J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y I s o l a t i o n , s c r e e n i n g a n d i n d u c t i o n o f m u t a t i o n i n s t r a i n f o r e x t r a c e l l u l a r l i g n i n p e r o x i d a s e p r o d u c i n g b a c t e r i a f r o m s o i l a n d i t s p a r t i a l p u r i f i c a t i o n K e y w o r d s : L i g n i n , L P , B a c i l l u s s u b t i l i s a n d e n z y m e a c t i v i t y . A B S T R A C T : T h e L i g n i n p e r o x i d a s e e n z y m e p r o d u c t i o n w a s c a r r i e d o u t t h r o u g h b a c t e r i a i s o l a t e d f r o m s a m p l e s o i l c o l l e c t e d a r o u n d d e c a y e d w o o d a t S u l u r , C o i m b a t o r e . I n t h i s r e p o r t , a m u t a n t o f B a c i l l u s s u b t i l i s L P T K w a s o b t a i n e d a f t e r c h e m i c a l m u t a g e n e s i s w i t h E M S a n d s c r e e n e d f o r b e t t e r L i g n i n p e r o x i d a s e p r o d u c t i o n . I n t h e p r o d u c t i o n o p t i m i z a t i o n s t u d i e s , t h e b a c t e r i a l s t r a i n n e e d s t e m p e r a t u r e a r o u n d 3 7 O C , p H . 6 , l a c t o s e a s a c a r b o n s o u r c e , p e p t o n e a s n i t r o g e n s o u r c e a n d i n c u b a t i o n t i m e f o r 3 6 h o u r s f o r i t s h i g h e r e n z y m e p r o d u c t i v i t y . T h e p a r t i a l p u r i f i c a t i o n w a s a l s o d o n e . 3 1 2 - 3 1 8 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 5 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : R e n u g a d e v i R , A y y a p p a d a s M P , P r e e t h y P H a n d S a v e t h a S . I n s t i t u t i o n : A s s i s t a n t P r o f e s s o r s , D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y R V S C o l l e g e o f A r t s a n d S c i e n c e , S u l u r . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : R e n u g a d e v i R E m a i l : r e n u g a d e v i @ r v s g r o u p . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 8 5 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 1 7 A u g 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 2 7 A u g 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 1 2 S e p 2 0 1 1 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h P a p e r A r t i c l e C i t a t i o n : R e n u g a d e v i R , A y y a p p a d a s M P , P r e e t h y P H a n d S a v e t h a S . I s o l a t i o n , s c r e e n i n g a n d i n d u c t i o n o f m u t a t i o n i n s t r a i n f o r e x t r a c e l l u l a r l i g n i n p e r o x i d a s e p r o d u c i n g b a c t e r i a f r o m s o i l a n d i t s p a r t i a l p u r i f i c a t i o n J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 3 1 2 - 3 1 8

I n t r o d u c t i o n L i g n i n i s t h e m o s t a b u n d a n t r e n e w a b l e c a r b o n s o u r c e o n e a r t h ( B o Z h a n g e t a l . , 2 0 0 8 ) . W h e n p l a n t s d i e , i t w i l l r o t a n d d e g r a d e i n s o i l . R e s e a r c h e s a r e w i d e l y d o n e o n f u n g i w h i c h d e g r a d e l i g n i n . W h i l e b a c t e r i a g r o w a n d m u l t i p l y f a s t e r , i t i s a n t i c i p a t e d t o b e b e t t e r i n p r o d u c t i o n o f l i g n i n d e g r a d i n g e n z y m e s . T h e r e a r e m a n y t y p e s o f l i g n i n d e g r a d i n g e n z y m e s s u c h a s l i g n i n p e r o x i d a s e , m a n g a n a s e p e r o x i d a s e , l a c c a s e a n d g l y o x a l o x i d a s e a r e p r o d u c e d b y f u n g i a s w e l l a s b a c t e r i a s u c h a s l i g n i n p e r o x i d a s e b y t h e b a c t e r i a S t r e p t o m y c e s v i r i d o s p o r u s ( R a m a c h a n d r a e t a l . , 1 9 8 7 ) . L i g n i n p e r o x i d a s e i s a n e n z y m e t h a t i s u s e d t o d e g r a d e l i g n i n . I t w a s f i r s t d i s c o v e r e d i n 1 9 8 3 . L i g n i n p e r o x i d a s e s a r e p r o d u c e d b y m a n y w o o d d e g r a d i n g f u n g i a s a f a m i l y o f i s o e n z y m e s ( K i r k a n d F a r r e l l , 1 9 8 7 ) . R e c e n t r e s e a r c h e s a l s o s h o w e d t h a t i t c a n b e p r o d u c e d f r o m b a c t e r i a s u c h a s S t r e p t o m y c e s v i r i d o s p o r u s . T h e s e h e m e p r o t e i n s a r e s i m i l a r t o t h e m o r e f a m i l i a r p l a n t p e r o x i d a s e s i n s t r u c t u r e a n d m e c h a n i s m , a n d u t i l i z e h y d r o g e n p e r o x i d e a n d o r g a n i c p e r o x i d e s t o o x i d i z e a v a r i e t y o f s u b s t r a t e s ( T i e n e t a l . , 1 9 8 5 , 1 9 8 6 ) . S o m e o f t h e m o s t i m p o r t a n t f e a t u r e s d i s t i n g u i s h i n g t h e s e e n z y m e s f r o m o t h e r o x i d o r e d u c t a s e s ( s u c h a s h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ) , f o r e x a m p l e , a r e t h e i r v e r y l o w p H o p t i m a a n d m u c h h i g h e r r e d o x p o t e n t i a l s . T h e s u b s t r a t e s o f l i g n i n p e r o x i d a s e i n c l u d e b o t h p h e n o l i c a n d n o n - p h e n o l i c a r o m a t i c c o m p o u n d s ; t h e p h e n o l i c s u b s t r a t e s a r e o x i d i z e d t o y i e l d p r o d u c t s s i m i l a r t o t h o s e p r o d u c e d b y c l a s s i c a l p e r o x i d a s e s , w h i l e t h e o x i d a t i o n o f t h e n o n - p h e n o l i c m e t h o x y b e n z e n e s a r e u n i q u e t o t h e l i g n i n p e r o x i d a s e s ( K o r s t e n L a n d C o o k N , 1 9 9 6 ) , t h e o x i d a t i o n o f t h e s e s u b s t r a t e s y i e l d a r y l c a t i o n r a d i c a l s . L i g n i n p e r o x i d a s e c a n c a t a l y z e t h e o x i d a t i o n o f s u b s t r a t e s w i t h a r e d u c t i o n p o t e n t i a l g r e a t e r t h a n 1 . 3 v o l t s . T h e e n z y m e i s c a p a b l e t o o x i d i z i n g l i g n i n m o n o m e r s , d i m e r s a n d t r i m e r s a s w e l l a s p o l y c y c l i c a r o m a t i c c o m p o u n d s s u c h a s b e n z o p y r e n e ( H a e m m e r l i e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e p o w e r f u l a n d r e l a t i v e l y n o n - s p e c i f i c n a t u r e o f t h i s e n z y m e h a s l e a d t o t h e i n v e s t i g a t i o n o f i t s p o t e n t i a l u s e i n d i v e r s e f i e l d s o f b i o d e g r a d a t i o n o f t o x i c c h e m i c a l s , p u l p , p a p e r p r o c e s s i n g , a n d i n t h e t e x t i l e i n d u s t r y . M E T H O D S A N D M A T E R I A L S S a m p l e C o l l e c t i o n a n d I s o l a t i o n o f B a c t e r i a T h e s a m p l e s o i l w a s c o l l e c t e d a r o u n d d e c a y e d w o o d a t S u l u r , C o i m b a t o r e i n a s t e r i l e c o n t a i n e r . T h e c o l l e c t e d s a m p l e w a s s e r i a l l y d i l u t e d u p t o 1 0 7 d i l u t i o n s u s i n g s t e r i l e s a l i n e a s a b l a n k a n d t h e d i l u t e d s a m p l e s w e r e p l a t e d i n t o t h e s t e r i l e n u t r i e n t a g a r u s i n g s p r e a d p l a t e m e t h o d . T h e n u t r i e n t a g a r p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 2 4 h o u r s . T h e i s o l a t e d c o l o n i e s w e r e f u r t h e r p u r i f i e d b y s t r e a k p l a t e m e t h o d u s i n g s t e r i l e m e d i a p l a t e s . T h e p u r e c u l t u r e s w e r e i n o c u l a t e d i n t o s t e r i l e n u t r i e n t a g a r s l a n t s a n d n u t r i e n t b r o t h f o r f u r t h e r u s e . S c r e e n i n g f o r t h e E n z y m e P r o d u c t i o n T h e i s o l a t e d p u r e s t r a i n s w e r e s c r e e n e d f o r t h e p r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r l i g n i n p e r o x i d a s e u s i n g s c r e e n i n g m e d i u m w h i c h c o n t a i n s l i g n i n a s a s u b s t r a t e ( Y e o h T e i k L o o n e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e p u r e c u l t u r e s w e r e s t r e a k e d a t t h e l i g n i n a g a r p l a t e s a n d t h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 2 4 h o u r s . T h e o b s e r v a t i o n w a s m a d e t o s e e t h e s u b s t r a t e u t i l i z e d z o n e a r o u n d t h e c o l o n y . O n l y t h e s t r a i n s h o w i n g p o s i t i v e a n d b e t t e r z o n e w a s t a k e n f o r f u r t h e r s t u d y . S t r a i n I m p r o v e m e n t b y M u t a t i o n T h e c h e m i c a l m u t a g e n e s i s w a s c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o K o t c h o n i a n d D . B a r t e l s ( 2 0 0 3 ) . E t h y l m e t h a n e s u l p h o n a t e ( E M S ) w a s u s e d a s t h e m u t a g e n i c a g e n t . T h e b e t t e r z o n e f o r m e d s t r a i n w a s g r o w n t o m i d l o g a r i t h m i c p h a s e o f g r o w t h i n L B b r o t h a n d f r o m t h a t c e l l s w e r e c e n t r i f u g e d a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e p e l l e t w a s r e - s u s p e n d e d i n n o r m a l s a l i n e a n d a s u s p e n s i o n o f ( v / v ) o f E M S w a s m a d e . A p p r o p r i a t e d i l u t i o n s w e r e m a d e a n d i n c u b a t e d o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e t o a l l o w m u t a t i o n a l s e g r e g a t i o n . T h e c u l t u r e w a s t h e n s p r e a d o n a g a r m e d i a a n d i n c u b a t e d o v e r n i g h t a t 3 7 ° C . S i n g l e m u t a n t c l o n e s w e r e f u r t h e r g r o w n i n n e w p l a t e s t i l l t h e t h i r d g e n e r a t i o n . T h e t h i r d g e n e r a t i o n s ( M 3 ) o f t h e m u t a n t s w e r e r e p l i c a - p l a t e d i n n u t r i e n t a g a r p l a t e s . T h e w i l d a n d m u t a n t s t r a i n w a s s c r e e n e d a g a i n u s i n g l i g n i n s c r e e n i n g m e d i u m . T h e s e l e c t i o n o f m u t a n t s w a s b a s e d o n t h e d i a m e t e r o f t h e c l e a r z o n e s u r r o u n d i n g t h e c o l o n i e s . E n z y m e P r o d u c t i o n P r e p a r a t i o n o f I n o c u l u m T h e i n o c u l u m f o r f u r t h e r p r o d u c t i o n o f e n z y m e a n d o t h e r s t u d i e s w a s p r e p a r e d u s i n g L u r i a b r o t h ( Z o l t a ´ n P r a ´ G a i , 2 0 0 2 ) . T h e p u r e c u l t u r e w a s i n o c u l a t e d i n t o s t e r i l e i n o c u l u m b r o t h a n d w a s i n c u b a t e d a t 3 7 ° C i n a r o t a r y s h a k e r f o r o v e r n i g h t . T h e f r e s h o v e r n i g h t c u l t u r e w a s u s e d a s i n o c u l u m f o r t h e p r o d u c t i o n o f e n z y m e . P r o d u c t i o n T h e e n z y m e p r o d u c t i o n w a s c a r r i e d o u t b y s h a k e f l a s k f e r m e n t a t i o n u s i n g p r o d u c t i o n m e d i u m w i t h p H 8 . T h e i n o c u l a t e d m e d i u m w a s i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 4 8 h o u r s . T h e m e d i u m w a s a g i t a t e d a t 3 1 3 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 5 : 3 1 2 - 3 1 8 R e n u g a d e v i e t a l . , 2 0 1 1

2 0 0 r p m f o r b e t t e r a e r a t i o n a n d g r o w t h o f t h e o r g a n i s m . L i g n i n p e r o x i d a s e A s s a y B a c t e r i a l c r u d e c u l t u r e p r e p r a t i o n A l i q u o t s o f 1 0 m l o f t h e c u l t u r e s u s p e n s i o n w e r e c e n t r i f u g e d a t 5 0 0 0 r p m f o r 1 5 m i n u t e s a n d c e l l f r e e e x t r a c t w a s s u b j e c t e d t o e n z y m e a s s a y . T h e e x t r a c t w a s s t o r e d a t 4 ° C f o r f u r t h e r a n a l y s i s . P l a t e A s s a y T h e p l a t e a s s a y w a s p e r f o r m e d u s i n g a g a r p l a t e s a m e n d e d w i t h L i g n i n . T h e a g a r p l a t e s w e r e p r e p a r e d b y m i x i n g o f 1 % L i g n i n w i t h 1 . 7 % a g a r . A f t e r s o l i d i f i c a t i o n o f a g a r , a r o u n d 1 0 m m d i a m e t e r s o f w e l l s w e r e c u t o u t a s e p t i c a l l y w i t h t h e h e l p o f c o r k - b o r e r . T h e w e l l w a s f i l l e d w i t h t h e c u l t u r e f i l t r a t e a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r o v e r n i g h t . T h e o b s e r v a t i o n w a s m a d e t o s e e t h e h y d r o l y t i c z o n e a r o u n d t h e w e l l s . T w o w e l l s w e r e f i l l e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d p r o d u c t i o n m e d i u m w i t h o u t c u l t u r e a c t s a s a c o n t r o l ( Y e o h T e i k L o o n e t a l . , 2 0 0 6 ) C h e m i c a l A s s a y L i g n i n p e r o x i d a s e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d b y e s t i m a t i n g t h e r e d u c i n g s u g a r p r o d u c e d d u r i n g e n z y m a t i c r e a c t i o n b y d i n i t r o s a l i c y l i c a c i d m e t h o d . A s s a y f o r l i g n i n p e r o x i d a s e w e r e p e r f o r m e d u s i n g s u b s t r a t e c o m p o s e d o f a l k a l i n e l i g n i n d i s s o l v e d i n 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r w i t h p H o f 7 . 0 . A f t e r i n c u b a t i o n a t 3 3 ° C f o r 2 4 h o u r s , t h e b r o t h i s t r a n s f e r r e d f o r c e n t r i f u g a t i o n . C e n t r i f u g a t i o n w a s d o n e f o r 5 m i n u t e s . T h e s u p e r n a t a n t o b t a i n e d w a s u s e d a s a c r u d e e n z y m e . T h e c r u d e e n z y m e w a s i n c u b a t e d w i t h s u b s t r a t e a t 3 3 ° C . T h e r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e t e s t e d f o r i t s s i m p l e s u g a r u s i n g D N S m e t h o d . E s t i m a t i o n o f T o t a l P r o t e i n T h e c h e m i c a l a s s a y f o r t h e t o t a l p r o t e i n c o n t e n t f r o m t h e s a m p l e w a s d e t e r m i n e d u s i n g B r a d f o r d m e t h o d ( B r a d f o r d , 1 9 7 6 ) . T o t h e c u l t u r e f i l t r a t e B r a d f o r d r e a g e n t w a s a d d e d . T h e t u b e w a s g e n t l y t i l t e d o n c e f o r m i x i n g a n d t h e a b s o r b e n c y w a s t a k e n a t 5 9 5 n m i n U V - V I S s p e c t r o p h o t o m e t e r . T h e b l a n k w a s p r e p a r e d b y m i x i n g d i s t i l l e d w a t e r r e a g e n t . T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d b y c o m p a r i n g t h e v a l u e w i t h s t a n d a r d g r a p h p r e p a r e d u s i n g B o v i n e s e r u m a l b u m i n . P A R A M E T E R O P T I M I S A T I O N S T U D I E S E f f e c t o f i n c u b a t i o n t i m e o n l i g n i n p e r o x i d a s e p r o d u c t i o n A r o u n d 5 0 0 m l o f s t e r i l e p r o d u c t i o n m e d i u m f o r b a c t e r i a l w e r e p r e p a r e d a n d 5 % b a c t e r i a l i n o c u l u m w a s a d d e d a s e p t i c a l l y . T h e i n o c u l a t e d m e d i u m w a s i n c u b a t e d a t 3 7 ° C t e m p e r a t u r e w i t h s h a k i n g a r o u n d 1 5 0 r p m . A f t e r i n c u b a t i o n , a r o u n d 2 0 m l o f c u l t u r e w a s a s e p t i c a l l y w i t h d r a w n p e r i o d i c a l l y a t 6 h o u r s i n t e r v a l s u p t o 4 8 h o u r s . T h e c u l t u r e f i l t r a t e w a s t e s t e d f o r t h e t o t a l p r o t e i n c o n t e n t a n d l i g n i n p e r o x i d a s e a c t i v i t y ( T u n c e r e t a l , 2 0 0 4 ) . T e m p e r a t u r e H u n d r e d m l o f s t e r i l e p r o d u c t i o n m e d i u m f o r b a c t e r i a w a s p r e p a r e d i n d i f f e r e n t c o n i c a l f l a s k a t p H 8 . 0 a n d i n o c u l a t e d w i t h 5 % i n o c u l u m . E a c h f l a s k w a s i n c u b a t e d a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s s u c h a s 2 8 ° C , 3 2 ° C , 3 7 ° C , 4 2 ° C , 4 7 ° C , a n d 5 2 ° C f o r 3 6 h o u r s . T h e p r o t e i n e s t i m a t i o n a n d e n z y m e a c t i v i t y w e r e e s t i m a t e d f o l l o w e d b y T u n c e r e t a l ( 2 0 0 4 ) . p H H u n d r e d m l o f s t e r i l e p r o d u c t i o n m e d i u m w a s p r e p a r e d f o r b a c t e r i a l s t r a i n i n d i f f e r e n t c o n i c a l f l a s k s a n d e a c h f l a s k w a s a d j u s t e d t o d i f f e r e n t p H s u c h a s 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 u s i n g 0 . 1 N N a O H a n d 0 . 1 N H C l . A f t e r s t e r i l i z a t i o n , f l a s k s w e r e i n o c u l a t e d w i t h 5 % i n o c u l u m . T h e f l a s k s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 º C f o r 3 6 h o u r s . T h e p r o t e i n e s t i m a t i o n a n d e n z y m e a c t i v i t y w e r e e s t i m a t e d ( T u n c e r e t a l , 2 0 0 4 ) . C a r b o n S o u r c e s H u n d r e d m l o f s t e r i l e p r o d u c t i o n m e d i u m ( p H . 6 ) f o r b a c t e r i a w a s p r e p a r e d i n d i f f e r e n t c o n i c a l f l a s k s . E a c h f l a s k w a s a m e n d e d w i t h d i f f e r e n t c a r b o n s o u r c e s s u c h a s G l u c o s e , F r u c t o s e , M a l t o s e , L a c t o s e , S u c r o s e a n d M a n n i t o l . T h e f l a s k s w e r e i n o c u l a t e d w i t h 5 % i n o c u l u m a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 3 6 h o u r s . T h e c u l t u r e f i l t r a t e w a s c o l l e c t e d f o r p r o t e i n e s t i m a t i o n a n d e n z y m e a c t i v i t y ( T u n c e r e t a l , 2 0 0 4 ) . N i t r o g e n s o u r c e H u n d r e d m l o f s t e r i l e p r o d u c t i o n m e d i a f o r b a c t e r i a ( p H 6 ) w a s p r e p a r e d i n d i f f e r e n t c o n i c a l f l a s k s . E a c h f l a s k w a s a m e n d e d w i t h d i f f e r e n t n i t r o g e n s o u r c e s s u c h a s B e e f e x t r a c t , C a s e i n , P e p t o n e , G e l a t i n , A m m o n i u m c h l o r i d e , A m m o n i u m s u l p h a t e a n d P o t a s s i u m n i t r a t e . T h e f l a s k s c o n t a i n i n g b a c t e r i a l m e d i u m w e r e i n o c u l a t e d w i t h 5 % i n o c u l u m a n d i n c u b a t e d a t 3 7 º C f o r 3 6 h o u r s . T h e c u l t u r e f i l t r a t e w a s c o l l e c t e d f o r P r o t e i n e s t i m a t i o n a n d E n z y m e a c t i v i t y ( T u n c e r e t a l , 2 0 0 4 ) . P a r t i a l P u r i f i c a t i o n A m m o n i u m S u l p h a t e F r a c t i o n a t i o n o f P r o t e i n s T h e e n z y m e s e p a r a t i o n f r o m t h e e x h a u s t e d m e d i u m w a s d o n e b y 7 0 % A m m o n i u m s u l p h a t e s a t u r a t i o n ( E l b a e t a l , 1 9 9 9 ) . T h e m i x t u r e w a s t h e n J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 5 : 3 1 2 - 3 1 8 3 1 4 R e n u g a d e v i e t a l . , 2 0 1 1

s t o r e d i n a c o l d r o o m f o r 2 4 h o u r s t o p r e c i p i t a t e a l l t h e p r o t e i n s a n d t h e p r e c i p i t a t i o n w a s s e p a r a t e d b y c e n t r i f u g a t i o n f o r 1 0 m i n u t e s . T h e s u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d a n d t h e r e m a i n i n g p r e c i p i t a t e w a s d i s s o l v e d w i t h 5 m l o f 1 M - c i t r a t e p h o s p h a t e b u f f e r ( p H . 8 ) . T h e n t h e m i x t u r e w a s s u b j e c t e d t o d i a l y s i s . D i a l y s i s T h e p u r p o s e o f d i a l y s i s i s t o r e m o v e u n d e s i r e d s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t m o l e c u l e s f r o m a m i x t u r e i n w h i c h t h e d e s i r e d s p e c i e s o f m o l e c u l e s a r e t o o l a r g e t o t r a v e l a c r o s s t h e m e m b r a n e . O r d i n a r i l y t h i s p r o c e s s i s u t i l i z e d d u r i n g p r o t e i n p u r i f i c a t i o n i n w h i c h s a l t i n g o u t p r o c e d u r e h a s b e e n e m p l o y e d a s t h e i n i t i a l s t e p w i t h a m m o n i u m s u l p h a t e . A f t e r t h e p r o t e i n i s p r e c i p i t a t e d f r o m t h e i n i t i a l s o u r c e , i t i s r e - d i s s o l v e d i n b u f f e r a n d t h e n p o u r e d i n t o a d i a l y s i s b a g . R E S U L T S N a t u r a l l y o c c u r r i n g m i c r o o r g a n i s m s a r e h a v i n g t h e a b i l i t y t o p r o d u c e v a r i o u s e n z y m e s . N o w a d a y s m o s t o f t h e e n z y m e s a r e i m p o r t a n t f o r h u m a n w e l f a r e a n d i n d u s t r y . I n t h i s s t u d y , t h e b a c t e r i a l s t r a i n s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e s a m p l e s o i l a t S u l u r a r e a , C o i m b a t o r e b e c a u s e m o s t o f t h e n a t u r a l w a s t e s a r e d e g r a d e d b y t h e n a t i v e m i c r o b e s t h a t a r e g r o w i n g o v e r t h a t w a s t e . I n s u c h a w a y , i t i s f a c t t h a t t h e m i c r o b e s w h i c h a r e i s o l a t e d f r o m d e c a y e d w o o d s o i l m a y h a v e a b i l i t y t o p r o d u c e l i g n i n p e r o x i d a s e . F r o m t h e s a m p l e s , a r o u n d 1 5 b a c t e r i a l s t r a i n s w e r e i s o l a t e d a n d s c r e e n e d ; i t w a s f o u n d t h a t f o u r b a c t e r i a l s t r a i n s s h o w e d p o s i t i v e r e s u l t s o n l i g n i n p e r o x i d a s e p r o d u c t i o n . T h e b e t t e r z o n e f o r m e d b a c t e r i a l s t r a i n w a s c o n s i d e r e d f o r f u r t h e r s t r a i n i m p r o v e m e n t s t u d y . S t r a i n i m p r o v e m e n t w a s d o n e b y K o t c h o n i a n d S h o n u k a n ( 2 0 0 2 ) m e t h o d . I n t h i s e x p e r i m e n t t h e b e t t e r p o s i t i v e s t r a i n f o r l i g n i n p e r o x i d a s e w a s t r e a t e d w i t h E t h y l m e t h a n e s u l p h o n a t e a n d t h e M 3 g e n e r a t i o n m u t a n t s t r a i n p r o d u c e d m u c h b e t t e r y e l l o w z o n e t h e n c o m p a r e d t o w i l d s t r a i n . T h i s s t r a i n w a s u s e d f o r f u r t h e r s t u d i e s . I n p l a t e a s s a y t h e l i g n i n p e r o x i d a s e a c t i v i t y w a s i d e n t i f i e d b y a c l e a r z o n e w h e n c o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l a n d t h e c h e m i c a l a s s a y d e t e r m i n e d b y D N S A ( 3 , 5 - d i n i t r o s a l i c y l i c a c i d ) m e t h o d u s i n g s t a r c h a s a s u b s t r a t e . E f f e c t o f T i m e T h e g r o w t h s t u d y o f t h e o r g a n i s m i s e s s e n t i a l f o r t h e p r o d u c t i o n o f e n z y m e b e c a u s e m o s t o f t h e e x t r a c e l l u l a r e n z y m e s a r e p r o d u c e d d u r i n g l o g p h a s e o f t h e o r g a n i s m s . G e n e r a l l y d u r i n g g r o w t h , t h e b i o m a s s o f t h e c e l l s w a s e s t i m a t e d . T h e c u l t u r e w a s w i t h d r a w n f o r e n z y m e a c t i v i t y . T h e b a c t e r i a l c u l t u r e s w e r e w i t h d r a w n o n c e i n e v e r y s i x h o u r s . T h e r e s u l t s r e v e a l e d t h a t t h e r e i s g r a d u a l i n c r e a s i n g o f p r o d u c t i o n h a s o c c u r r e d f r o m 1 8 t h h o u r t o 3 6 t h h o u r s a n d h i g h e r p r o d u c t i o n h a s o c c u r r e d a t 3 6 t h h o u r s ( T a b l e . 1 ) . T h i s s h o w s t h a t b a c t e r i a l i s o l a t e s h o u l d h a v e m a i n t a i n e d i t s l o g p h a s e f r o m a r o u n d 1 8 t h h o u r t o 3 6 t h h o u r . B e s i d e s , i t i s b e l i e v e d t h a t t h e h i g h e r p r o d u c t i o n o f l i g n i n p e r o x i d a s e h a s o c c u r r e d i n e x t r e m e l o g p h a s e b e c a u s e e v e n t h o u g h t h e l o g p h a s e w a s m a i n t a i n e d a r o u n d 1 8 t h t o 3 6 h o u r s , t h e f o l l o w e d d r o p o f p r o d u c t i o n h a s i n d i c a t e d t h a t t h e o r g a n i s m s h o u l d h a v e e n t e r e d i n t o s t a t i o n a r y p h a s e o f g r o w t h ( F i g 1 ) . E f f e c t o f T e m p e r a t u r e T h e e n v i r o n m e n t a l p a r a m e t e r s a r e s h o w i n g g r e a t i n f l u e n c e i n t h e g r o w t h o f t h e o r g a n i s m s a n d t h e p r o d u c t i o n o f e n z y m e s . T h e o p t i m u m t e m p e r a t u r e f o r t h e b e t t e r p r o d u c t i o n w a s m a d e i n v a r i o u s t e m p e r a t u r e s . I t w a s f o u n d t h a t l i k e o t h e r m e s o p h i l i c o r g a n i s m s , t h e h i g h e r l i g n i n p e r o x i d a s e a c t i v i t y w a s f o u n d ( 4 1 U / m l ) a t 3 7 º C f r o m b a c t e r i a ( T a b l e . 2 ) . T h e s e i n d i c a t e t h a t t h e o p t i m u m t e m p e r a t u r e s f o r b e t t e r p r o d u c t i o n o f b a c t e r i a l i s o l a t e s a r e 3 7 º C ( F i g . 2 ) . T h e t e m p e r a t u r e r e q u i r e m e n t o f t h e o r g a n i s m i s b a s e d o n t h e n a t u r e o f o r g a n i s m s . M a n y t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a l i k e C l o s t r i d i u m s p . n e e d s 5 5 º C f o r b e t t e r p r o d u c t i o n o f l i g n i n p e r o x i d a s e ( T u n c e r e t a l , 2 0 0 4 ) . E f f e c t o f p H T h e p H i s t h e i m p o r t a n t p a r a m e t e r w h i c h d e t e r m i n e s t h e g r o w t h o f t h e o r g a n i s m a n d l i g n i n p e r o x i d a s e p r o d u c t i o n . T h e s t u d y r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e o p t i m u m p H a r o u n d s i x i s b e t t e r f o r b a c t e r i a l i s o l a t e ( T a b l e . 3 & F i g . 3 ) . L i k e 3 1 5 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 5 : 3 1 2 - 3 1 8 R e n u g a d e v i e t a l . , 2 0 1 1 F i g u r e 1 . E n z y m e p r o d u c t i o n a n d t o t a l p r o t e i n c o n t e n t o f b a c t e r i a l i s o l a t e a t d i f f e r e n t i n c u b a t i o n t i m e

t e m p e r a t u r e , d i f f e r e n t o r g a n i s m s n e e d d i f f e r e n t p H r a n g e s f o r i t s l i g n i n p e r o x i d a s e p r o d u c t i o n . T h e T h e r m o p h i l i c b a c t e r i u m h a s p r o d u c e d h i g h a m o u n t o f l i g n i n p e r o x i d a s e b e t w e e n p H 4 - 6 ( T u n c e r e t a l , 2 0 0 4 ) . E f f e c t o f C a r b o n s o u r c e T h e c a r b o h y d r a t e s a r e s o u l e n e r g y s o u r c e f o r m o s t o f t h e h e t e r o t r o p h i c o r g a n i s m s . T h e s e s h o w s g r e a t i n f l u e n c e o n t h e p r o d u c t i o n o f m a n y e n z y m e s . I n t h i s s t u d y , l a c t o s e w a s f o u n d t o b e a r i g h t c a r b o n s o u r c e f o r b a c t e r i a l s t r a i n f o r h i g h e r p r o d u c t i o n o f l i g n i n p e r o x i d a s e ( T a b l e . 4 & F i g . 4 ) . L i g n i n p e r o x i d a s e p r o d u c t i o n w i l l b e l o w i n t h e m e d i u m a m e n d e d w i t h g l u c o s e , f r u c t o s e , m a l t o s e , s u c r o s e a n d m a n n i t o l w h e n c o m p a r e t o l a c t o s e ( T u n c e r e t a l , 2 0 0 4 ) . E f f e c t o f N i t r o g e n s o u r c e T h e n i t r o g e n s o u r c e s a r e o f s e c o n d a r y e n e r g y s o u r c e s f o r t h e o r g a n i s m s , w h i c h p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e g r o w t h o f t h e o r g a n i s m a n d t h e p r o d u c t i o n . T h e n a t u r e o f t h e c o m p o u n d a n d t h e c o n c e n t r a t i o n t h a t w e a r e u s i n g m a y s t i m u l a t e o r d o w n m o d u l a t e t h e p r o d u c t i o n o f e n z y m e s . T h e n i t r o g e n s o u r c e s a r e o f s e c o n d a r y e n e r g y s o u r c e s f o r t h e o r g a n i s m s , w h i c h p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e g r o w t h o f t h e o r g a n i s m a n d t h e p r o d u c t i o n ( T a b l e . 5 & F i g . 5 ) . D I S C U S S I O N T h e L i g n i n p e r o x i d a s e e n z y m e p r o d u c t i o n w a s c a r r i e d o u t t h r o u g h b a c t e r i a i s o l a t e d f r o m s a m p l e s o i l c o l l e c t e d a r o u n d d e c a y e d w o o d a t S u l u r . T r i c h o d e r m a h a r z i a n u m i s o l a t e s ( D 1 / 4 ) p r o v e d t o b e t h e h i g h e s t p r o d u c e r f o r t h e t w o e n z y m e s s u c h a s 1 6 0 % a n d 1 8 6 % o f C M C a s e a n d β J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 5 : 3 1 2 - 3 1 8 3 1 6 R e n u g a d e v i e t a l . , 2 0 1 1 S . N O T e m p e r a t u r e ( º C ) T o t a l p r o t e i n c o n t e n t ( μ g / m l ) E n z y m e a c t i v i t y ( U / m l ) 1 2 8 4 9 1 5 2 3 2 5 0 2 0 3 3 7 5 2 4 1 4 4 2 4 0 2 6 5 4 7 3 1 1 2 6 5 2 2 8 4 T a b l e . 2 E f f e c t o f T e m p e r a t u r e o n t o t a l p r o t e i n a n d e n z y m e p r o d u c t i o n b y b a c t e r i a l i s o l a t e S . N O p H T o t a l p r o t e i n c o n t e n t ( μ g / m l ) E n z y m e a c t i v i t y ( U / m l ) 1 4 9 4 2 5 3 1 2 1 3 6 7 3 4 1 4 7 9 2 3 3 5 8 7 0 1 5 6 9 6 2 1 2 T a b l e . 3 E f f e c t o f p H o n t o t a l p r o t e i n a n d e n z y m e p r o d u c t i o n o f b a c t e r i a l i s o l a t e F i g u r e 2 . E f f e c t o f T e m p e r a t u r e o n t o t a l p r o t e i n a n d e n z y m e p r o d u c t i o n b y b a c t e r i a l i s o l a t e F i g u r e . 3 E f f e c t o f p H o n t o t a l p r o t e i n a n d e n z y m e p r o d u c t i o n o f b a c t e r i a l i s o l a t e S . N o C a r b o n s o u r c e s B a c t e r i a T o t a l p r o t e i n c o n t e n t ( μ g / m l ) E n z y m e a c t i v i t y ( U / m l ) 1 G l u c o s e 4 8 6 2 F r u c t o s e 5 7 1 8 3 M a l t o s e 3 8 9 4 L a c t o s e 8 6 3 1 5 S u c r o s e 5 1 1 5 6 M a n n i t o l 4 7 1 0 T a b l e . 4 E n z y m e p r o d u c t i o n a n d t o t a l p r o t e i n o d u c t i o n o n d i f f e r e n t c a r b o n s o u r c e s

- g l u c o s i d a s e r e s p e c t i v e l y , m o r e t h a n t h e o r i g i n a l s t r a i n ( A h m e d M . E l - B o n d k l y e t a l . , 2 0 1 0 ) . I n t h i s r e p o r t , a m u t a n t o f B a c i l l u s s u b t i l i s L P T K w a s o b t a i n e d a f t e r c h e m i c a l m u t a g e n e s i s w i t h E M S a n d s c r e e n e d f o r b e t t e r L i g n i n p e r o x i d a s e p r o d u c t i o n . T h e e f f e c t o f c a r b o n a n d n i t r o g e n s o u r c e s o n l i g n i n p e r o x i d a s e ( L i P ) a c t i v i t y o f A s p e r g i l l u s s p . , s h o w e d t h a t g l u c o s e ( 1 % ) a n d a m m o n i u m s u l p h a t e w e r e t h e b e s t c a r b o n a n d n i t r o g e n s o u r c e s ( A h a m m e d S a n d P r e m a P , 2 0 0 2 ) . I n t h e p r o d u c t i o n o p t i m i z a t i o n s t u d i e s , t h e b a c t e r i a l s t r a i n n e e d s t e m p e r a t u r e a r o u n d 3 7 O C , p H . 6 , l a c t o s e a s a c a r b o n s o u r c e , p e p t o n e a s n i t r o g e n s o u r c e a n d i n c u b a t i o n t i m e f o r 3 6 h o u r s f o r i t s h i g h e r e n z y m e p r o d u c t i v i t y . R E F E R E N C E S A h a m m e d S a n d P r e m a P . 2 0 0 2 . I n f l u e n c e o f m e d i a n u t r i e n t s o n s y n t h e s i s o f l i g n i n p e r o x i d a s e f r o m A s p e r g i l l u s s p . , A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l , 1 0 2 - 1 0 3 ( 1 - 6 ) : 3 2 7 - 3 6 . A h m e d M . E l - B o n d k l y A A M , A b o s h o s h a N H . R a d w a n a n d D o r a S A . 2 0 1 0 . S u c c e s s i v e C o n s t r u c t i o n o f β - G l u c o s i d a s e H y p e r p r o d u c e r s o f T r i c h o d e r m a H a r z i a n u m U s i n g M i c r o b i a l B i o t e c h n o l o g y T e c h n i q u e s , J . M i c r o b i a l & B i o m e d i c a l T e c h n o l o g y 2 : 0 7 0 - 0 7 3 . B r a d f o r d M M . 1 9 7 6 . A r a p i d a n d s e n s i t i v e f o r t h e q u a n t i z a t i o n o f m i c r o g r a m q u a n t i t i e s o f p r o t e i n u t i l i z i n g t h e p r i n c i p l e o f p r o t e i n - d y e b i n d i n g . A n a l y t i c a l B i o c h e m i s t r y 7 2 : 2 4 8 - 2 5 4 . B o Z h a n g , H u a - J i a n g H u a n g a n d S h r i R a m a s w a m y . 2 0 0 8 . R e a c t i o n K i n e t i c s o f t h e H y d r o t h e r m a l T r e a t m e n t o f L i g n i n , J . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 1 4 7 : 1 1 9 - 1 3 1 . E l b a P S . B o n , H i l t o n J N a s e c i m e n t o , j a c y a r a M , B M a c e d o a n d J o s e G , s i l v a J r . 1 9 9 9 . L i g n i n p e r o x i d a s e i s o f o r m s f r o m s t r e p t o m y c e s v i r i d o s p o r u s T 7 A : a r e t h e y a m o n o m e r b a s e d s t r u c t u r e , B i o t e c h n o l o g y T e c h n i q u e s 1 3 : 2 8 9 - 2 9 3 . H a e m m e r l i S D , L e i l o s a M S A , S a n g l a r d D a n d F i e c h t e r A . 1 9 9 6 . O x i d a t i o n o f b e n z o ( a ) p y r e n e b y e x t r a c e l l u l a r l i g n i n a s e s o f p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s s p o r i u m : v e r a t y l a l c o h o l a n d s t a b i l i t y o f l i g n i n a s e s , J . B i o c h e m , 2 6 1 : 6 9 0 0 - 6 9 0 3 . K i r k T K a n d F a r r e l l . 1 9 8 7 . E n z y m a t i c c o m b u s t i o n : t h e m i c r o b i a l d e g r a d a t i o n o f l i g n i n , a n n , E R v , M i c r o b i o l , 4 1 : 4 6 5 - 5 0 5 . K o r s t e n L a n d C o o k N . 1 9 9 6 . O p t i m i z i n g 3 1 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 5 : 3 1 2 - 3 1 8 R e n u g a d e v i e t a l . , 2 0 1 1 S . N o N i t r o g e n s o u r c e s B a c t e r i a T o t a l p r o t e i n c o n t e n t ( μ g / m l ) E n z y m e a c t i v i t y ( U / m l ) 1 B e e f e x t r a c t 4 6 2 4 2 C a s e i n 9 8 3 2 3 P e p t o n e 9 0 4 1 4 . G e l a t i n 9 4 3 4 5 A m m o n i u m c h l o r i d e 3 8 2 4 6 A m m o n i u m s u l p h a t e 3 6 2 2 7 P o t a s s i u m n i t r a t e 3 1 2 3 T a b l e . 5 E n z y m e a n d t o t a l p r o t e i n p r o d u c t i o n o n d i f f e r e n t n i t r o g e n s o u r c e s F i g u r e . 4 E n z y m e p r o d u c t i o n a n d t o t a l p r o t e i n p r o d u c t i o n o n d i f f e r e n t c a r b o n s o u r c e s F i g u r e . 5 E n z y m e a n d t o t a l p r o t e i n p r o d u c t i o n o n d i f f e r e n t n i t r o g e n s o u r c e s

c u l t u r i n g c o n d i t i o n s f o r b a c i l l u s s u b t i l i s , S o u t h A f r i c a n A v o c a d o G r o w e r s A s s o c i a t i o n Y e a r b o o k , 1 9 : 5 4 - 5 8 . K o t c h o n i S O a n d S h o n u k a n O O . 2 0 0 2 . R e g u a l t o r y m u t a t i o n s a f f e c t i n g t h e s y n t h e s i s o f c e l l u l a s e , W o r l d J M i c r o b i o l B i o t e c h n o l . , 1 8 : 4 8 7 - 4 9 1 . R a m a c h a n d r a M , C r a w f o r d D L a n d H e r t e l G . 1 9 8 8 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n e x t r a c e l l u l a r l i g n i n p e r o x i d a s e o f t h e l i g n o c e l l u l o l y t i c a c t i n o m y c e t e , s t r e p t o m y c e s a n d v i r i d o s p o r u s , A p p . E n v i r o n , M i c r o b i o l . , 5 4 : 3 0 5 7 - 3 0 6 4 . T i e n M , K e r s t e n P J , K a l y a n a r a m a n B a n d K i r k T K . 1 9 8 5 . T h e l i g n i n a s e o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m g e n e r a t e s c a t i o n r e d i c a l s f r o m m e t h o x y b e n z e n e s . J B i o l C h e m , 1 0 : 2 6 0 ( 5 ) : 2 6 0 9 - 2 6 1 2 . T i e n M , K i r k T K , B u l l C a n d F e e J A . 1 9 8 6 . S t e a d y s t a t e a n d t r a n s i e n t s t a t e k i n e t i c s o n t h e o x i d a t i o n o f 3 , 4 - d i m e t h o x y b e n z y l a l c o h o l c a t a t y z e d b y t h e l i g n i n a s e o f p h a n e r o c h e a t e c h r y s o s p o r i u m b u r d s , J . B i o l C h e m , 2 6 1 ( 4 ) : 1 6 8 7 - 1 6 9 3 . T u n c e r M , K u r u l A , I s i k l i M a n d e l e n k F G C . 2 0 0 4 . O p t i m i z a t i o n o f e x t r a c e l l u l a r e n d o x y l a n a s e , e n d o g l u c a n a s e a n d p e r o x i d a s e p r o d u c t i o n b y s t r p t o m y c e s s p . F 2 6 2 1 i s o l a t e d i n t u r k e y , J . A p p l i e d M i c r o b i o l o g y 9 7 : 7 8 3 - 7 9 1 . Y e o h t e i k l o o n . 2 0 0 6 . S c r e e n i n g o f l i g n i n d e g r a d e r f r o m s o i l , t h e s i s . S u b m i t t e d f o r t h e d e g r e e o f b a c h e l o r o f c h e m i c a l e n g i n e e r i n g . Z o l t a n p r a g a i a n d C o l i n R H a r w o o d . 2 0 0 2 . R e g u l a t o r y i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e p h o a n d r B - d e p e n d e n t g e n e r a l s t r e s s r e g u l a t i o n s o f b a c i l l u s s u b t i l i s 1 4 8 : 1 5 9 3 - 1 6 0 2 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 5 : 3 1 2 - 3 1 8 3 1 8 R e n u g a d e v i e t a l . , 2 0 1 1