i a l c a r b o n i c a n h y d r a s e i n C h l a m y d o m o n a s r e i n h a r d t i i ) . B i o c h e m . J . 3 2 7 : 5 1 - 5 7 . W e i s E a n d B e r r y J A . 1 9 8 8 . P l a n t s a n d h i g h t e m p e r a t u r e s t r e s s . S y m p . S o c . E x p . B i o l . 4 2 : 3 2 9 - 3 4 6 . Y a m o r i W a n d V o n C a e m m e r e r S . 2 0 0 9 . E f f e c t o f R u b i s c o a c t i v a s e d e f i c i e n c y o n t h e t e m p e r a t u r e r e s p o n s e o f C O 2 a s s i m i l a t i o n r a t e a n d R u b i s c o a c t i v a t i o n s t a t e : i n s i g h t s f r o m t r a n s g e n i c t o b a c c o w i t h r e d u c e d a m o u n t s o f R u b i s c o a c t i v a s e . P l a n t P h y s i o l . 1 5 1 : 2 0 7 3 - 2 0 8 2 . Y a m a g u c h i K a n d N i s h i m u r a M . 2 0 0 0 . R e d u c t i o n t o b e l o w t h r e s h o l d l e v e l s o f g l y c o l a t e o x i d a s e a c t i v i t i e s i n t r a n s g e n i c t o b a c c o e n h a n c e s p h o t o i n h i b i t i o n d u r i n g i r r a d i a t i o n . P l a n t C e l l P h y s i o l . 4 1 : 1 3 9 7 - 1 4 0 6 . Z e l i t c h I , S c h u l t e s N P , P e t e r s o n R B , B r o w n P , a n d B r u t n e l l T P . 2 0 0 9 . H i g h g l y c o l a t e o x i d a s e a c t i v i t y i s r e q u i r e d f o r s u r v i v a l o f m a i z e i n n o r m a l a i r . P l a n t P h y s i o l . 1 4 9 : 1 9 5 - 2 0 4 . Z h o u S P , S a u v e R a n d A b d u l l a h A . 2 0 0 5 . I d e n t i f i c a t i o n o f g e n e s r e g u l a t e d b y l o w t e m p e r a t u r e i n P a c h y s a n d r a t e r m i n a l i s S i e b . e t Z u c c u s i n g c D N A d i f f e r e n t i a l d i s p l a y . H o r t S c i e n c e 4 0 : 1 9 9 5 - 1 9 9 7 . Z h o u S P , C h e n F C , N a h a s h o n S a n d C h e n T . 2 0 0 6 . C l o n i n g a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f g l y c o l a t e o x i d a s e a n d N A D H - d e p e n d e n t h y d r o p y r u v a t e r e d u c t a s e g e n e s i n P a c h y s a n d r a t e r m i n a l s . H o r t s c i e n c e 1 3 2 : 1 - 5 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 7 1 - 5 7 9 5 7 9 Z h o u e t a l . , 2 0 1 1