J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y E f f e c t o f 1 7 α M e t h y l t e s t o s t e r o n e o n s e x r e v e r s a l o f X i p h o p h o r o u s m a c u l a t u s p l a t y a n d C y p r i n u s c a r p i o K o i c a r p K e y w o r d s : K o i c a r p , p l a t y , 1 7 a m e t h y l t e s t o s t e r o n e , s e x r e v e r s a l , g o n a d s . A B S T R A C T : H o r m o n e s e x m a n i p u l a t i o n r o l e o f t h e m a s c u l i n i z i n g h o r m o n e 1 7 a M T S w a s t e s t e d i n p l a t y X i p h o p h o r o u s m a c u l a t u s a n d k o i c a r p C y p r i n u s c a r p i o . T h e f r y o f p l a t y a n d k o i c a r p o f t h e f i r s t g r o u p w e r e f e d 1 7 α - M T S h o r m o n e i n c o r p o r a t e d d i e t f o r 9 0 d a y s . A n d t h e o t h e r g r o u p s w e r e i m m e r s e d w i t h t h e h o r m o n e f o r 6 h . T h e h o r m o n e i n c o r p o r a t e d f e e d a t 5 0 0 m g / l p r o d u c e d 6 8 % m a l e s i n k o i c a r p a n d 8 0 % i n p l a t y . A c c o r d i n g t o i m m e r s i o n t e c h n i q u e 4 0 0 m g / l p r o d u c e d 8 5 % i n p l a t y a n d 7 5 % i n k o i c a r p . E x p o s u r e t o o t h e r c o n c e n t r a t i o n s o f 1 7 α - M T S a t v a r y i n g d u r a t i o n s i n v a r i a b l y p r o d u c e d i n t e r s e x i n d i v i d u a l s . F r o m t h e p r e s e n t s t u d y i t i s c o n c l u d e d t h a t K o i c a r p a n d P l a t y a r e a m e n a b l e t o e n d o c r i n e s e x r e v e r s a l b y s t e r o i d i m m e r s i o n a n d d i e t a r y t r e a t m e n t s o f f r y . 5 8 0 - 5 8 6 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 8 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : A n a n t h K u m a r 1 A n d M o h a m e d A b d u l K a d h e r H a n i f f a 2 . I n s t i t u t i o n : 1 . D e p a r t m e n t o f Z o o l o g y , V . H . N . S . N C o l l e g e , V i r u t h u n a g a r – 6 2 6 0 0 1 , T a m i l n a d u , I n d i a . 2 . C e n t r e f o r A q u a c u l t u r e R e s e a r c h a n d E x t e n s i o n ( C A R E ) , S t . X a v i e r ’ s C o l l e g e , P a l a y a m k o t t a i - 6 2 7 0 0 2 , T a m i l n a d u , I n d i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : A n a n t h k u m a r Y . E m a i l : l a b e o s h a r k @ g m a i l . c o m . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 7 2 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 1 A u g 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 0 7 N o v 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 0 8 D e c 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : A n a n t h K u m a r A n d M o h a m e d A b d u l K a d h e r H a n i f f a . E f f e c t o f 1 7 α M e t h y l t e s t o s t e r o n e o n S e x R e v e r s a l o f X i p h o p h o r o u s m a c u l a t u s P l a t y a n d C y p r i n u s c a r p i o K o i c a r p . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 8 : 5 8 0 - 5 8 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h P a p e r

I N T R O D U C T I O N I n a q u a c u l t u r e t h e p r o d u c t i o n o f s i n g l e s e x p o p u l a t i o n s o f f e r s s e v e r a l a d v a n t a g e s , i n c l u d i n g e n h a n c e d g r o w t h a n d p r e v e n t i o n o f u n w a n t e d r e p r o d u c t i o n . T i l l d a t e d i e t a r y a d m i n i s t r a t i o n i s t h e m o s t a c c e p t e d m e t h o d f o r h o r m o n a l i n d u c t i o n o f s e x r e v e r s a l i n m a n y o r n a m e n t a l f i s h e s v i z . , p o e c i l i d s , a n a b a n t i d s a n d o t h e r s l i k e c i c h l i d s b u t t h i s m e t h o d i s n o t w i d e l y a c c e p t e d d u e t o u n e v e n e x p o s u r e t o s t e r o i d b y f e e d i n g h i e r a r c h i e s . H e n c e i m m e r s i o n o f f i s h f r y i n s t e r o i d s o l u t i o n s m a y b e a n o t h e r w a y t o a c h i e v e m a s c u l i n i z a t i o n o r f e m i n i z a t i o n . S e x s t e r o i d s , p a r t i c u l a r l y a n d r o g e n s , a r e k n o w n t o s t i m u l a t e g r o w t h i n f i s h . A m o n g t h e a n d r o g e n s t e s t e d , 1 7 α – m e t h y l t e s t o s t e r o n e ( M T S ) w a s f o u n d t o b e t h e m o s t p o t e n t . M T S i s p r o b a b l y t h e m o s t w i d e l y s t u d i e d n a t u r a l a n d r o g e n f o r g r o w t h e n h a n c e m e n t i n f i s h . I t w a s f o u n d t o a c c e l e r a t e g r o w t h i n c o m m o n c a r p ( M a t t y a n d L o n e , 1 9 7 9 ) , c o h o s a l m o n ( M c B r i d e a n d F a g e r l u n d , 1 9 7 6 ; F a g e r l u n d e t a l . , 1 9 7 8 ) a n d w h i t e p r a w n ( V a i t h e e s w a r a n a n d A l i , 1 9 8 6 ) . T h e m a j o r a i m o f s u c h h o r m o n a l m a n i p u l a t i o n h a s b e e n t h e p r o d u c t i o n o f m o n o s e x p o p u l a t i o n s d i s p l a y i n g e n h a n c e d g r o w t h a n d / o r p r o d u c t i o n o f a d e s i r e d b r e e d i n g l i n e ( G e o r g e a n d P a n d i a n , 1 9 9 5 ; B l a z q u e z e t a l . , 1 9 9 9 ; P i f e r r e r , 2 0 0 1 ) . S u p p l y o f f e e d s s u p p l e m e n t e d w i t h 1 7 M T S t o s e x u a l l y u n d i f f e r e n t i a t e d f r y i s o n e o f t h e m e t h o d s o f c h o i c e f o r a l l m a l e s e x r e v e r s a l ( A b u c a y a n d M a i r , 1 9 9 7 ; O h i a a n d T a k a n o 1 9 9 6 ; D e m s k a - Z a k e s a n d Z a k e s , 1 9 9 7 ) . M o r e o v e r , s e x o f a f i s h , i n w h i c h t h e s e x d i f f e r e n t i a t i o n p r o c e s s h a s n o t y e t c o m m e n c e d , c a n b e m a n i p u l a t e d b y a d m i n i s t e r i n g s t e r o i d h o r m o n e s e i t h e r t h r o u g h d i e t a r y s u p p l e m e n t a t i o n o r i m m e r s i o n o r t h r o u g h s y s t e m a t i c t r a n s f e r ( i n j e c t i o n , s i l a s t i c i m p l a n t a t i o n ) ( P a n d i a n a n d S h e e l a , 1 9 9 5 ) . T h e r o l e o f d i f f e r e n t h o r m o n e s i n s e x r e v e r s a l h a s b e e n s t u d i e d b y n u m b e r o f e a r l i e r i n v e s t i g a t o r s P i f e r r e r a n d D o n a l d s o n ( 1 9 9 4 ) . V e r y f e w a t t e m p t s o n e n d o c r i n e s e x r e v e r s a l h a v e b e e n m a d e i n o r n a m e n t a l f i s h e s b y h o r m o n a l i m m e r s i o n a n d / o r i n c o r p o r a t i o n i n d i e t d u r i n g t h e f r y s t a g e . T h e c o m m e r c i a l p r o d u c t i o n o f X i p h o p h o r o u s m a c u l a t u s i s t h e l a t e s t i n t h e s e r i e s . I n t h e p r e s e n t w o r k s e x r e v e r s a l i n p l a t y a n d k o i c a r p w e r e a t t e m p t e d u s i n g d i f f e r e n t d o s e s 1 7 α - m e t h y l t e s t o s t e r o n e ( M T S ) o f d i f f e r e n t d o s e s b y i m m e r s i o n a s w e l l a s b y i n c o r p o r a t i o n i n d i e t w i t h t h e f o l l o w i n g t w o o b j e c t i v e s . T o s t u d y t h e a m e n a b i l i t y o f p l a t y a n d k o i c a r p t o h o r m o n a l s e x r e v e r s a l a t t h e f r y s t a g e a n d t o s t u d y t h e f e a s i b i l i t y o f p r o d u c i n g m o n o s e x p o p u l a t i o n o f p l a t y a n d k o i c a r p b y i m m e r s i o n a n d d i e t a r y a d m i n i s t r a t i o n . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S C o l l e c t i o n o f h a t c h l i n g s H e a l t h y h a t c h l i n g s o f k o i c a r p a n d p l a t y f i s h w e r e p u r c h a s e d f r o m l o c a l o r n a m e n t a l f i s h m a r k e t a n d t r a n s p o r t e d t o C A R E A q u a f a r m . T h e f i s h e s w e r e s t o c k e d i n r e a r i n g t a n k s a n d a c c l i m a t i z e d t o l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s f o r o n e w e e k b e f o r e c o m m e n c i n g t h e e x p e r i m e n t . T h e y w e r e p r o v i d e d w i t h w e l l a e r a t e d w a t e r ( d i s s o l v e d o x y g e n : 5 . 4 - 5 . 8 m g / l ; p H : 7 . 2 - 7 . 4 ; t e m p e r a t u r e : 2 4 - 2 6 ° C ) a n d f e d w i t h p l a n k t o n a n d b o i l e d e g g w h i t e F e e d i n g w a s s t o p p e d 2 4 h r s p r i o r t o t h e s t a r t o f e x p e r i m e n t i n v i e w o f m a k i n g t h e g u t e m p t y . H o r m o n e p r e p a r a t i o n F o r t h e p r e s e n t s t u d y a n d r o g e n i c s t e r o i d h o r m o n e 1 7 a l p h a m e t h y l t e s t o s t e r o n e ( S i g m a C h e m i c a l c o . , U S A ) w a s s e l e c t e d . F o r h o r m o n e p r e p a r a t i o n , i n i t i a l l y s t o c k s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g t h e a p p r o p r i a t e a m o u n t o f h o r m o n e i n d i m e t h y l s u l p h o x i d e [ D M S O ] ( R a n b a x y , I n d i a ) . T h e s t o c k s o l u t i o n s o f h o r m o n e w e r e k e p t i n c o o l d a r k p l a c e a n d e x t r e m e c a r e w a s t a k e n t o a v o i d t h e h o r m o n e b e i n g e x p o s e d t o l i g h t s i n c e t h e s e h o r m o n e s a r e p h o t o s e n s i t i v e . ( H a n i f f a e t a l . 2 0 0 4 ) . T h e f e e d f o r t h e e x p e r i m e n t a l f i s h e s w e r e p r e p a r e d u s i n g t h e i n g r e d i e n t s v i z . r i c e b r a n ( 2 5 g ) , g r o u n d n u t o i l c a k e ( 3 7 g ) , f i s h m e a l ( 4 7 . 5 g ) , a n d t a p i o c a f l o u r ( 3 0 . 5 g ) . T h e f e e d w e r e p r e p a r e d b y i n c o r p o r a t i n g 1 7 a l p h a - m e t h y l t e s t o s t e r o n e a t s i x d i f f e r e n t d o s a g e s ( 0 , 1 0 0 , 2 0 0 , 3 0 0 , 4 0 0 , 5 0 0 & 6 0 0 μ g / l ) f o r P l a t y a n d K o i c a r p . E x p e r i m e n t 1 E a c h s a m p l e w a s m i x e d t h o r o u g h l y i n o r d e r t o d i s t r i b u t e t h e h o r m o n e u n i f o r m l y . O n e p o r t i o n o f t h e f e e d w a s k e p t w i t h o u t h o r m o n e i n c o r p o r a t i o n w h i c h s e r v e d a s c o n t r o l f e e d . T h e s a m p l e o f f e e d w a s m a d e i n t o p e l l e t s a n d s u p p l i e d t o t h e t e s t f i s h a s s e m i m o i s t p e l l e t s . T w o s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t w i t h 1 7 a M T S b y i m m e r s i o n t e c h n i q u e a n d d i e t a r y a d m i n i s t r a t i o n . T h e f i s h b e l o n g i n g t o 7 g r o u p s i n c l u d i n g c o n t r o l e a c h w i t h 3 0 i n d i v i d u a l s i n t r i p l i c a t e w e r e t r e a t e d f o r e a c h c o n c e n t r a t i o n ( 1 0 0 , 2 0 0 , 3 0 0 , 4 0 0 , 5 0 0 & 6 0 0 µ g / l ) . E x p e r i m e n t 2 T h e f e e d i n g t r a i l s w e r e c o n d u c t e d i n g l a s s t a n k s ( 1 8 ” × 1 2 ” × 1 2 ” ) a n d e a c h g l a s s t a n k w a s s t o c k e d w i t h 3 0 f r y ( L e n g t h 0 . 2 ± 0 . 4 c m ; W e i g h t 0 . 0 5 ± 0 . 0 8 g m ) . T h e d e p t h o f t h e w a t e r i n t h e g l a s s t a n k w a s m a i n t a i n e d a s 3 0 c m . T e m p e r a t u r e , d i s s o l v e d o x y g e n , p H a n d a m m o n i a c o n t e n t s w e r e r e c o r d e d d u r i n g t h e p e r i o d o f 9 0 d a y s d u r a t i o n . 5 8 1 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 8 : 5 8 0 - 5 8 6 K u m a r e t a l . , 2 0 1 1

W a t e r w a s c h a n g e d o n c e i n 2 d a y s i n o r d e r t o k e e p m a i n t a i n t h e d i s s o l v e d o x y g e n c o n t e n t w i t h o u t m u c h f l u c t u a t i o n . T h e e x p e r i m e n t a l f i s h w e r e l e a s t d i s t u r b e d e x c e p t o n c e r t a i n o c c a s i o n s l i k e c h a n g e o f w a t e r . F o r e a c h c o n c e n t r a t i o n o f h o r m o n e t h r e e t a n k s e a c h w i t h t h i r t y f i s h e s i n e a c h w e r e m a i n t a i n e d a s t r i p l i c a t e a n d t r i p l i c a t e w a s m a i n t a i n e d f o r t h e c o n t r o l a l s o . O w i n g t h e a m b i g u o u s n a t u r e o f m a n u a l s e x i n g , j u v e n i l e f i s h w e r e o f t e n s a c r i f i c e d t o d e t e r m i n e t h e s e x r a t i o . A f t e r 9 0 d a y s t h e g o n a d s w e r e l o c a t e d a f t e r d i s s e c t i o n u n d e r a d i s s e c t i o n m i c r o s c o p e . A p o r t i o n o f t h e g o n a d a l t i s s u e w a s r e m o v e d w i t h a p a i r o f f i n e f o r c e p s a n d p l a c e d o n a c l e a n g l a s s s l i d e . A f e w d r o p s o f a c e t i c o r c e i n o r g e i m s a s t a i n w e r e a d d e d a n d t h e t i s s u e w a s s q u a s h e d a f t e r p l a c i n g a c o v e r s l i p o n t h e g l a s s s l i d e ( G u e r r e r o a n d S h e l t o n , 1 9 7 4 ; H a n i f f a e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e s q u a s h e d t i s s u e w a s e x a m i n e d u n d e r a r e s e a r c h m i c r o s c o p e l o w m a g n i f i c a t i o n . O v a r i a n t i s s u e w a s i d e n t i f i e d b y t h e p r e s e n c e o f o o c y t e s a n d t h e t e s t i c u l a r t i s s u e b y t h e s p e r m a t o c y t e s o n a u n i f o r m b a c k g r o u n d o f t i s s u e . S e x r a t i o o b t a i n e d i n t h e e x p e r i m e n t s w e r e s u b j e c t e d t o C h i - s q u a r e t e s t f o r g o o d n e s s o f f i t ( Z a r 2 0 0 0 ) . R E S U L T S T h e e f f e c t o f M T S t r e a t m e n t o n t h e s e x o f X . m a c u l a t u s i s s h o w n i n T a b l e 1 . T h e h i g h e s t p e r c e n t a g e c o n v e r s i o n t o m a l e s ( 8 5 % ) o c c u r r e d i n t h e t r e a t m e n t d o s e o f 4 0 0 μ g M T S / l o f w a t e r . I n t h i s b a t c h 8 5 % f i s h s h o w e d n o r m a l t e s t e s s i m i l a r t o t h e c o n t r o l f i s h . E x p e r i m e n t 1 T h e 4 0 0 μ g M T S / l a n d 5 0 0 μ g M T S / l t r e a t m e n t f o r 6 h s i g n i f i c a n t l y ( P < 0 . 0 0 1 ) a l t e r e d t h e s e x r a t i o f r o m w h e n c o m p a r e d t o t h e c o n t r o l ( 4 M : 1 F ) . N o n e o f t h e 1 0 0 , 2 0 0 , 3 0 0 , 4 0 0 , 5 0 0 a n d 6 0 0 μ g M T S / l t r e a t m e n t c o m b i n a t i o n s p r o d u c e d 2 – 5 % m o n o s e x p o p u l a t i o n s a n d c o n t a i n e d i n t e r s e x i n d i v i d u a l s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y t h e i n t e r m i n g l i n g o f s p e r m a t o g o n i a a n d o o c y t e s i n t h e s a m e g o n a d ( F i g . 1 c & d ) . T h e e f f e c t o f M T S t r e a t m e n t o n t h e s e x o f C . c a r p i o i s s h o w n i n T a b l e 3 . T h e h i g h e s t p e r c e n t a g e c o n v e r s i o n t o m a l e s ( 8 0 % ) o c c u r r e d i n t h e t r e a t m e n t d o s e o f 5 0 0 μ g M T S / l o f w a t e r . I n t h i s b a t c h 8 0 % f i s h s h o w e d n o r m a l t e s t e s s i m i l a r t o t h e c o n t r o l f i s h ( F i g . 1 a & b ) . T h e 5 0 0 μ g M T S / l a n d 6 0 0 μ g M T S / l t r e a t m e n t f o r 6 h s i g n i f i c a n t l y ( P < 0 . 0 0 1 ) a l t e r e d t h e s e x r a t i o 4 M : 1 F w h e n c o m p a r e d t o t h e c o n t r o l . N o n e o f t h e 1 0 0 , 2 0 0 , 3 0 0 , 4 0 0 , 5 0 0 a n d 6 0 0 μ g M T S / l t r e a t m e n t c o m b i n a t i o n s p r o d u c e d c e n t p e r c e n t m o n o s e x p o p u l a t i o n s i n k o i c a r p b u t p r o d u c e d 2 – 5 % i n t e r s e x i n d i v i d u a l s c h a r a c t e r i z e d b y t h e i n t e r m i n g l i n g o f s p e r m a t o g o n i a a n d o o c y t e s i n t h e s a m e g o n a d . I n t h e r e v e r s i n g g o n a d s ( i . e , i n t e r s e x ) , s p e r m a t o g e n i c c y s t s i n e a r l y s t a g e s o f d e v e l o p m e n t w e r e p r e d o m i n a n t a n d w e r e d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t t h e e n t i r e g o n a d a m i s t t h e s t r o m a c e l l s . T h e o o c y t e s w e r e r e d u c e d i n n u m b e r a n d o n l y t h e s m a l l , d e v e l o p m e n t a l l y y o u n g e r o n e s w e r e s e e n i n a r e a s b e t w e e n t h e s p e r m a t o g e n i c c y s t s . O t h e r c e l l s i n c l u d e d c e l l s c o n t a i n i n g d e n s e d a r k s t a i n i n g n u c l e i a n d l i g h t s t a i n i n g c y t o p l a s m . S e x r a t i o o f p l a t y a d m i n i s t e r e d w i t h d i e t c o n t a i n i n g 1 7 α m e t h y l t e s t o s t e r o n e i s r e p o r t e d i n T a b l e 2 . A f t e r 3 0 d a y s g o n a d f o r m a t i o n w a s n o t c l e a r . H i s t o l o g i c a l o b s e r v a t i o n s o f t h e g o n a d o f f i s h g i v e n h o r m o n e d i e t s w e r e m a d e a f t e r 9 0 d a y s ( F i g . 2 a & b ) . E x p e r i m e n t 2 S e x r a t i o o b s e r v e d a f t e r 9 0 d a y s o f d i e t a r y h o r m o n e a d m i n i s t r a t i o n i n p l a t y r e v e a l e d a m a l e d o m i n a n t p o p u l a t i o n . I n 4 0 0 μ g / l o f 1 7 α M T H a d m i n i s t e r e d d i e t f o r 9 0 d a y s t h e m a l e s w e r e 7 5 % w h e r e a s t h e f e m a l e s w e r e o n l y 1 0 % . R e m a i n i n g 1 0 % w e r e d i e d . A t t h e s a m e t i m e 5 % o f f i s h e s w e r e i n t e r s e x . P l a t y f i s h f e d w i t h a d i e t c o n t a i n i n g J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 8 : 5 8 0 - 5 8 6 5 8 2 K u m a r e t a l . , 2 0 1 1 S . N o H o r m o n e d o s a g e ( µ g / l ) N o . o f f i s h e s D u r a t i o n ( h o u r s ) D u r a t i o n ( D a y s ) S e x r a t i o ( % ) S u r v i v a l ( % ) M a l e I n t e r s e x F e m a l e 1 0 9 0 6 9 0 0 . 5 0 0 . 0 0 0 . 4 0 1 0 0 2 1 0 0 9 0 6 9 0 0 . 6 0 0 . 0 0 0 . 3 0 1 0 0 3 2 0 0 9 0 6 9 0 0 . 7 0 0 . 0 5 0 . 1 5 1 0 0 4 3 0 0 9 0 6 9 0 0 . 7 5 0 . 0 5 0 . 1 0 1 0 0 5 4 0 0 9 0 6 9 0 0 . 8 5 * * 0 . 0 2 0 . 0 3 1 0 0 6 5 0 0 9 0 6 9 0 0 . 8 0 0 . 0 2 0 . 0 8 1 0 0 7 6 0 0 9 0 6 9 0 0 . 7 5 0 . 0 2 0 . 1 3 1 0 0 T A B L E 1 . E f f e c t o f d i f f e r e n t d o s e s o f d i s c r e t e 1 7 α M T S i m m e r s i o n t r e a t m e n t o n s e x r a t i o a n d s u r v i v a l o n X i p h o p h o r o u s m a c u l a t u s P l a t y . T h e s i g n i f i c a n c e l e v e l s ( * * P < 0 . 0 0 1 ) a r e f o r X 2 v a l u e s i n c o m p a r i s o n w i t h a e x p e c t e d s e x r a t i o o f 4 M : 1 F