J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y I n f l u e n c e o f v a r i o u s p H r e g i m e s o n h a t c h i n g s u c c e s s a n d h a t c h i n g t i m e o f C l a r i a s g a r i e p i n u s ( B u t c h e l l 1 8 2 2 ) e g g s . K e y w o r d s : C l a r i a s g a r i e p i n u s , p H , H a t c h i n g s u c c e s s , H a t c h i n g t i m e . A B S T R A C T : A l a b o r a t o r y e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d t o a s s e s s t h e H a t c h i n g s u c c e s s a n d H a t c h i n g t i m e o f C l a r i a s g a r i e p i n u s e g g s a s i n f l u e n c e d b y v a r i o u s p H t r e a t m e n t s . E x p e r i m e n t a l s o l u t i o n c o m p r i s i n g v a r i o u s p H r a n g e s ( 2 - 1 2 ) w a s c o n s t i t u t e d u s i n g H C l a n d C a O H s o l u t i o n s a s t h e c a s e m a y b e . F o r t y C l a r i a s g a r i e p i n u s e g g s w e r e d i s t r i b u t e d i n e a c h 3 . 5 l i t e r p l a s t i c b a s i n c o n t a i n i n g d i f f e r e n t p H r e g i m e s a n d w e r e a l l o w e d t o s t a n d f o r 2 4 h o u r s i n c u b a t i o n . R e s u l t s s h o w e d t h a t e x t r e m e p H o f 2 - 3 a n d 1 0 - 1 2 w e r e 1 0 0 % l e t h a l t o C l a r i a s g a r i e p i n u s e g g s . T h e m e d i a n l e t h a l h a t c h i n g p H ( M L 5 0 H p H ) w e r e f o u n d t o b e 4 . 4 5 a n d 9 . 4 0 f o r a c i d i c a n d a l k a l i n e t r e a t m e n t r e s p e c t i v e l y w h i l e t h e o p t i m a l h a t c h i n g p H i s 6 . 0 w i t h h a t c h a b i l i t y o f 7 5 % . H o w e v e r p H o f 4 , 5 a n d 1 0 c a u s e d a p r o l o n g a t i o n i n e m b r y o g e n e s i s , w h i c h r e s u l t e d i n d e l a y e d h a t c h i n g t i m e w h e n c o m p a r e d w i t h o t h e r p H t r e a t m e n t s . T h e r e w a s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) e f f e c t o f v a r i o u s p H r e g i m e s o n h a t c h i n g s u c c e s s a n d h a t c h i n g t i m e o f C l a r i a s g a r i e p i n u s e g g s . 5 1 3 - 5 1 7 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 7 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : U z o k a C N 1 , M g b e a h u r u i k e L O 1 , N w o d u J A 2 . I n s t i t u t i o n : 1 . D e p a r t m e n t o f E n v i r o n m e n t a l T e c h n o l o g y , F e d e r a l U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y , O w e r r i , I m o S t a t e , N i g e r i a . 2 . D e p a r t m e n t o f E n v i r o n m e n t a l T e c h n o l o g y , F e d e r a l U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y , O w e r r i , I m o S t a t e , N i g e r i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : U z o k a C N W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 9 4 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 3 0 A u g 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 1 6 S e p 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 1 0 N o v 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : U z o k a C N , M g b e a h u r u i k e L O , N w o d u J A . I n f l u e n c e o f v a r i o u s p H r e g i m e s o n h a t c h i n g s u c c e s s a n d h a t c h i n g t i m e o f C l a r i a s g a r i e p i n u s ( B u t c h e l l 1 8 2 2 ) e g g s . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 1 3 - 5 1 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h P a p e r

I N T R O D U C T I O N T h e c o n c e p t t h a t e v e r y r e c i p i e n t w a t e r b o d y h a s c a p a c i t y t o a s s i m i l a t e c o n t a m i n a n t s h a s b e e n t h e b a s i s f o r e s t a b l i s h m e n t o f q u a l i t y c r i t e r i a f o r a q u a t i c l i f e b y d i f f e r e n t i n t e r n a t i o n a l a n d n a t i o n a l o r g a n i z a t i o n s ( T r a i n 1 9 7 9 ) . A c c o r d i n g t o E u r o p e a n I n l a n d F i s h e r i e s A d v i s o r y C o m m i s s i o n ( E I F A C 1 9 8 7 ) w a t e r q u a l i t y c r i t e r i a f o r f r e s h w a t e r f i s h s h o u l d i d e a l l y p e r m i t a l l s t a g e s i n t h e l i f e c y c l e t o b e s u c c e s s f u l l y c o m p l e t e d a n d i n a d d i t i o n s h o u l d n o t p r o d u c e c o n d i t i o n s i n a r i v e r w a t e r w h i c h w o u l d e i t h e r t a i n t t h e f l e s h o f t h e f i s h o r c a u s e t h e m t o a v o i d a s t r e t c h o f r i v e r w h e r e t h e y w o u l d o t h e r w i s e b e p r e s e n t o r g i v e r i s e t o a c c u m u l a t i o n o f d e l e t e r i o u s s u b s t a n c e s i n f i s h t o s u c h a d e g r e e t h a t t h e y a r e p o t e n t i a l l y h a r m f u l w h e n c o n s u m e d . I n e s t a b l i s h i n g w a t e r q u a l i t y c r i t e r i a f o r i n l a n d f i s h e r i e s t h e a c i d i t y o r a l k a l i n i t y o f t h e w a t e r h a s b e e n a n i m p o r t a n t f a c t o r ( A l a b a s t e r a n d L l o y d , 1 9 8 2 ) . I n w a t e r q u a l i t y c r i t e r i a f o r p H v a l u e s , O R S A N C O ( 1 9 5 5 ) r e p o r t e d t h a t a l t h o u g h f i s h h a s b e e n f o u n d a t p H v a l u e s b e t w e e n 4 a n d 1 0 , t h e s a f e r a n g e i s b e t w e e n 5 a n d 9 , a n d f o r m a x i m u m p r o d u c t i v i t y t h e p H v a l u e s h o u l d b e b e t w e e n 6 . 5 a n d 8 . 5 . S t r e a m s w i t h p H v a l u e s a s l o w a s 2 . 0 t o a s h i g h a s 4 . 0 m a y o c c u r i n t h e v i c i n i t y o f i n d u s t r i e s a s a r e s u l t o f i n d u s t r i a l p o l l u t a n t s ( K n e e s e a n d B o w e r 1 9 6 8 ) . T h e s e p o l l u t a n t s m a y i n c l u d e a c i d s s u c h a s s u l p h u r i c a c i d d i s c h a r g e d b y c h e m i c a l a n d o t h e r i n d u s t r i a l p l a n t s . p H c h a n g e s i n H 2 O a r e a l s o a f f e c t e d b y a l k a l i s s u c h a s N a O H w h i c h i s a w a s t e f r o m m a n y i n d u s t r i e s i n c l u d i n g s o a p m a n u f a c t u r i n g , t e x t i l e d y i n g , r u b b e r r e c l a i m i n g a n d l e a t h e r t a n n i n g ( K n e e s e a n d B o w e r , 1 9 6 8 ) . H o w e v e r i n a c i d w a t e r s , t h e a b s e n c e o f f i s h o r r e d u c t i o n i n i t s p o p u l a t i o n m a y b e a s s o c i a t e d w i t h o t h e r f a c t o r s , s u c h a s l a c k o f n u t r i e n t s , h i g h t e m p e r a t u r e o r s u p e r s a t u r a t i o n o f d i s s o l v e d g a s e s o t h e r t h a n t h e p r e s e n c e o f h y d r o g e n i o n s . T h e A f r i c a n C a t f i s h , C l a r i a s g a r i e p i n u s i s v e r y p o p u l a r f o r f i s h f a r m i n g . C . g a r i e p i n u s i n h a b i t c a l m w a t e r s f r o m L a k e s , S t r e a m s a n d R i v e r s t o S w a m p s , s o m e o f w h i c h a r e s u b j e c t t o s e a s o n a l d r y i n g ( C h e r v i n s k i , 1 9 8 3 ) . I t i s h i g h l y c o n s u m e d i n N i g e r i a a n d r e c e n t l y c o m m e r c i a l p r o d u c t i o n h a s g a i n e d p o p u l a r i t y . T h e r e f o r e t h i s p r e s e n t r e s e a r c h w a s a i m e d t o a s s e s s t h e i n f l u e n c e o f d i f f e r e n t p H r e g i m e s o n h a t c h i n g s u c c e s s a n d h a t c h i n g t i m e o f C . g a r i e p i n u s . M A T E R I A L S & M E T H O D S C l a r i a s g a r i e p i n u s e g g s u s e d i n t h i s e x p e r i m e n t w e r e o b t a i n e d ( a r t i f i c i a l l y i n d u c e d m e t h o d ) f r o m t h e h a t c h e r y d e p a r t m e n t o f A f r i c a n R e g i o n a l A q u a c u l t u r e C e n t r e ( A R A C ) P o r t H a r c o u r t . H y p o p h y s a t i o n a n d E g g P r o d u c t i o n : T h e f e m a l e a n d m a l e C l a r i a s g a r i e p i n u s u s e d i n t h i s w o r k h a d b e e n k e p t i n f a c i l i t i e s o f t h e A f r i c a n R e g i o n a l A q u a c u l t u r e C e n t r e ( A R A C ) P o r t H a r c o u r t . F e m a l e C . g a r i e p i n u s w e r e c h o s e n o n t h e b a s i s o f o v a r i a n b i o p s y o f t h e O o c y t e s a s d e s c r i b e d b y L e g e n d r e ( 1 9 8 6 ) . M a l e s w e r e c h o s e n o n t h e b a s i s o f p o s s e s s i o n o f p o i n t e d a n d h y p e r a m i c u r i n o g e n i t a l p a p i l l a r ( H o g e n d o r n , 1 9 7 9 ) . H o r m o n e a d m i n i s t r a t i o n w a s c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o ( W o y n a r o v i c h a n d H o r v a r t h , 1 9 8 0 ) b e t w e e n 1 5 . 0 0 a n d 1 7 . 0 0 h o u r s w i t h C a r p p i t u i t a r y s u s p e n s i o n a t a d o s e o f 6 m g / k g b o d y w e i g h t a n d a t a n i n d u c t i o n t e m p e r a t u r e o f 2 6 . 5 o C . A t o t a l o f f o u r f e m a l e C l a r i a s g a r i e p i n u s w e r e i n j e c t e d . A f t e r l a t e n c y p e r i o d o f a b o u t 1 0 h o u r s , o v u l a t e d e g g s w e r e r e m o v e d f r o m t h e i n d u c e d f e m a l e C l a r i a s g a r i e p i n u s i n t o d r y r e c e p t a c l e b y h a n d s t r i p p i n g . T h e s t r i p p e d e g g s w e r e t h o r o u g h l y m i x e d t o g e t h e r w i t h p l a s t i c s p o o n . T w o C l a r i a s g a r i e p i n u s m a l e s w e r e k i l l e d . M i l t e x t r a c t e d f r o m t h e s e m a l e s i n t o 0 . 9 % s o d i u m c h l o r i d e ( N a C l ) s a l i n e s o l u t i o n w e r e p o o l e d t o g e t h e r a n d u s e d i n f e r t i l i z i n g t h e C l a r i a s g a r i e p i n u s e g g s . F e r t i l i z a t i o n w a s e n h a n c e d b y a d d i t i o n o f f r e s h w a t e r t o t h e m i x t u r e o f e g g s a n d m i l t . P a r t o f t h e f e r t i l i z e d e g g s w a s i n c u b a t e d o n b u n c h e d s t r a n d s o f p o l y e t h y l e n e f i b e r s ( k a k a b a n ) p l a c e d i n t h e e x p e r i m e n t a l c o n t a i n e r s . p H T r e a t m e n t s : T h i r t y - t h r e e ( 3 3 ) p l a s t i c c o n t a i n e r o f 3 . 5 l i t r e v o l u m e w e r e u s e d f o r t h e s t u d y . 2 l i t e r s o f b o r e - h o l e t a p w a t e r w a s p o u r e d i n t o e a c h c o n t a i n e r . T o o b t a i n t h e r e q u i r e d p H v a l u e s , H c l w a s a d d e d d r o p w i s e ( f o r a c i d i t y ) o r C a o H s o l u t i o n a d d e d ( f o r a l k a l i n i t y ) w h i l e t h e v a l u e s w e r e r e a d u s i n g a p H m e t e r A T C p H m e t e r H I 8 9 1 5 ( A l a b a s t e r a n d L l o y d , 1 9 8 2 ) . T h e p H v a l u e s r a n g e d b e t w e e n 2 a n d 1 2 . S t o c k i n g o f E g g f o r I n c u b a t i o n a n d H a t c h i n g : T h e b o w l s w e r e s t o c k e d u n i f o r m l y w i t h 4 0 e g g s p e r b o w l f o r i n c u b a t i o n a n d h a t c h i n g . A l l e g g s w e r e e x p o s e d t o t h e r e l e v a n t p H i n t r i p l i c a t e a n d i n s t e p s o f o n e p H u n i t b y s u c c e s s i v e l y d e c r e a s i n g o r i n c r e a s i n g t h e p H l e v e l s . O f s e v e r a l p a r a m e t e r s t h o u g h t t o c o n t r i b u t e t o a c i d i t y a n d a l k a l i n i t y e f f e c t s o n e m b r y o n i c s t a g e o f f i s h e s , p H a k e y p a r a m e t e r w a s t e s t e d . I n p H t o l e r a n c e o f e m b r y o s , t h e f o l l o w i n g v a r i a b l e s w e r e e x a m i n e d , h a t c h i n g s u c c e s s a n d h a t c h i n g t i m e . H a t c h i n g s u c c e s s w a s 5 1 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 1 3 - 5 1 7 U z o k a e t a l . , 2 0 1 1

d e t e r m i n e d a s t h e n u m b e r o f s u c c e s s f u l l y h a t c h e d i n d i v i d u a l s p e r c o n t a i n e r . H a t c h i n g t i m e w a s c a l c u l a t e d a s t h e p e r i o d b e t w e e n f e r t i l i z a t i o n a n d t i m e o f h a t c h . W a t e r Q u a l i t y M o n i t o r i n g : W a t e r t e m p e r a t u r e r e c o r d s i n e a c h c o n t a i n e r w e r e t a k e n t w i c e d a i l y , m o r n i n g ( 8 . 0 0 a m - 9 . 0 0 a m ) a n d e v e n i n g ( 5 . 0 0 p m – 6 . 0 0 p m ) u s i n g m e r c u r y i n - t u b e t h e r m o m e t e r . D i s s o l v e d o x y g e n ( D . O ) c o n t e n t w a s d e t e r m i n e d u s i n g J e n w a y D . O . m e t e r ( M o d e l 3 0 5 0 , E n g l a n d ) . D i s s o l v e d o x y g e n ( D . O ) a n d p H m e a s u r e m e n t s w e r e o b s e r v e d e v e r y m o r n i n g ( 8 . 0 0 a m - 9 . 0 0 a m ) . D a t a A n a l y s i s : D a t a c o l l e c t e d o n H a t c h i n g S u c c e s s a n d H a t c h i n g t i m e w e r e s u b j e c t e d t o a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) a n d t h e t r e a t m e n t m e a n s w e r e s e p a r a t e d u s i n g L e a s t S i g n i f i c a n t D i f f e r e n c e ( L S D ) a t 5 % s i g n i f i c a n t l e v e l . R E S U L T S H a t c h i n g S u c c e s s a n d H a t c h i n g t i m e : T a b l e I s h o w s t h e h a t c h i n g s u c c e s s o f C l a r i a s g a r i e p n u s i n v a r i o u s i n c u b a t i o n p H r e g i m e s . T h e r e s u l t o f t h e h a t c h i n g s u c c e s s s h o w s a z e r o h a t c h i n g a t p H 2 . 0 , 3 . 0 , 1 1 . 0 a n d 1 2 . 0 . H a t c h i n g o c c u r r e d b e t w e e n p H 4 . 0 a n d p H 1 0 . 0 T h e o p t i m a l h a t c h i n g p H w a s a t p H 6 . 0 w i t h h a t c h a b i l i t y o f 7 5 % , t h e v a l u e s d r o p p e d t o w a r d s t h e e x t r e m e s o f t h e p H t r e a t m e n t s w i t h r e c o r d e d v a l u e s o f 3 2 % a n d 4 4 . 1 6 % f o r p H 4 . 0 a n d p H 1 0 . 0 r e s p e c t i v e l y ( T a b l e 1 ) . T h e o b s e r v a t i o n o f t h e c u m u l a t i v e h a t c h i n g t i m e o f C . g a r i e p i n u s s h o w e d d e l a y e d h a t c h i n g t i m e i n p H 4 . 0 p H 5 . 0 a n d p H 1 0 . 0 w h e n c o m p a r e d w i t h o t h e r p H t r e a t m e n t s . ( T a b l e 2 ) . W a t e r Q u a l i t y R e c o r d s : D i s s o l v e d o x y g e n c o n t e n t o f t h e m e d i u m w a s a p p r o x i m a t e l y 6 . 0 m g / l t h r o u g h o u t t h e s t u d y . T h e t e m p e r a t u r e a l s o r e m a i n e d a p p r o x i m a t e l y c o n s t a n t a t 2 6 . 5 o C . D I S C U S S I O N T h e s u r v i v a l r a t e o f 7 5 % a n d t h e r e s u l t i n g L C 5 0 a t p H 4 . 4 5 a n d a t p H 9 . 4 0 ( F i g . 1 ) i n d i c a t e a h i g h p H t o l e r a n c e o f C l a r i a s g a r i e p i n u s e g g s . T h i s r e s u l t c o l l a b o r a t e s w i t h t h a t o f W a r n e r e t a l 1 9 9 1 , A n d r e n e t a l 1 9 8 9 , o n h i g h p H t o l e r a n c e i n e m b r y o n i c s u r v i v a l o f f i s h e s a n d a m p h i b i a n s . M i l b r i n k a n d J o h a n s s o n ( 1 9 7 5 ) a l s o r e p o r t e d t h a t t h e v i a b i l i t y o f R o a c h ( R u t i l u s r u t i l u s ) a n d P e r c h ( P e r c a f l u v i a t i l i s ) e g g s k e p t i n n a t u r a l l a k e w a t e r s w i t h a r a n g e o f a c i d i t i e s w a s r e d u c e d a t l o w p H v a l u e s o f 5 . 5 a n d 4 . 7 . S i m i l a r s t u d i e s w i t h P i k e ( E s o x l u c i u s ) g a v e a c o r r e s p o n d i n g r e s u l t a t p H o f 5 . 0 . K w a i n ( 1 9 7 5 ) f o u n d t h a t n o R a i n b o w t r o u t e g g s s u r v i v e d a t p H v a l u e s o f l e s s t h a n 4 . 5 b u t t h a t t h e r e w a s r e a s o n a b l e s u r v i v a l a b o v e p H 5 . 0 . M e n e n d e z ( 1 9 7 6 ) a l s o f o u n d r e d u c e d v i a b i l i t y o f e g g s o f B r o o k t r o u t a t p H v a l u e s b e l o w 5 . 1 w i t h a l e v i n m o r t a l i t i e s o c c u r r i n g b e l o w 6 . 0 . A t h i g h p H v a l u e s , V o l o d i n ( 1 9 6 0 ) d i s c o v e r e d t h a t t h e m e d i a n l e t h a l p H w a s 8 . 0 b u t a t p H 9 . 0 h a t c h i n g w a s d e l a y e d . D e l a y e d h a t c h i n g o r l o n g e r e m b r y o n i c t i m e u n d e r l o w a n d h i g h p H c o n d i t i o n s p r e s u m a b l y r a i s e s t h e m o r t a l i t y r i s k i n t h e e m b r y o n i c s t a g e i n p a r t i c u l a r b y e g g p r e d a t o r s ( R o w e e t a l , 1 9 6 4 ) . M e a n w h i l e S w i n g l e ( 1 9 6 1 ) a n d C a l a b r a s e ( 1 9 6 9 ) h a v e a l r e a d y s t a t e d t h a t a c i d a n d a l k a l i n e d e a t h p o i n t s o f p H a r e a p p r o x i m a t e l y p H 4 a n d p H 1 1 r e s p e c t i v e l y . B e l o w p H 4 . 0 a n d p H 1 1 . 0 , h i g h e m b r y o n i c m o r t a l i t y o c c u r d u e t o a d e n a t u r a t i o n o f t h e h a t c h i n g e n z y m e a n d s u b s e q u e n t l y t o d e f o r m a t i o n s o f t h e e m b r y o ( U r c h a n d H e d r i c k 1 9 8 1 ) . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 7 : 5 1 3 - 5 1 7 5 1 5 U z o k a e t a l . , 2 0 1 1 p H R e g i m e M e a n n u m b e r i n c u b a t e d M e a n n u m b e r a t h a t c h M e a n % h a t c h 2 4 0 0 0 3 4 0 0 0 4 4 0 1 3 3 2 . 5 5 4 0 2 7 . 6 7 7 0 . 1 7 6 4 0 3 0 7 5 7 4 0 2 8 . 3 7 1 . 0 8 4 0 2 4 6 0 9 4 0 2 0 . 3 5 1 . 6 7 1 0 4 0 1 7 . 6 7 4 4 . 1 6 1 1 4 0 0 0 1 2 4 0 0 0 T a b l e 1 : H a t c h i n g s u c c e s s o f C . g a r i e p i n u s e g g s i n v a r i o u s i n c u b a t i o n p H . 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 0 2 4 6 8 1 0 1 2 p H M e a n % H a t c h F i g u r e 1 : M e a n P e r c e n t a g e H a t c h a g a i n s t p H