J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y B i o c h e m i c a l r e s p o n s e s a n d p r o l i n e m e t a b o l i s m i n A m a r a n t h u s t r i c o l o r L . a n d P h a s e o l u s v u l g a r i s L . u n d e r i n v i t r o N a C l S t r e s s . K e y w o r d s : A m a r a n t h u s t r i c o l o r , i o n s , p r o l i n e , s a l t s t r e s s , s o l u b l e p r o t e i n s . A B S T R A C T : S a l i n i t y i s c u r r e n t l y t h e m a j o r f a c t o r w h i c h r e d u c e s c r o p y i e l d s . O n e o f t h e b i o l o g i c a l a p p r o a c h e s i s t o u s e s a l t t o l e r a n t p l a n t s . A m a r a n t h u s t r i c o l o r L . h a s b e e n u s e d a s a p r o m i s i n g p l a n t t o a m e l i o r a t e t h e s a l t a f f e c t e d a r e a . T h e o b j e c t i v e o f t h e s t u d y i s t o e v a l u a t e t h e e f f e c t o f N a C l s t r e s s o n s y n t h e s i s a n d c a t a b o l i s m o f p r o l i n e , s o l u b l e p r o t e i n s , c a r b o h y d r a t e s a n d N a + / K + r a t i o i n A . t r i c o l o r a n d t o c o m p a r e w i t h t h e s a l t - s e n s i t i v e s p e c i e s , P h a s e o l u s v u l g a r i s L . T h e e x p e r i m e n t s w e r e d e s i g n e d w i t h s i x r e p l i c a t i o n s . S e e d l i n g s o f b o t h s p e c i e s w e r e g r o w n h y d r o p o n i c a l l y w i t h 0 , 5 0 , 1 0 0 , 1 5 0 , 2 0 0 , 2 5 0 a n d 3 0 0 m M N a C l . T h e i n v i t r o a c t i v i t y o f t h e e n z y m e p y r r o l i n e 5 - c a r b o x y l a t e s y n t h e t a s e u n d e r N a C l s t r e s s w a s h i g h e r , w h i l e , t h e a c t i v i t y o f p r o l i n e d e g r a d i n g e n z y m e - p r o l i n e o x i d a s e s h o w e d a r e v e r s e t r e n d i . e . , l o w a c t i v i t y i n h i g h N a C l c o n c e n t r a t i o n s . S o l u b l e p r o t e i n c o n t e n t w a s i n c r e a s e d i n t h e s h o o t o f A . t r i c o l o r b u t d e c r e a s e d i n P . v u l g a r i s . R o o t s o f b o t h t h e s p e c i e s s h o w e d v a r i a t i o n i n t h e p r o t e i n c o n t e n t . P r o l i n e c o n t e n t o f s h o o t a n d r o o t s i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y i n a l l t h e t r e a t m e n t s i n t h e p l a n t s . H o w e v e r , A . t r i c o l o r s h o w e d a h i g h e r l e v e l . T h e t o t a l c a r b o h y d r a t e a l s o s h o w e d a s i m i l a r t r e n d . H i g h l e v e l o f N a C l d e c r e a s e d t h e r e d u c e d s u g a r i n s h o o t s a n d r o o t s o f t h e s p e c i e s . S a l t s t r e s s i n c r e a s e d N a + s i g n i f i c a n t l y a n d d e c r e a s e d t h e K + c o n t e n t i n b o t h s p e c i e s . T h e b i o c h e m i c a l v a r i a t i o n m a y b e i n t e r p r e t e d a s d i f f e r e n t i a l r e s p o n s e o f t h e p l a n t s t o N a C l s t r e s s . 2 9 9 - 3 0 6 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 4 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : S u n u k u m a r S S , H a r i s h S R , M a n o j G S , R e m y a K r i s h n a n a n d M u r u g a n K . I n s t i t u t i o n : P l a n t B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r b i o l o g y L a b , D e p a r t m e n t o f B o t a n y , U n i v e r s i t y C o l l e g e , T h i r u v a n a n t h a p u r a m , K e r a l a - 6 9 5 0 3 4 , I n d i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : M u r u g a n K E m a i l : h a r i m u r u k a n @ g m a i l . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 8 3 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 1 2 A u g 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 2 7 A u g 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 3 0 A u g 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : S u n u k u m a r S S , H a r i s h S R , M a n o j G S , R e m y a K r i s h n a n a n d M u r u g a n K . B i o c h e m i c a l r e s p o n s e s a n d p r o l i n e m e t a b o l i s m i n A m a r a n t h u s t r i c o l o r L . a n d P h a s e o l u s v u l g a r i s L . u n d e r i n v i t r o N a C l S t r e s s . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 9 9 - 3 0 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h p a p e r

I N T R O D U C T I O N A g r i c u l t u r a l p r o d u c t i v i t y i s s e v e r e l y a f f e c t e d b y s o i l s a l i n i t y b e c a u s e s a l t l e v e l s t h a t a r e h a r m f u l t o p l a n t g r o w t h a f f e c t l a r g e t e r r e s t r i a l a r e a s o f t h e w o r l d . E f f o r t s t o i m p r o v e c r o p p e r f o r m a n c e u n d e r e n v i r o n m e n t a l s t r e s s e s h a v e n o t b e e n f r u i t f u l b e c a u s e t h e f u n d a m e n t a l m e c h a n i s m s o f s t r e s s t o l e r a n c e i n p l a n t s r e m a i n t o b e c o m p l e t e l y u n d e r s t o o d ( N y a g a h a n d M u s y i m i , 2 0 0 9 ) . S o i l s a l i n i t y a f f e c t s p l a n t g r o w t h i n a v a r i e t y o f w a y s , r e d u c i n g w a t e r u p t a k e , c a u s i n g t o x i c a c c u m u l a t i o n o f s o d i u m a n d c h l o r i d e , a n d r e d u c i n g n u t r i e n t a v a i l a b i l i t y . S a l i n i t y a l s o i n d u c e s w a t e r d e f i c i t e v e n i n w e l l - w a t e r e d s o i l s b y d e c r e a s i n g t h e o s m o t i c p o t e n t i a l o f s o i l s o l u t e s , t h u s m a k i n g i t d i f f i c u l t f o r r o o t s t o e x t r a c t w a t e r f r o m t h e i r s u r r o u n d i n g m e d i a ( J a l e e l e t a l . , 2 0 0 7 e ) , E x c e s s i v e s o d i u m i n h i b i t s t h e g r o w t h o f m a n y s a l t - s e n s i t i v e p l a n t s , w h i c h i n c l u d e s t h e m o s t c r o p p l a n t s . T h e t y p i c a l f i r s t r e s p o n s e o f a l l p l a n t s t o s a l t s t r e s s i s o s m o t i c a d j u s t m e n t . C o m p a t i b l e s o l u t e a c c u m u l a t i o n i n t h e c y t o p l a s m i s c o n s i d e r e d a m e c h a n i s m t o i m p a r t s a l t t o l e r a n c e ( J a l e e l e t a l . , 2 0 0 7 e ) C o m p l e x m o l e c u l a r r e s p o n s e s i n c l u d i n g t h e a c c u m u l a t i o n o f c o m p a t i b l e s o l u t e s , t h e p r o d u c t i o n o f s t r e s s p r o t e i n s a n d t h e e x p r e s s i o n o f d i f f e r e n t s e t s o f g e n e s a r e p a r t o f t h e p l a n t s i g n a l i n g a n d d e f e n s e s y s t e m a g a i n s t s a l i n i t y . I t i s w e l l k n o w n t h a t o n e o f t h e m o s t c o m m o n r e s p o n s e s t o s a l i n i t y i s t h e o v e r p r o d u c t i o n a n d a c c u m u l a t i o n o f p r o l i n e , g l y c i n e b e t a i n e a n d t o t a l s u g a r s . S o l u t e a c c u m u l a t i o n b y c e l l s i s o n e s u c h m e c h a n i s m ( o s m o r e g u l a t i o n ) w h i c h c o n t r i b u t e s t o s t a b i l i z a t i o n o f e n z y m e / p r o t e i n a n d t u r g o r m a i n t e n a n c e i n g r o w i n g o r g a n s a n d h a s b e e n c o r r e l a t e d w i t h p r o d u c t i v i t y u n d e r s t r e s s ( D e l a u n e y a n d V e r m a , 1 9 9 3 ) . T h e a c c u m u l a t i o n o f f r e e p r o l i n e h a s b e e n s t u d i e d i n a n u m b e r o f t a x a s u b j e c t e d t o h y p e r o s m o t i c s t r e s s c o n d i t i o n s f o r o v e r y e a r s ( D e l a u n e y a n d V e r m a , 1 9 9 3 ) . T h e a c c u m u l a t i o n o f p r o l i n e u n d e r a b i o t i c s t r e s s c o n d i t i o n s a c c o u n t s f o r f e w m i l l i m o l a r c o n c e n t r a t i o n s , d e p e n d i n g o n t h e s p e c i e s a n d t h e e x t e n t o f s t r e s s . V e r y h i g h a c c u m u l a t i o n o f c e l l u l a r p r o l i n e ( u p t o 8 0 % o f t h e a m i n o a c i d p o o l u n d e r s t r e s s a n d 5 % u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s ) d u e t o i n c r e a s e d s y n t h e s i s a n d d e c r e a s e d d e g r a d a t i o n u n d e r a v a r i e t y o f s t r e s s c o n d i t i o n s s u c h a s s a l t a n d d r o u g h t h a s b e e n d o c u m e n t e d i n m a n y p l a n t s p e c i e s . A l t h o u g h p r o l i n e i s k n o w n t o c o n f e r o s m o t i c t o l e r a n c e d u r i n g s t r e s s c o n d i t i o n s , i t s s p e c i f i c r o l e d u r i n g p l a n t g r o w t h i s n o t c o m p l e t e l y c l e a r . T h e b i o s y n t h e t i c p a t h w a y o f p r o l i n e d i v e r g e d b e t w e e n b a c t e r i a a n d h i g h e r p l a n t s y s t e m s ( K a v i K i s h o r e t a l . , 2 0 0 5 ) . A m a r a n t h u s t r i c o l o r g e n e r a l l y g r o w s i n t h e d r y a r i d s o i l s o f K e r a l a . D u e t o i t s v i g o r o u s g r o w t h a n d d r o u g h t t o l e r a n c e , t h i s p l a n t h a s b e e n u s e d a s a p o t e n t i a l g r e e n m a n u r e p l a n t . U n t i l n o w , a f e w s t u d i e s h a v e b e e n c o n d u c t e d o n t h e m e c h a n i s m o f s a l t t o l e r a n c e i n t h i s p l a n t . T h e o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y i s t o o b t a i n a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o n s a l t - t o l e r a n c e m e c h a n i s m i n A . t r i c o l o r b y d e t e r m i n i n g t h e p h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l r e s p o n s e s o f t h e p l a n t t o N a C l i n c o m p a r i s o n w i t h P h a s e o l u s v u l g a r i s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S S e e d s o f A . t r i c o l o r ( o b t a i n e d f r o m A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , T r i c h u r , K e r a l a ) w e r e s o a k e d i n c o n c e n t r a t e d H 2 S O 4 f o r 3 0 m i n t o b r e a k d o r m a n c y . T h e s e e d s w e r e s u r f a c e - s t e r i l i z e d w i t h N a C l O ( 1 . 2 5 % a c t i v e c h l o r i n e ) u n d e r v a c u u m f o r 1 5 m i n a n d r i n s e d s e v e r a l t i m e s w i t h s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r a n d s o a k e d i n i t f o r 1 2 h a t 2 5 ° C . F i f t e e n s e e d s w e r e p l a c e d i n a p e t r i d i s h w i t h t w o l a y e r f i l t e r p a p e r s . T e n m l o f 0 , 5 0 , 1 0 0 , 1 5 0 , 2 0 0 , 2 5 0 a n d 3 0 0 m M N a C l s o l u t i o n w a s s p r a y e d i n t o t h e i n t o p e t r i d i s h . T h e y w e r e t h e n k e p t a t r o o m t e m p e r a t u r e . G e r m i n a t i o n r a t e w e r e d e t e r m i n e d s e v e n d a y s a f t e r t r e a t m e n t . T h e e x p e r i m e n t w a s d e s i g n e d w i t h s i x r e p l i c a t i o n s . S e e d s o f A . t r i c o l o r w e r e b r o k e n t h e i r d o r m a n c y a n d t h e n s u r f a c e s t e r i l i z e d a s d e s c r i b e d a b o v e . T h e y w e r e t h e n s o a k e d i n s t e r i l e w a t e r a t 2 5 ° C f o r o n e n i g h t . P h a s e o l u s v u l g a r i s L . s e e d s w e r e i n c u b a t e d o n m o i s t f i l t e r p a p e r a t 3 0 ° C f o r 2 d a y s i n d a r k n e s s . G e r m i n a t e d s e e d s w e r e p l a n t e d i n a c o n t a i n e r c o n t a i n i n g v e r m i c u l i t e a n d g r o w n a t 2 5 ° C f o r 2 d a y s i n d a r k n e s s w i t h a l u m i n u m f o i l c o v e r . T h e n a h a l f s t r e n g t h o f M S m e d i u m ( 1 9 6 2 ) w a s a d d e d t o t h e v e r m i c u l i t e . A f t e r 5 d a y s , s e e d l i n g s w e r e t r a n s f e r r e d t o a h y d r o p o n i c c u l t u r e w i t h t h e s a m e n u t r i e n t s o l u t i o n . A . t r i c o l o r a n d P . v u l g a r i s w e r e g r o w n t o t h e 3 r d t o 4 t h a n d t o t h e 1 s t t o 2 n d l e a f s t a g e r e s p e c t i v e l y . S a l t t r e a t m e n t w a s g i v e n b y a d d i n g 5 0 m M N a C l t o t h e s o l u t i o n . F o r t h e t r e a t m e n t s w i t h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s , p l a n t s w e r e t r a n s f e r r e d t o 1 0 0 , 1 5 0 , 2 0 0 , 2 5 0 a n d 3 0 0 m M a t t w o - d a y i n t e r v a l s . T h e N a C l s o l u t i o n c o n t a i n i n g n u t r i e n t w a s r e n e w e d e v e r y 4 d a y s . P l a n t s w e r e g r o w n i n a g r o w t h c h a m b e r a t 2 5 / 2 0 ° C d a y / n i g h t t e m p e r a t u r e s , w i t h a 1 4 h p h o t o p e r i o d a t 2 8 0 - 2 9 0 μ E / m 2 / s , a t a r e l a t i v e h u m i d i t y o f 7 0 - 8 0 % . S e e d l i n g s w e r e h a r v e s t e d 1 4 d a y s a f t e r s t a r t i n g N a C l t r e a t m e n t . A l l e x p e r i m e n t s w e r e d e s i g n e d w i t h s i x r e p l i c a t i o n s . 3 0 0 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 9 9 - 3 0 6 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1

S h o o t s a n d r o o t w e r e d r i e d a t 7 0 o C f o r 2 4 h a n d w e i g h e d . S o d i u m , c h l o r i d e a n d p o t a s s i u m w e r e e x t r a c t e d f r o m e a c h s a m p l e i n a m i x t u r e o f H N O 3 , H C l O 4 , a n d d i s t i l l e d w a t e r ( 1 : 5 : 2 . 5 ) . T h e s o l u t i o n w a s k e p t f o r 1 2 h a t 1 0 0 ο C , d i l u t e d w i t h 1 0 0 m M H C 1 , a n d a n a l y z e d b y a t o m i c e m i s s i o n s p e c t r o m e t r y . S o l u b l e p r o t e i n s w e r e e x t r a c t e d f r o m y o u n g s h o o t s a n d r o o t s i n a n e x t r a c t i o n b u f f e r ( 0 . 0 1 M T r i s - H C l , 1 0 % g l y c e r o l , 5 % P V P , 1 % T r i t o n X 1 0 0 , p H = 6 . 8 ) a n d p r o t e i n a s s a y w a s c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f B r a d f o r d , ( 1 9 7 6 ) . F o r p r o l i n e d e t e r m i n a t i o n , 1 0 m L o f 3 % ( W / V ) a q u e o u s s u l f o s a l i c y l i c a c i d s o l u t i o n w a s a d d e d t o 1 g o f f r e s h s h o o t a n d r o o t s a m p l e s a n d w a s h o m o g e n i z e d , f i l t e r e d t h r o u g h o n e l a y e r o f W h a t m a n n , N o . 1 , f i l t e r p a p e r , t h e n p r o l i n e w a s a s s a y e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f B a t e s e t a l , 1 9 7 3 . T o t a l f r e e a m i n o a c i d s w e r e e x t r a c t e d a n d e s t i m a t e d a s p e r t h e m e t h o d o f W a l t e r T r o l l a n d K e i t h C a n n a n ( 1 9 5 2 ) . C a r b o h y d r a t e s w e r e e x t r a c t e d f r o m d r y s h o o t s a n d r o o t s o f p l a n t l e t s i n w a r m w a t e r . C o n c e n t r a t i o n o f t o t a l a n d r e d u c e d s u g a r s w e r e d e t e r m i n e d b a s e d o n t h e m e t h o d s o f D u b o i s , ( 1 9 5 6 ) a n d J e f f r i e s , ( 1 9 9 8 ) r e s p e c t i v e l y . E n z y m e e x t r a c t i o n w a s b a s e d o n t h e m e t h o d o f C h e n e t a l , ( 2 0 0 1 ) . S e e d l i n g s w e r e h o m o g e n i z e d i n p r e c h i l l e d m o r t a r a n d p e s t l e i n t h e e x t r a c t i o n m e d i u m a t 4 ° C . T h e e x t r a c t i o n m e d i u m c o n t a i n e d 1 0 0 m M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 4 ) , 1 m M E D T A , 1 0 m M 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , 1 % ( w / v ) P V P , 5 m M M g C l 2 , a n d 0 . 6 M K C l . T h e h o m o g e n a t e w a s c e n t r i f u g e d a t 1 2 0 0 0 g f o r 2 0 m i n a t 4 ° C , t h e r e s u l t i n g s u p e r n a t a n t w a s k e p t a t 2 0 ° C a n d u s e d f o r e n z y m e a s s a y i n g . P 5 C S a c t i v i t y w a s a s s a y e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f m o d i f i e d V o g e l a n d K o p a c , ( 1 9 6 0 ) a s f o l l o w s . 0 . 7 m L r e a c t i o n m e d i u m c o n t a i n i n g 5 0 m M T r i s ( p H 7 . 5 ) , 2 m M M g C l 2 , 1 0 m M A T P , 1 . 0 m M N A D H , 5 0 m M g l u t a m i c a c i d , a n d 0 . 1 m L e n z y m e e x t r a c t w a s i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 3 0 m i n . T h e r e a c t i o n w a s t h e n s t o p p e d b y a d d i n g 0 . 3 m L o f 1 0 % ( w / v ) t r i c h l o r o a c e t i c a c i d . C o l o r r e a c t i o n w a s d e v e l o p e d b y i n c u b a t i n g w i t h 0 . 1 m L o f 0 . 5 % ( w / v ) o - a m i n o b e n z a l d e h y d e f o r 1 h . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n a t 1 2 0 0 0 g f o r 1 0 m i n , t h e c l e a r s u p e r n a t a n t f r a c t i o n w a s t a k e n t o m e a s u r e t h e a b s o r b a n c e a t 4 4 0 n m . E n z y m e a c t i v i t y w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t o f 2 . 6 8 / ( m M c m ) . P r o l i n e o x i d a s e ( P O ) a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o u t l i n e d b y H u a n g a n d C a v a l i e r i , ( 1 9 7 9 ) . P l a n t s a m p l e s ( 1 g ) w e r e e x t r a c t e d w i t h 5 m L o f T r i s - H C l b u f f e r ( p H 8 . 5 ) g r i n d i n g m e d i u m a n d c e n t r i f u g e d a t 1 0 , 0 0 0 g f o r 1 0 m i n a t 4 ° C . T h e s u p e r n a t a n t w a s a g a i n c e n t r i f u g e d a t 2 5 , 0 0 0 g a t 2 0 m i n a t 4 ° C . A 3 - m L a s s a y m i x t u r e w a s p r e p a r e d b y t a k i n g 0 . 1 m L o f e x t r a c t , 1 . 2 m L o f 5 0 m M T r i s H C l b u f f e r ( p H 8 . 5 ) , 1 . 2 m L o f 5 m M M g C l 2 , 0 . 1 m L o f 0 . 5 m M N A D P , 0 . 1 m L o f 1 m M K C N , 2 0 . 1 m L o f 1 m M p h e n a z i n e m e t h o s u l p h a t e ( P M S ) , 0 . 1 m L o f 0 . 0 6 m M 2 , 6 - d i c h l o r o p h e n o l i n d o p h e n o l ( D C P I P ) a n d 0 . 1 m L d i s t i l l e d w a t e r i n s t e a d o f P R O . T h e r e a c t i o n w a s m o n i t o r e d a t 6 0 0 n m a t 2 5 ° C u s i n g P R O t o i n i t i a t e r e a c t i o n ; t h e i n c r e a s e i n O D v a l u e s i n c r e a s e w e r e n o t e d a t 0 , 1 , 2 , 3 , 4 a n d 5 m i n . P O a c t i v i t y w a s e x p r e s s e d i n U ( o n e U = m M D C P I P r e d u c e d m i n - 1 m g - 1 p r o t e i n ) . F i v e i n d e p e n d e n t d e t e r m i n a n t s f r o m i n d i v i d u a l p l a n t s w e r e u s e d f o r s t a t i s t i c a l a n a l y s i s . S t u d e n t s t t e s t a n d a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) w e r e u s e d f o r a n a l y z i n g s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e c o n t r o l a n d t r e a t e d p l a n t s ( P < 0 . 0 5 ) . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N T o t a l p r o t e i n a n d p r o l i n e c o n t e n t o f A . t r i c o l o r a n d P . v u l g a r i s s h o o t s w e r e i n c r e a s e d m o d e r a t e l y b y s a l t t r e a t m e n t u p t o 1 5 0 m M N a C l a n d t h e r e a f t e r d e c l i n e d s h a r p l y a t h i g h e r N a C l c o n c e n t r a t i o n s ( D a t a n o t s h o w n ) . I n t h e r o o t s t h e p r o t e i n a n d p r o l i n e c o n t e n t i n c r e a s e d a t a l l N a C l c o n c e n t r a t i o n s t e s t e d , a l t h o u g h a d e c l i n e w a s a p p a r e n t a t 3 0 0 m M ( T a b l e 1 a a n d b ) . N e v e r t h e l e s s , t h e p r o t e i n a n d p r o l i n e c o n t e n t s o f s e v e r e l y s t r e s s e d r o o t s w e r e l o w e r t h a n t h o s e o f m o d e r a t e l y s t r e s s e d o n e s , b u t s t i l l h i g h e r t h a n t h e c o n t r o l . H o w e v e r , s e e d l i n g s o f P . v u l g a r i s w i l t e d o r d i e d a t h i g h e r N a C l c o n c e n t r a t i o n s ( 1 0 0 m M a n d a b o v e ) . S i g n i f i c a n t p o s i t i v e r e l a t i o n s h i p w a s e x a m i n e d b e t w e e n s a l i n i t y a n d t o t a l p r o t e i n a n d p r o l i n e c o n t e n t ( P < 0 . 0 5 ) . T h e a m o u n t o f s o l u b l e a m i n o a c i d s i n c r e a s e d i n b o t h p l a n t s w i t h i n c r e a s i n g N a C l c o n c e n t r a t i o n . A t t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n , a l t h o u g h t h e t o t a l a m i n o a c i d w a s c l e a r l y b u i l t u p i n b o t h t h e s h o o t s a n d r o o t s o f A . t r i c o l o r , t h e i r a c c u m u l a t i o n w a s m o r e o b v i o u s i n s h o o t s ( T a b l e 1 a a n d b ) . S i m i l a r l y , t h e f r e e a m i n o a c i d s a c c u m u l a t i o n w a s a l s o f o u n d i n P . v u l g a r i s a t t h e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n ( 1 0 0 a n d 1 5 0 m M ) . T h e d a t a w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t a t 1 % l e v e l . W e f o u n d s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t o t a l c a r b o h y d r a t e a n d r e d u c e d s u g a r b e t w e e n t h e t w o s p e c i e s u n d e r N a C l t r e a t m e n t . F o r e x a m p l e , a t 1 5 0 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 9 9 - 3 0 6 3 0 1 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1

m M N a C l t o t a l c a r b o h y d r a t e i n A . t r i c o l o r 1 8 . 6 m g g - 1 D W w h i l e i n P . v u l g a r i s w a s o n l y 8 . 4 m g g - 1 D W . A s i m i l a r b u t m o d e r a t e p a t t e r n o f c a r b o h y d r a t e c h a n g e s w a s o b s e r v e d i n r o o t s . R e d u c e d s u g a r o f s h o o t a n d r o o t i n b o t h t h e s p e c i e s w a s d e c r e a s e d w h e n p l a n t s a r e e x p o s e d t o N a C l s t r e s s ( F i g . 1 a n d 2 ) . N a + a n d C l ¯ c o n t e n t s w e r e e n h a n c e d w i t h i n c r e a s i n g s a l i n i t y i n r o o t s a n d s h o o t o f A . t r i c o l o r a n d P . v u l g a r i s ( F i g . 3 a n d 4 ) H o w e v e r , t h e i r a c c u m u l a t i o n w a s g r e a t e r i n s h o o t s t h a n i n r o o t s i n A . t r i c o l o r . I n t h e c a s e o f P . v u l g a r i s t h e p a t t e r n o f a c c u m u l a t i o n w a s d i f f e r e n t i . e . h i g h e r i n r o o t s t h a n i n s h o o t s . K + c o n t e n t o n t h e o t h e r h a n d h a s b e e n r e d u c e d m a r k e d l y i n b o t h t h e s p e c i e s . I n s t a b i l i t y o f P o t a s s i u m ( K + ) c o n t e n t i n s h o o t s a n d r o o t s w a s o b s e r v e d i n P . v u l g a r i s , w h i l e i t s l i g h t l y r e d u c e d i n A . t r i c o l o r ( F i g . 5 ) . T h e i o n a n a l y s e s i n i n d i v i d u a l l e a f s h o w e d t h a t N a + w e r e t e n d e d t o a c c u m u l a t e i n t h e o l d e r l e a v e s w i t h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n , b u t r o o t s i n P . v u l g a r i s ( F i g . 6 a a n d b ) . 1 - P y r r o l i n e - 5 - c a r b o x y l a t e s y n t h e t a s e ( P 5 C S ) s h o w s a p o s i t i v e c o r r e l a t i o n w i t h N a C l c o n c e n t r a t i o n s u p t o 1 5 0 m M i n s h o o t a n d r o o t o f A . t r i c o l o r , b u t P . v u l g a r i s s h o w e d d e c r e a s e i n t h e a c t i v i t y o f P 5 C S a t 1 0 0 m M N a C l c o n c e n t r a t i o n ( P < 0 . 0 5 ) ( F i g . 7 ) . T h e t r e n d o f c h a n g e i n t h e a c t i v i t y o f P 5 C S c o r r o b o r a t e s w i t h t h e p r o l i n e a c c u m u l a t i o n i n d i f f e r e n t N a C l t r e a t m e n t s i n t h e s p e c i e s . T h e l e v e l o f p r o l i n e d e g r a d i n g e n z y m e , p r o l i n e o x i d a s e ( P O ) a c t i v i t y w a s i n h i b i t e d t o a l a r g e e x t e n t i n b o t h s h o o t a n d r o o t s o f A . t r i c o l o r b y 3 0 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 9 9 - 3 0 6 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1 T a b l e 1 a a n d b . A m i n o a c i d c o n t e n t s ( m g / g D W ) i n N a C l t r e a t e d A . t r i c o l o r a n d P . v u l g a r i s 1 4 d a y s a f t e r s t a r t i n g N a C l t r e a t m e n t . N a C l ( M m ) R o o t s S h o o t s F r e e a m i n o a c i d s T o t a l p r o t e i n s P r o l i n e F r e e a m i n o a c i d s T o t a l p r o t e i n s P r o l i n e 0 2 . 5 ± 0 . 9 3 . 6 ± 0 . 5 0 . 4 ± 1 3 . 8 . 2 ± 1 . 9 4 . 1 ± 0 . 3 0 . 5 3 ± 0 . 0 1 5 0 5 . 9 ± 0 . 2 9 4 . 0 ± 0 . 4 0 . 5 2 ± 0 . 2 9 1 2 . 7 ± 2 5 . 2 ± 0 . 0 9 1 . 2 ± 0 . 0 3 1 0 0 9 . 2 ± 0 . 3 5 4 . 8 ± 0 . 2 5 1 . 5 ± 0 . 3 8 1 6 . 9 ± 3 . 2 6 . 5 ± 0 . 2 6 1 . 5 ± 1 . 9 1 5 0 1 1 . 4 ± 2 . 9 5 . 7 ± 0 . 1 1 2 . 2 ± 0 . 7 2 3 ± 0 . 9 9 7 . 8 ± 0 . 3 8 2 . 9 ± 2 . 3 2 0 0 1 2 ± 2 . 6 6 . 3 ± 0 . 2 3 2 . 2 ± 0 . 5 2 7 . 8 ± 0 . 6 5 8 . 5 ± 0 . 4 3 . 3 ± 3 . 9 T a b l e 1 a N a C l ( M m ) R o o t s S h o o t s F r e e a m i n o a c i d s T o t a l p r o t e i n s P r o l i n e F r e e a m i n o a c i d s T o t a l p r o t e i n s P r o l i n e 0 3 . 5 ± 0 . 9 1 4 . 0 ± 0 . 5 0 . 2 ± 0 . 4 5 8 . 8 ± 1 4 . 8 ± 2 . 1 0 . 5 ± 0 . 2 5 0 8 . 3 ± 0 . 8 5 . 4 ± 1 . 5 0 . 3 ± 0 . 1 2 1 1 . 3 ± 2 . 1 5 . 6 ± 0 . 7 0 . 8 ± 0 . 3 4 1 0 0 1 3 . 1 ± 0 . 4 5 6 . 9 ± 2 0 . 8 1 ± 0 . 3 3 1 9 . 2 ± 2 . 7 7 . 0 ± 0 . 9 0 . 6 ± 0 . 5 1 5 0 2 2 . 4 ± 0 . 7 8 7 . 2 ± 1 . 7 0 . 6 ± 0 . 6 5 2 3 ± 2 . 9 8 . 0 ± 2 . 8 0 . 5 ± 0 . 8 T a b l e 1 b T h e d a t a a r e t h e m e a n o f s i x r e p l i c a t e s ± S . E . S i g n i f i c a n t a t 0 . 0 1 l e v e l s . P < 0 . 0 5 . 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 N a C l c o n c e n t r a t i o n s ( m M ) T o t a l c a r b o h y d r a t e s & R e d u c e d s u g a r ( m g / g D W ) S h o o t T o t . C a r b o R o o t T o t . C a r b o S h o o t R e d . S u g a r R o o t R e d . S u g a r F i g u r e 1 . T o t a l c a r b o h y d r a t e s a n d r e d u c e d s u g a r i n s h o o t s a n d r o o t s f r o m N a C l - t r e a t e d A . t r i c o l o r 1 8 d a y s a f t e r s t a r t i n g N a C l t r e a t m e n t . 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 N a C l c o n c e n t r a t i o n s ( m M ) T o t a l c a r b o h y d r a t e s & R e d u c e d s u g a r ( m g / g D W ) S h o o t T o t . C a r b o R o o t T o t . C a r b o S h o o t R e d . S u g a r R o o t R e d . S u g a r F i g u r e 2 . T o t a l c a r b o h y d r a t e s a n d r e d u c e d s u g a r i n s h o o t s a n d r o o t s f r o m N a C l - t r e a t e d P . v u l g a r i s 1 8 d a y s a f t e r s t a r t i n g N a C l t r e a t m e n t .

N a C l s t r e s s ( F i g u r e 8 ) , w i t h t h e l o w e s t a c t i v i t y w a s r e c o r d e d a t 1 5 0 m M o f N a C l c o n c e n t r a t i o n s ( 5 0 m M i n P . v u l g a r i s ) c o m p a r e d w i t h c o n t r o l . I n p l a n t s , h i g h e r a c c u m u l a t i o n o f N a + a n d C l ¯ r e q u i r e s c o m p a t i b l e s o l u t e s f o r o s m o t i c a d j u s t m e n t u n d e r s a l i n i t y s t r e s s ( K a v i K i s h o r e t a l . , 2 0 0 5 ) . I n t h i s s t u d y , a c c u m u l a t i o n o f N a + a n d C l ¯ f o u n d i n t h e s p e c i e s a s a r e s p o n s e t o c h a n g i n g s a l i n i t y s t r e s s l e v e l s . H o w e v e r , a d i f f e r e n t p a t t e r n o f N a + a n d C l ¯ d i s t r i b u t i o n i n e a c h p a r t o f t h e t w o s p e c i e s w a s c l e a r l y s e e n w i t h i n c r e a s i n g s a l i n i t y . A . t r i c o l o r h a s a h i g h e r a c c u m u l a t i o n o f t h e i o n s i n t h e s h o o t s , b u t P . v u l g a r i s i n r o o t s . T h e a b i l i t y t o t r a n s l o c a t e N a + a n d C l ¯ f r o m r o o t s a n d t r a n s f e r t h e m t o s h o o t s i s c o n s i d e r e d t o b e o n e o f t h e m e c h a n i s m s o f s a l t t o l e r a n c e i n A . t r i c o l o r . H i g h a c c u m u l a t i o n o f t h e e x c e s s i v e s a l t s i n s h o o t s i n d i c a t e s t h e r e i s s o m e m e c h a n i s m t o r e d u c e d e t r i m e n t a l e f f e c t o f t h e i o n s i n t h e s h o o t c e l l s . L o c a l i z i n g N a + a n d C l ¯ i n t h e v a c u o l e a n d b a l a n c i n g b y c o m p a t i b l e s o l u t e s w i t h i n t h e c y t o p l a s m w a s r e p o r t e d a s t h e i m p o r t a n t s a l t t o l e r a n t m e c h a n i s m s a t c e l l u l a r l e v e l ( B r e m b e r g e r a n d L u t t g e 1 9 9 2 ) . I t m a y l i k e l y i n d i c a t e t h a t A . t r i c o l o r h a s a n a b i l i t y t o t r a n s l o c a t e t h e i o n s a n d h o l d t h e m i n t h e l e a v e s . T h i s p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s m a y b e i m p o r t a n t t o r e d u c e t h e s a l t t o x i c i t y i n a n d a w a y f r o m t h e r o o t c e l l s . A s a r e s u l t t h e p l a n t c o u l d J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 9 9 - 3 0 6 3 0 3 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 N a C l c o n c e n t r a t i o n ( m M ) N a + a n d C l - c o n t e n t S h o o t ( N a + ) R o o t ( N a + ) S h o o t ( C l - ) R o o t ( C l - ) F i g u r e 3 . I o n s d i s t r i b u t i o n ( N a + a n d C l - c o n t e n t μ m o l / g D W ) i n N a C l - t r e a t e d A . t r i c o l o r 1 8 d a y s a f t e r s t a r t i n g N a C l t r e a t m e n t . 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 N a C l c o n c e n t r a t i o n s ( m M ) N a + a n d C l - c o n t e n t S h o o t ( N a + ) R o o t ( N a + ) S h o o t ( C l - ) R o o t ( C l - ) F i g u r e 4 . I o n s d i s t r i b u t i o n ( N a + a n d C l - c o n t e n t μ m o l / g D W ) i n N a C l - t r e a t e d P . v u l g a r i s 1 8 d a y s a f t e r s t a r t i n g N a C l t r e a t m e n t . F i g u r e 5 . I o n s d i s t r i b u t i o n ( K + m o l / g D W ) i n N a C l - t r e a t e d A . t r i c o l o r a n d P . v u l g a r i s 1 8 d a y s a f t e r s t a r t i n g N a C l t r e a t m e n t . F i g u r e 6 a a n d b . D i s t r i b u t i o n o f N a + a n d C l - i n l e a v e s ( a a n d b ) , a n d 1 s t 6 t h l e a v e s o f A . t r i c o l o r 1 4 d a y s a f t e r s t a r t i n g N a C l t r e a t m e n t . 0 m M , 5 0 m M , 1 0 0 m M , 1 5 0 m M , 2 0 0 m M o f N a C l ) . V e r t i c a l b a r s i n d i c a t e s t a n d a r d e r r o r s ( n = 3 ) .

s u r v i v e e v e n a t t h e h i g h e r s a l i n i t y l e v e l s t o w h i c h w e r e s u b j e c t e d d u r i n g t h i s s t u d y . I n t h e p r e s e n t s t u d y , a c c u m u l a t i o n o f t o t a l f r e e a m i n o a c i d s , p r o t e i n s a n d p r o l i n e w a s o b s e r v e d i n t h e r o o t s a n d s h o o t s o f b o t h s p e c i e s . H o w e v e r , a t h i g h e r N a C l c o n c e n t r a t i o n s s e e d l i n g s o f P . v u l g a r i s d i e d ; s u g g e s t i n g t h a t t o t a l p r o t e i n o r p r o l i n e d o e s n o t h e l p i n r e d u c i n g s a l t d a m a g e i n t h i s p l a n t . O n t h e c o n t r a r y , t h e s e c o n c e n t r a t i o n s h a d n o d e t r i m e n t a l e f f e c t o n t h e s e e d l i n g s o f A . t r i c o l o r ; t h i s i n d i c a t e s t h a t h i g h e r p r o l i n e a c c u m u l a t i o n m a y c o n t r i b u t e t o t h e a l l e v i a t i o n o f N a C l s t r e s s i n t h e p l a n t . O u r r e s u l t s i n d i c a t i n g t h a t i n c r e a s i n g o r d e c r e a s i n g o f p r o t e i n c o n t e n t i n p l a n t s e x p o s e d t o s a l t s t r e s s i s r e l a t i v e l y g e n o t y p e d e p e n d e n t . T h e e f f e c t o f s a l t - s t r e s s o n p r o t e i n c o n t e n t d e p e n d e d o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f N a C l . A t l o w e r l e v e l s o f N a C l , t h e r e w a s a n i n c r e a s e i n p r o t e i n c o n t e n t , b u t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s c a u s e d i t t o d e c l i n e i n b o t h s h o o t a n d r o o t ( a b o v e 2 5 0 m M ) . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e i n i t i a l r e s p o n s e t o s a l t s t r e s s i n v o l v e s i n c r e a s e d p r o t e i n s y n t h e s i s t h a t i s p r e v e n t e d w h e n t h e s t r e s s b e c o m e s t o o s e v e r e . I t w o u l d b e p r e d i c t e d t h a t p l a n t s u n d e r s t r e s s w o u l d h a v e a p o w e r f u l p r o t e i n t u r n o v e r m a c h i n e r y t o d e g r a d e s t r e s s d a m a g e d a n d e n v i r o n m e n t a l l y - r e g u l a t e d p r o t e i n s . P r o l i n e g e n e r a l l y s e r v e s a s a p h y s i o l o g i c a l l y c o m p a t i b l e s o l u t e t h a t i n c r e a s e s i n o r d e r t o m a i n t a i n a f a v o r a b l e o s m o t i c p o t e n t i a l b e t w e e n t h e c e l l a n d i t s s u r r o u n d i n g s . P r o l i n e a c c u m u l a t i o n u n d e r s t r e s s c o n d i t i o n s m a y e i t h e r b e c a u s e d b y i n d u c t i o n o r a c t i v a t i o n o f e n z y m e s o f p r o l i n e b i o s y n t h e s i s o r a d e c r e a s e d p r o l i n e o x i d a t i o n t o g l u t a m a t e o r d e c r e a s e d u t i l i s a t i o n o f p r o l i n e i n p r o t e i n s y n t h e s i s , o r e n h a n c e d p r o t e i n t u r n o v e r ( D e l a u n e y , a n d V e r n a , 1 9 9 3 ) . T h e e x p r e s s i o n o f g e n e s e n c o d i n g k e y e n z y m e s o f p r o l i n e s y n t h e s i s ( P 5 C s y n t h a s e , P 5 C r e d u c t a s e , ) a n d p r o l i n e o x i d a t i o n ( p r o l i n e d e h y d r o g e n a s e ) i s c o n t r o l l e d b y o s m o t i c a n d s a l i n i t y s t r e s s a n d p r e c e d e s t h e i n c r e a s e o r d e c r e a s e o f p r o l i n e c o n c e n t r a t i o n i n p l a n t t i s s u e ( C l a u s s e n , 2 0 0 5 ) . W i t h i n c r e a s i n g o f N a C l , t h e p r o l i n e c o n t e n t o f t w o s p e c i e s i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y . P r o l i n e a c c u m u l a t i o n i n s h o o t s a n d , m a i n l y , i n r o o t s i s c o n s i d e r e d a s a m a r k e r t o s a l t s t r e s s t h a t m a y b e u s e d t o s e l e c t p l a n t s w i t h d i f f e r e n t d e g r e e s o f t o l e r a n c e . P r o l i n e m a y a l s o a c t a s a s i g n a l i n g / r e g u l a t o r y m o l e c u l e a b l e t o a c t i v a t e m u l t i p l e r e s p o n s e s t h a t a r e c o m p o n e n t o f t h e a d a p t a t i o n p r o c e s s ( S a n k a r G a n e s h e t a l . , 2 0 0 9 ) . C h a n g e i n s o l u b l e s u g a r s c o n t e n t u n d e r s a l t s t r e s s h a s a l r e a d y b e e n r e p o r t e d f o r a n u m b e r o f s p e c i e s ( N y a g a h a n d M u s y i m i , 2 0 0 9 ) . H i g h e r a m o u n t o f c a r b o h y d r a t e s m a y b e o n e o f t h e r e a s o n s r e s p o n s i b l e f o r h i g h e r s a l t t o l e r a n c e i n A . t r i c o l o r . I n t h e p r e l i m i n a r y p a r t o f t h i s s t u d y w e h a v e f o u n d o u t t h a t A . t r i c o l o r h a s h i g h e r s e e d g e r m i n a t i o n a n d b e t t e r g r o w t h u n d e r s a l t s t r e s s c o n d i t i o n s . S o m e h a l o p h y t e s a r e k n o w n t o a c c u m u l a t e s a l t s i n t h e i r l e a v e s u n d e r s a l i n i t y s t r e s s ( G r e e n w a y a n d M u n n s , 1 9 8 0 ) . G l y c o p h y t e s , o n t h e o t h e r h a n d , r e s p o n d t o s a l i n i t y b a s i c a l l y b y i o n i n c l u s i o n . T h e m a j o r i t y o f t h e s e s p e c i e s a c c u m u l a t e h i g h l e v e l s o f N a + i n t h e i r r o o t s a n d s t e m s ( F l o w e r , 1 9 9 1 ) . A t l o w e r N a C l c o n c e n t r a t i o n , a n a b i l i t y t o l o c a l i z e N a + a n d C l - i o n s i n r o o t c e l l s s e e m e d t o b e i m p o r t a n t t o a l l e v i a t e s a l i n i t y s t r e s s i n P . v u l g a r i s . A t h i g h e r d o s e s o f N a C l , h o w e v e r , t h e y c o u l d n o t r e s i s t t o x i c i t y o f s a l t r e s u l t i n g i n w i l t i n g a n d d e a t h o f t h e p l a n t . T h e h i g h e r N a + a n d C l - a c c u m u l a t i o n i n l e a v e s o f A . t r i c o l o r t h a n P . v u l g a r i s m a y i n d i c a t e t h a t l e a f c e l l s o f A . t r i c o l o r h a s m e c h a n i s m t o t o l e r a t e h i g h e r i o n s c o n c e n t r a t i o n . T h e r e p l a c e m e n t o f K + b y N a + o b s e r v e d i n P . v u l g a r i s w a s 3 0 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 9 9 - 3 0 6 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1 F i g u r e 7 . P y r r o l i n e 5 - c a r b o x y l a t e s y n t h e t a s e ( P 5 C S ) a c t i v i t y i n s h o o t a n d r o o t s o f A . t r i c o l o r a n d P . v u l g a r i s 1 8 d a y s a f t e r s t a r t i n g N a C l t r e a t m e n t s . F i g u r e 8 . P r o l i n e o x i d a s e ( P O ) a c t i v i t y i n s h o o t a n d r o o t s o f A . t r i c o l o r a n d P . v u l g a r i s 1 8 d a y s a f t e r s t a r t i n g N a C l t r e a t m e n t .

c o n s i d e r e d t o b e s i m i l a r w i t h t h e p r e v i o u s r e p o r t i n t o m a t o i n w h i c h t h e r e p l a c e m e n t o c c u r r e d p r o g r e s s i v e l y w i t h i n c r e a s i n g a b s o r p t i o n o f N a + , a n d t h e a b s o r b e d N a + w a s t r a n s p o r t e d t o t h e s t e m ( B e s f o r d , 1 9 7 8 ) . T h e h i g h c o n c e n t r a t i o n o f N a C l ( 1 5 0 m M ) i s n o t a l e t h a l d o s e o f A . t r i c o l o r , w h i l e t h e l o w e s t c o n c e n t r a t i o n ( 5 0 m M ) p r o v e d t o o s t r o n g d o s e f o r t h e s h o o t s o f P . v u l g a r i s . G r e a t e r a c c u m u l a t i o n o f t h e s e i o n s i n t h e o l d e r l e a v e s h a s b e e n r e p o r t e d i n s e v e r a l o t h e r p l a n t s p e c i e s a n d t h i s f u n c t i o n i s c o n s i d e r e d t o b e e f f e c t i v e i n a v o i d i n g h u g e a c c u m u l a t i o n s o f t h e t o x i c s a l t s i n t h e g r o w i n g y o u n g l e a v e s ( W a h o m e e t a l , 2 0 0 1 ) . U n d e r s a l t s t r e s s o n e o f t h e m e c h a n i s m s o f s a l t t o l e r a n c e i s a c c o m p l i s h e d b y u p t a k e a n d a c c u m u l a t i o n o f i n o r g a n i c i o n s , m a i n l y N a + , K + a n d C l - ( D i o n i s i o - S e s e a n d T o b i t a , 2 0 0 0 ) . I n o u r s t u d y u n d e r s a l i n i t y , A . t r i c o l o r a c c u m u l a t e d h i g h l e v e l o f N a + i n s h o o t s i n c o m p a r i s o n w i t h P . v u l g a r i s . T h e r i s e i n N a + c o n c e n t r a t i o n s i n t h e s h o o t s l o w e r t h e o s m o t i c p o t e n t i a l , s o c o n t r i b u t i n g t o t h e m a i n t e n a n c e o f w a t e r p o t e n t i a l d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s h o o t s a n d t h e m e d i u m r e q u i r e d t o o b t a i n w a t e r f r o m t h e s a l i n e s o l u t i o n ( D i o n i s i o - S e s e a n d T o b i t a , 2 0 0 0 ) . N a + / K + r a t i o m a y s e r v e a s a n i n d i c a t o r o f c r o p t o l e r a n c e t o s t r e s s a s t h e i n c r e a s e o f N a + i n s a l t t o l e r a n t s p e c i e s i s g e n e r a l l y a s s o c i a t e d w i t h a d e c r e a s e i n K + ( D i o n i s i o - S e s e a n d T o b i t a , 2 0 0 0 ) . T h e i n c r e a s e i n N a + / K + r a t i o i n l e a f a n d r o o t u p t o 1 5 0 m M N a C l a n d d e c r e a s e a t h i g h e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s i n A . t r i c o l o r s u g g e s t s t h a t A . t r i c o l o r i s r e l a t i v e l y m o r e s a l t t o l e r a n t o r t h e y m a y h a v e d e f e n s e f o r s a l t a d a p t a t i o n . E n h a n c e m e n t o f p r o l i n e u n d e r s t r e s s m a y b e d u e t o i n c r e a s e i n t h e a c t i v i t y o f P 5 C S . T h e e n z y m e P 5 C S i s k n o w n t o c a t a l y z e t h e r a t e l i m i t i n g s t e p r e a c t i o n i n p r o l i n e s y n t h e s i s ( S o n g e t a l . , 2 0 0 5 ) . T r a n s g e n i c p l a n t s o v e r e x p r e s s i n g P 5 C S g e n e s h o w i n c r e a s e d p r o l i n e l e v e l s d u e t o i n c r e a s e d P 5 C S a c t i v i t y . S u c h p l a n t s w e r e r e p o r t e d t o p o s s e s s g r e a t e r t o l e r a n c e t o o s m o t i c s t r e s s ( S o n g e t a l . , 2 0 0 5 ) . S i m i l a r l y , p r o l i n e o x i d a s e o x i d i s e t h e p r o l i n e t o g l u t a m a t e a n d t h e d e t e r m i n a n t e n z y m e i n p r o l i n e a c c u m u l a t i o n ( K a v i K i s h o r e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e r e l a t i o n s h i p s f o u n d b e t w e e n t h e P O a c t i v i t y a n d t h e p r o l i n e c o n c e n t r a t i o n s ( r = - 0 . 8 3 * * ) s u g g e s t t h a t p r o l i n e a c c u m u l a t i o n d e p e n d s o n t h e r e d u c t i o n o r i n h i b i t i o n o f P O a c t i v i t y ( J a l e e l e t a l . , 2 0 0 7 e ) . T h e d e c r e a s e i n p r o l i n e o x i d a s e a c t i v i t y w i t h c o n c o m i t a n t i n c r e a s e i n P 5 C S a c t i v i t y m i g h t b e t h e r e a s o n f o r h i g h e r p r o l i n e a c c u m u l a t i o n i n A . t r i c o l o r t h a n P . v u l g a r i s d u r i n g N a C l s t r e s s . C O N C L U S I O N : T h e r e s u l t s o b t a i n e d s h o w e d t h a t t w o g e n o t y p e s s t u d i e d , A . t r i c o l o r w a s t h e s a l t - t o l e r a n t a n d P . v u l g a r i s t h e s a l t - s e n s i t i v e s p e c i e s . S o d i u m a n d C l - a c c u m u l a t i o n i n t h e r o o t s a s a r e s u l t o f s a l t s t r e s s a p p e a r e d t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e a c c l i m a t i o n o f t h e g e n o t y p e t o s a l t s t r e s s , s u g g e s t i n g t h a t t h e y c o u l d b e u s e d a s p h y s i o l o g i c a l m a r k e r s d u r i n g t h e s c r e e n i n g f o r s a l t t o l e r a n c e . T o t a l p r o t e i n , c a r b o h y d r a t e s , p r o l i n e a n d P R O a n d P 5 C S e n z y m e s r e s p o n d e d d i s t i n c t l y t o N a C l s t r e s s , s u g g e s t i n g d i v e r g e n t o f r e s p o n s e m e c h a n i s m s i n t h e s p e c i e s . G e n e t i c e v a l u a t i o n o f g e n o t y p e s b a s e d o n s a l t t o l e r a n c e i n d i c e s c o u l d b e e x p l o i t e d i n t h e b r e e d i n g o f s a l t t o l e r a n t g e n o t y p e s . A C K N O W L E D G E M E N T S : T h e a u t h o r s s i n c e r e l y a c k n o w l e d g e t h e U n i v e r s i t y G r a n t C o m m i s s i o n , N e w D e l h i f o r t h e f i n a n c i a l a s s i s t a n c e . R E F E R N C E S B a t e s l S , W a l d e r n R P , T e a r e I D . 1 9 7 3 . R a p i d d e t e r m i n a t i o n o f f r e e p r o l i n e f o r w a t e r s t r e s s s t u d i e s . P l a n t S o i l 3 9 : 2 0 5 - 2 0 7 . B e s f o r d R T . 1 9 7 8 . E f f e c t o f r e p l a c i n g n u t r i e n t p o t a s s i u m b y s o d i u m o n u p t a k e a n d d i s t r i b u t i o n o f s o d i u m i n t o m a t o p l a n t s . P l a n t S o i l 5 0 : 3 9 9 - 4 0 9 . B r a d f o r d M M . 1 9 7 6 . A r a p i d a n d s e n s i t i v e f o r t h e q u a n t i f i c a t i o n o f m i c r o g r a m q u a n t i t i e s o f p r o t e i n u t i l i z i n g t h e p r i n c i p l e o f p r o t e i n - d y e b i n d i n g . A n a l y t i c a l B i o c h e m . , 7 2 : 2 4 8 - 2 5 4 . B r e m b e r g e r C , L u t t g e U . 1 9 9 2 . D y n a m i c s o f t o n o p l a s t p r o t o n p u m p s a n d o t h e r t o n o p l a s t p r o t e i n s o f M e s e m b r y a n t h e m u m c r y s t a l l i n u m L . d u r i n g t h e i n d u c t i o n o f C r a s s u l a c e a n a c i d m e t a b o l i s m . P l a n t a . 1 8 8 : 5 7 5 - 5 8 0 . C h e n C T , C h e n L M , L i n C C , K a o C H . 2 0 0 1 . R e g u l a t i o n o f P r o l i n e A c c u m u l a t i o n i n D e t a c h e d R i c e L e a v e s E x p o s e d t o E x c e s s C o p p e r . P l a n t S c i . 1 6 0 : 2 8 3 - 2 9 0 . C l a u s s e n W . 2 0 0 5 . P r o l i n e a s a m e a s u r e o f s t r e s s i n t o m a t o p l a n t s . P l a n t S c i . , 1 6 8 : 2 4 1 - 2 4 8 . D e l a u n e y A J , V e r m a D P S . 1 9 9 3 . P r o l i n e b i o s y n t h e s i s a n d o s m o r e g u l a t i o n i n p l a n t s . P l a n t J . 4 : 2 1 5 - 2 2 3 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 9 9 - 3 0 6 3 0 5 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1

D i o n i s i o - S e s e M L , T o b i t a S . 2 0 0 0 . E f f e c t s o f s a l i n i t y o n s o d i u m c o n t e n t a n d p h o t o s y n t h e t i c r e s p o n s e s o f r i c e s e e d l i n g s d i f f e r i n g i n s a l t t o l e r a n c e . J . P l a n t P h y s i o l . , 1 5 7 : 5 4 - 5 8 . D u b o i s M , G i l l e s K A , H a m i l t o n J K , R e p e r s P A , S m i t h F . 1 9 5 6 . C o l o r i m e t r i c m e t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n o f s u g a r s a n d r e l a t e d s u b s t a n c e s . A n a l . C h e m . , 2 8 : 3 5 0 - 3 5 6 . F o w l e r J L . 1 9 9 1 . I n t e r a c t i o n o f s a l i n i t y a n d t e m p e r a t u r e o n t h e g e r m i n a t i o n o f C r a m b e , A g r o n . J . 8 3 : 1 6 9 - 1 7 2 . G r e e n w a y H , M u n n s R . 1 9 8 0 . M e c h a n i s m s o f s a l t t o l e r a n c e i n n o n - h a l o p h y t e s , A n n u . R e v . P l a n t P h y s i o l . , 3 1 : 1 4 9 - 1 9 0 . H u a n g A H C , C a v a l i e r i A . 1 9 7 9 . P r o l i n e o x i d a s e a n d w a t e r s t r e s s i n d u c e d p r o l i n e a c c u m u l a t i o n i n S p i n a c h l e a v e s . P l a n t P h y s i o l . , 6 3 : 5 3 1 - 5 3 5 J a l e e l C A , M a n i v a n n a n P , L a k s h m a n a n G M A , S r i d h a r a n R , P a n n e e r s e l v a m R . 2 0 0 7 e . N a C l a s a p h y s i o l o g i c a l m o d u l a t o r o f p r o l i n e m e t a b o l i s m a n d a n t i o x i d a n t p o t e n t i a l i n P h y l l a n t h u s a m a r u s . C o m p t e s R e n d u s B i o l o g i e s . 3 3 0 : 8 0 6 - 8 1 3 . J e f f r i e s T W , Y a n g V W , D a v i s M W . 1 9 9 8 . C o m p a r a t i v e s t u d y o f x y l a n a s e k i n e t i c s u s i n g d i n i t r o s a l i c y l i c , a r s e n o m o l y b d a t e , a n d i o n c h r o m a t o g r a p h i c a s s a y s . A p p l i e d B i o c h e m . a n d B i o t e c h . , 2 5 7 : 7 0 - 7 2 . K a v i K i s h o r P B , S a n g a m S , A m r u t h a R N , S r i L a x m i P , N a i d u K R , R a o K R S S , S r e e n a t h R a o , R e d d y K J , T h e r i a p p a n P S r e e n i v a s u l u N . 2 0 0 5 . R e g u l a t i o n o f p r o l i n e b i o s y n t h e s i s , d e g r a d a t i o n , u p t a k e a n d t r a n s p o r t i n h i g h e r p l a n t s : I t s i m p l i c a t i o n s i n p l a n t g r o w t h a n d a b i o t i c s t r e s s t o l e r a n c e . C u r r . S c i . , 8 8 : ( 3 ) 1 0 1 2 - 1 0 1 8 . M u r a s h i g e T , S k o o g F . 1 9 6 2 . A r e v i s e d m e d i u m f o r r a p i d g r o w t h a n d b i o a s s a y w i t h t a b a c c o t i s s u e c u l t u r e s . P l a n t P h y s i o l . , 1 5 : 4 7 3 - 4 7 9 . N y a g a h A W , M u s y i m i D M . 2 0 0 9 . E f f e c t s o f s o d i u m c h l o r i d e s o l u t i o n s t r e s s o n g e r m i n a t i o n a n d g r o w t h o f p a s s i o n f r u i t s s e e d l i n g s . J . o f A g r i . a n d B i o l . S c i . , 4 : 4 9 - 5 3 . S a n k a r G a n e s h K , B a s k a r a n L , C h i d a m b a r a m A L A , S u n d a r a m o o r t h y P . 2 0 0 9 . I n f l u e n c e o f C h r o m i u m S t r e s s o n P r o l i n e A c c u m u l a t i o n i n S o y b e a n ( G l y c i n e m a x L . M e r r . ) G e n o t y p e s . G l o b a l J . o f E n v . R e s . , 3 ( 2 ) : 1 0 6 - 1 0 8 . S o n g S Q , L e i Y B , T i a n X R . 2 0 0 5 . P r o l i n e M e t a b o l i s m a n d C r o s s - T o l e r a n c e t o S a l i n i t y a n d H e a t S t r e s s i n G e r m i n a t i n g W h e a t S e e d s . R u s s . J . o f P l a n t P h y s i o l . , 5 2 : 7 9 3 - 8 0 0 . V o g e l R H , K o p a c M J . 1 9 6 0 . S o m e P r o p e r t i e s o f O r n i t h i n e γ - T r a n s a m i n a s e f r o m N e u r o s p o r a . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a 3 7 : 5 3 9 - 5 4 0 . W a h o m e P K , J e s c h H H , G r i t t n e r I . 2 0 0 1 . M e c h a n i s m s o f s a l t s t r e s s t o l e r a n c e i n t w o r o s e r o o t s t o c k s : R o s a c h i n e n s i s M a j o r a n d R . r u b i g i n o s a . S c i . H o r t i c . , 8 7 : 2 0 7 - 2 1 6 . W a l t e r T r o l l , K e i t h C a n n a n R . 1 9 5 2 . A m o d i f i e d p h o t o m e t r i c n i n h y d r i n m e t h o d f o r t h e a n a l y s i s o f a m i n o a n d i m i n o a c i d s . J o f B i o l . C h e m . , 2 3 : 8 0 3 - 8 1 1 . 3 0 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 9 9 - 3 0 6 S u n u k u m a r e t a l . , 2 0 1 1