J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y P a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n a n d o p t i m i z a t i o n o f p r o t e a s e p r o d u c t i o n f r o m n e w l y i s o l a t e d C o h n e l l a t h e r m o t o l e r a n s f r o m L o n a r L a k e A B S T R A C T : L o n a r L a k e , a n i m p a c t c r a t e r l o c a t e d i n t h e B u l d h a n a d i s t r i c t o f M a h a r a s h t r a S t a t e , I n d i a i s o c c u p i e d b y s a l i n e w a t e r a n d h a r b o r s v a r i o u s u n i d e n t i f i e d , u n i q u e h a l o a l k a l i p h i l i c b a c t e r i a l b a c i l l u s s p e c i e s w h i c h p r o d u c e s t h e r m o - h a l o - a l k a l i p h i l i c p r o t e a s e s . T h e p r e s e n t s t u d y d e a l s w i t h t h e i s o l a t i o n , p r o d u c t i o n d y n a m i c s , p u r i f i c a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n a n d o p t i m i z a t i o n o f a p r o t e a s e f r o m C o h n e l l a t h e r m o t o l e r a n s i s o l a t e d a n d i d e n t i f i e d b y 1 6 s R N A r i b o t y p i n g f r o m t h e A l k a l i n e L o n a r L a k e . T h e C . t h e r m o t o l e r a n s p r o d u c e d p r o t e a s e a t m a x i m u m r a t e a f t e r 7 2 h o f i n c u b a t i o n a t 3 7 0 C w i t h t h e a g i t a t i o n s p e e d o f 1 2 0 r p m a n d 5 % o f s t a r t e r c u l t u r e . T h e b e s t c a r b o n s o u r c e s f o r t h i s C . t h e r m o t o l e r a n s w e r e f r u c t o s e a n d m a l t o s e a n d b e s t n i t r o g e n s o u r c e w a s y e a s t e x t r a c t , w h i l e t h e m o s t e f f e c t i v e i n o r g a n i c n i t r o g e n s o u r c e w a s a m m o n i u m c a r b o n a t e . S u p p l e m e n t a t i o n o f t h e c u l t u r e m e d i u m w i t h a m i n o a c i d L - g l u t a m i c a c i d a n d m e t a l i o n M g 2 + i m p r o v e d t h e p r o t e a s e p r o d u c t i o n s u b s t a n t i a l l y . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , n e w l y i s o l a t e d C o h n e l l a t h e r m o t o l e r a n s s t r a i n w a s f o u n d t o p r o d u c e a l k a l i n e p r o t e a s e a t a m a x i m u m r a t e o f o p t i m u m p H 1 0 a n d t e m p e r a t u r e a t 7 5 0 C . K e y w o r d s : A l k a l i n e P r o t e a s e , C o h n e l l a t h e r m o t o l e r a n s , E n v i r o n m e n t a l f a c t o r s , N u t r i t i o n a l c o n d i t i o n s . 2 9 2 - 2 9 8 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 4 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : T a m b e k a r D H a n d T a m b e k a r S D . I n s t i t u t i o n : P o s t G r a d u a t e D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y S . G . B . A m r a v a t i U n i v e r s i t y A m r a v a t i – 4 4 4 6 0 4 ( I n d i a ) . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : T a m b e k a r D H E m a i l : d i l i p t a m b e k a r @ r e d i f f m a i l . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 7 3 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 2 A u g 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 1 1 A u g 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 3 0 A u g 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : T a m b e k a r D H a n d T a m b e k a r S D . P a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n a n d o p t i m i z a t i o n o f p r o t e a s e p r o d u c t i o n f r o m n e w l y i s o l a t e d C o h n e l l a t h e r m o t o l e r a n s f r o m L o n a r L a k e J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 9 2 - 2 9 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h p a p e r

I N T R O D U C T I O N L O N A R L a k e , a n i m p a c t c r a t e r l o c a t e d i n t h e B u l d h a n a d i s t r i c t o f M a h a r a s h t r a S t a t e , I n d i a i s a c i r c u l a r l a k e o c c u p i e d b y s a l i n e w a t e r w h i c h w a s f o r m e d b y m e t e o r i t i c i m p a c t o n b a s a l t i c r o c k a n d i t h a s b e e n w e l l k n o w n a s a n i n l a n d s a l i n e l a k e w i t h a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f s o d i u m c a r b o n a t e a n d c h l o r i d e ( K a n e k a r e t a l , 2 0 0 2 ) . E x t r a c e l l u l a r e n z y m e s l i k e a m y l a s e , l i p a s e , p r o t e a s e a n d c e l l u l a s e s p r o d u c i n g B a c i l l u s c e r e u s , B a c i l l u s f i r m u s , E n t e r o c o c c u s c a s e l i f l a v u s , B a c i l l u s f u s i f o r m i s , B a c i l l u s c o h n i i , B a c i l l u s h o r i k o s h i i w e r e i s o l a t e d f r o m w a t e r a n d s e d i m e n t s o f a l k a l i n e L o n a r L a k e ( J o s h i e t a l , 2 0 0 8 ) . P r o t e a s e s a r e i n d u s t r i a l l y i m p o r t a n t e n z y m e s u s e d i n t h e d e t e r g e n t , f o o d , p h a r m a c e u t i c a l a n d l e a t h e r i n d u s t r i e s a n d a l s o h a v e a p p l i c a t i o n i n s i l v e r r e c o v e r y f r o m p h o t o g r a p h i c p l a t e s a n d i n p e p t i d e s y n t h e s i s w h i c h a c c o u n t f o r a b o u t 6 0 % o f t o t a l i n d u s t r i a l e n z y m e s a l e s ( H o r i k o s h i i , 1 9 9 9 ) . T h e d e t e r g e n t i n d u s t r y i s t h e l a r g e s t s i n g l e m a r k e t f o r t h i s e n z y m e . T h e e n z y m e h a s b e t t e r r e s i s t a n c e t o a l k a l i a n d s o m e o t h e r d e n a t u r i n g c h e m i c a l s i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e a n d h a s a h i g h e r a f f i n i t y t o w a r d s p r o t e i n a c e o u s s u b s t r a t e s . I t i s a l s o a t h e r m o s t a b l e o r g a n i s m g r o w i n g i n n a t u r a l l y a l k a l i n e h a b i t a t s m a y h a v e p r o t e a s e s w i t h s p e c i a l c h a r a c t e r i s t i c s ( N o r a z i z a h e t a l , 2 0 0 5 ) . T h e r e f o r e , a t t e m p t w a s m a d e t o i s o l a t e n e w s p e c i e s o f b a c i l l u s w h i c h c a n p r o d u c e g o o d q u a l i t y o f p r o t e a s e s u s e f u l i n t h e d e t e r g e n t a n d l e a t h e r i n d u s t r y . A 1 6 S r R N A g e n e s e q u e n c e a n a l y s i s h a d b e e n m a d e f o r i d e n t i f i c a t i o n o f t h e i s o l a t e d s p e c i e s . A l k a l i n e p r o t e a s e s p r o d u c e d b y C o h n e l l a t h e r m o t o l e r a n s a r e o f g r e a t i m p o r t a n c e i n d e t e r g e n t i n d u s t r y d u e t o t h e i r h i g h t h e r m o - s t a b i l i t y a n d p H s t a b i l i t y a n d m o s t i m p o r t a n t i n d u s t r i a l e n z y m e s a c c o u n t i n g f o r a b o u t 6 0 % o f t o t a l e n z y m e m a r k e t ( K a n e k a r e t a l , 2 0 0 2 ; B o r s o s i e t a l , 2 0 0 5 ) . V e r y l e s s s t u d y h a d b e e n d o n e o n p r o t e a s e f r o m B a c i l l i o f L o n a r L a k e w h i c h c a n w i t h s t a n d h i g h t e m p e r a t u r e a s w e l l a s h i g h p H a n d h a s w i d e a p p l i c a t i o n s i n d i f f e r e n t i n d u s t r i e s . A s t h e r e i s l a r g e d e m a n d o f p r o t e a s e s , i s o l a t i o n a n d p r o d u c t i o n o f p r o t e a s e e n z y m e i s m o s t i m p o r t a n t t o f u l f i l l t h i s d e m a n d ( S r i n i v a s a n e t a l , 2 0 0 9 ) . T h e p r e s e n t s t u d y a i m s t o d e a l w i t h t h e i s o l a t i o n , p u r i f i c a t i o n , a n d c h a r a c t e r i z a t i o n a n d p r o d u c t i o n o p t i m i z a t i o n o f a p r o t e a s e f r o m C o h n e l l a t h e r m o t o l e r a n s i s o l a t e d f r o m t h e a l k a l i n e L o n a r L a k e . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S C o l l e c t i o n o f L o n a r l a k e w a t e r a n d s e d i m e n t s a m p l e : T o t a l l y f o u r s e d i m e n t s a n d e i g h t w a t e r s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d i n t h e y e a r 2 0 0 9 f r o m a l k a l i n e L o n a r L a k e . W a t e r s a m p l e s c o l l e c t e d i n s t e r i l i z e d p l a s t i c c a n s a n d s e d i m e n t s i n s t e r i l i z e d p l a s t i c b a g s w e r e t r a n s f e r r e d t o l a b o r a t o r y f o r i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f b a c t e r i a f o l l o w e d b y t h e i r s c r e e n i n g f o r p r o t e o l y t i c a c t i v i t y . D u r i n g s a m p l e c o l l e c t i o n t h e d a t e , t i m e a n d p l a c e s w e r e n o t e d . I s o l a t i o n o f A l k a l i p h i l e s : A b o u t 1 . 0 g o f s o i l s a m p l e w a s t r a n s f e r r e d t o 9 9 . 0 m l s t e r i l i z e d n o r m a l s a l i n e i n 2 5 0 m l c o n i c a l f l a s k a n d a g i t a t e d ( 1 0 0 r p m ) a t 3 7 0 C f o r 1 5 m i n u t e s i n w a t e r b a t h s h a k e r . T h e s a m p l e w a s t h e n h e a t e d a t 8 0 0 C f o r 1 5 m i n u t e s t o d e s t r o y a l l t h e v e g e t a t i v e m i c r o b i a l c e l l s . T h e s u s p e n s i o n w a s t h e n d i l u t e d t o 1 0 - 7 d i l u t i o n s . O n e m l o f e a c h d i l u t e d s a m p l e w a s l a w n i n t o p e t r i p l a t e s c o n t a i n i n g n u t r i e n t a g a r m e d i u m ( p H 1 0 ) a n d i n o c u l a t e d a t 3 7 0 C f o r 2 4 h o u r s . S c r e e n i n g o f b a c t e r i a l a l k a l i p h i l e s : I n d i v i d u a l b a c t e r i a l c o l o n i e s w e r e s c r e e n e d f o r p r o t e o l y t i c a c t i v i t i e s o n S k i m m i l k a g a r m e d i u m ( s k i m m i l k 1 % , P e p t o n e 1 % , s o d i u m c h l o r i d e 0 . 5 % , A g a r - A g a r 2 % , p H 1 0 ) . T h e p H o f t h e m e d i u m w a s a d j u s t e d t o 1 0 w i t h 1 N N a O H b e f o r e s t e r i l i z a t i o n a t 1 2 1 o C f o r 1 5 m i n u t e s . T h e i n o c u l a t e d p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 o C f o r 7 2 h r s a n d o b s e r v e d f o r z o n e s o f c l e a r a n c e , i n d i c a t i n g p r o t e o l y t i c a c t i v i t i e s . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e p r o t e o l y t i c i s o l a t e s : T h e b a c t e r i a l i s o l a t e s w i t h p r o m i n e n t z o n e s o f c l e a r a n c e o n c a s e i n a g a r m e d i u m w e r e p r o c e s s e d f o r i d e n t i f i c a t i o n s b a s e d o n m o r p h o l o g y , G r a m c h a r a c t e r i s t i c s , m o t i l i t y , c i t r a t e u t i l i z a t i o n , o x i d a s e , u r e a s e , g e l a t i n l i q u i f i c a t i o n , c a t a l a s e , V o g o u s - p r o s k a u r , i n d o l t e s t s a n d a c i d p r o d u c t i o n f r o m g l u c o s e , a r a b i n o s e , l a c t o s e , m a n n i t o l , g a l a c t o s e a n d m a l t o s e . T h e i s o l a t e s w e r e a l s o t e s t e d f o r t h e i r g r o w t h a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s a n d p H . T h e s e i s o l a t e s w e r e i d e n t i f i e d i n a c c o r d a n c e w i t h t h e m e t h o d s r e c o m m e n d e d i n B e r g e y ’ s M a n u a l o f D e t e r m i n a t i v e B a c t e r i o l o g y a n d D i a g n o s t i c M i c r o b i o l o g y . T h e i d e n t i f i e d s t r a i n s w e r e m a i n t a i n e d o n n u t r i e n t a g a r s l a n t s h a v i n g p H 1 0 a t 4 . 0 o C . P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s : 1 6 S r R N A s e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d a t N C C S , P u n e . N e a r l y - f u l l - l e n g t h 1 6 S r R N A g e n e s e q u e n c e s w e r e s u b m i t t e d t o C H E C K - C H I M E R A , a v a i l a b l e o n t h e R i b o s o m a l D a t a b a s e P r o j e c t r e l e a s e 1 0 . 2 6 , i n o r d e r t o i d e n t i f y c h i m e r a s . P h y l o g e n e t i c a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d u s i n g t h e A R B s o f t w a r e p a c k a g e . T h e 1 6 S r R N A g e n e 2 9 3 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 9 2 - 2 9 8 T a m b e k a r e t a l . , 2 0 1 1

p h y l o g e n e t i c a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d b y t h e m a x i m u m - l i k e l i h o o d m e t h o d , u s i n g 1 , 2 9 2 n u c l e o t i d e p o s i t i o n s . T h e f u n c t i o n a l g e n e s w e r e t r a n s l a t e d i n t o a m i n o a c i d s e q u e n c e s , a n d t h e s e w e r e i n c l u d e d i n p h y l o g e n e t i c a n a l y s e s u s i n g t h e n e i g h b o r - j o i n i n g m e t h o d ( D a y h o f f P A M m o d e l ) . P r e p a r a t i o n o f c r u d e e n z y m e e x t r a c t s : T h e 1 0 0 m l Y e a s t e x t r a c t c a s e i n m e d i u m ( G l u c o s e 1 % , C a s e i n 0 . 5 % , y e a s t e x t r a c t 0 . 5 % , K H 2 P O 4 0 . 2 % , K 2 H P O 4 0 . 2 % , M g S O 4 0 . 1 % , p H . 1 0 . 5 ) w a s d i s p e n s e d ( 5 0 m l e a c h ) i n t o t w o 2 5 0 m l c a p a c i t y c o n i c a l f l a s k s , a f t e r a d j u s t i n g t h e p H t o 1 0 . 5 a n d s t e r i l i z e d i n a u t o c l a v e . A f t e r c o o l i n g , t h e b r o t h w a s i n o c u l a t e d w i t h C o h n e l l a t h e r m o t o l e r a n s c u l t u r e s a n d i n c u b a t e d f o r 7 2 h a t 3 7 0 C i n s h a k i n g i n c u b a t o r . A f t e r 7 2 h i n c u b a t i o n , c e n t r i f u g e d t h e b r o t h a t 5 0 0 0 - 8 0 0 0 r p m f o r 1 5 m i n . T h e s u p e r n a t a n t s e r v e d a s c r u d e e n z y m e s o u r c e . O p t i m i z a t i o n o f c r u d e e n z y m e p r o t e a s e : T h e s t a n d a r d g r a p h o f t y r o s i n e w a s p r e p a r e d b y a d d i n g d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n o f s t a n d a r d t y r o s i n e ( 1 m g / m l ) i n t o a s e r i e s o f t e s t t u b e s a n d m a d e t h e f i n a l v o l u m e i n e a c h t e s t t u b e t o 1 m l w i t h d i s t i l l e d w a t e r . E s t i m a t i o n o f p r o t e a s e s w a s c a r r i e d o u t w i t h 1 m l o f c a s e i n i n a t e s t t u b e ; 1 m l o f e n z y m e s o u r c e w a s a d d e d a n d i n c u b a t e d f o r 1 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e . A f t e r i n c u b a t i o n 2 m l o f T C A w a s a d d e d t o s t o p t h e r e a c t i o n a n d c e n t r i f u g e d t h e r e a c t i o n m i x t u r e a t 5 0 0 0 - 8 0 0 0 r p m f o r 1 5 m i n . S u p e r n a t a n t w a s s e p a r a t e d a n d 1 m l o f F o l i n - C i a c a l t e a u r e a g e n t a n d 2 m l o f N a 2 C O 3 w e r e a d d e d i n 1 m l o f s u p e r n a t a n t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s b o i l e d f o r 1 m i n i n a b o i l i n g w a t e r b a t h a n d 6 m l o f d i s t i l l e d w a t e r w a s a d d e d t o m a k e a f i n a l s o l u t i o n t o 1 0 m l . I n c o n t r o l t u b e , t h e r e a c t i o n w a s t e r m i n a t e d t h e r e a c t i o n a t z e r o t i m e a n d t h e a b s o r b a n c e w a s r e a d a t 6 5 0 n m ( L a l i t h a e t a l , 2 0 1 0 ) . D e t e r m i n a t i o n o f p r o t e o l y t i c a c t i v i t y : P r o t e a s e s a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d b y a s l i g h t l y m o d i f i e d m e t h o d o f Y a n g e t a l , 2 0 0 1 . T h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n i n g 1 m l o f 1 . 0 % c a s e i n s o l u t i o n i n 0 . 2 M G l y c i n e - N a O H b u f f e r h a v i n g p H 1 0 . 5 a n d 1 m l o f a g i v e n e n z y m e s o l u t i o n w a s i n c u b a t e d a t 4 0 o C f o r 1 0 m i n u t e s a n d t h e r e a c t i o n w a s t h e n s t o p p e d w i t h 2 m l o f 1 0 % t r i - c h l o r o a c e t i c a c i d ( T C A ) . T h e a m o u n t o f t y r o s i n e l i b e r a t e d w a s d e t e r m i n e d a s p e r t y r o s i n e a s s a y p r o c e d u r e a t 6 5 0 n m . T h e p r o t e o l y t i c u n i t w a s d e f i n e d a s t h e a m o u n t o f t h e e n z y m e t h a t r e l e a s e d 1 u g o f t y r o s i n e p e r m i n u t e u n d e r t h e a s s a y c o n d i t i o n s . P a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o t e a s e : P a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o t e a s e w a s c a r r i e d o u t u s i n g m e t h o d o l o g y . ( J o o e t a l , 2 0 0 2 ) . E f f e c t o f p H o n a l k a l i n e p r o t e a s e a c t i v i t y : T h e e f f e c t o f p H o n a l k a l i n e p r o t e a s e f r o m B a c i l l u s s p p . w a s d e t e r m i n e d b y a s s a y i n g t h e e n z y m e a c t i v i t y a t d i f f e r e n t p H v a l u e s r a n g i n g f r o m 7 . 0 t o 1 0 . 5 u s i n g t h e f o l l o w i n g b u f f e r s y s t e m s w i t h c o n c e n t r a t i o n o f e a c h b u f f e r a t 0 . 2 M : p h o s p h a t e ( p H 6 - 7 ) t r i s – H C l ( p H 8 - 9 ) a n d G l y c i n e - N a O H ( p H 1 0 - 1 2 ) . E f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n a l k a l i n e p r o t e a s e a c t i v i t y : T h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n a l k a l i n e p r o t e a s e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d b y i n c u b a t i n g t h e r e a c t i o n m i x t u r e ( p H 1 0 . 5 ) f o r 2 0 m i n u t e s a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e r a n g i n g f r o m 5 5 o C t o 9 0 o C . E f f e c t o f s u b s t r a t e o n a l k a l i n e p r o t e a s e a c t i v i t y : T h e e f f e c t o f s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n o n a l k a l i n e p r o t e a s e a c t i v i t y i s d e t e r m i n e d b y i n c u b a t i n g t h e r e a c t i o n m i x t u r e ( p H 1 0 . 5 ) f o r 2 0 m i n u t e s w i t h d i f f e r e n t s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n , r a n g i n g f r o m 5 m g / m l t o 4 0 m g / m l . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 9 2 - 2 9 8 2 9 4 T a m b e k a r e t a l . , 2 0 1 1