J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y C r o t a l a r i a p a l l i d a e x t r a c t s a s a p u t a t i v e H I V - p r o t e a s e i n h i b i t o r s K e y w o r d s : P h y t o c h e m i c a l s , C r o t a l a r i a p a l l i d a , H I V p r o t e a s e . A B S T R A C T : I n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n , w e s c r e e n e d t h e t w o s o l v e n t ( m e t h a n o l a n d e t h a n o l ) e x t r a c t s o f C r o t a l a r i a p a l l i d a d i f f e r e n t p a r t s ( l e a f , f l o w e r a n d s t e m ) f o r p h y t o c h e m i c a l a n a l y s i s a n d s c r e e n i n g f o r H I V p r o t e a s e i n h i b i t o r s . T h e t w o s o l v e n t e x t r a c t s h a v e y i e l d e d t h e p r e s e n c e o f m a j o r a c t i v e c o m p o u n d s v i z . , f l a v o n o i d s , t e r p e n o i d s , c a r d i a c g l y c o s i d e s , a n t h r a q u i n o n e s , c o u m a r i n s , s t e r o i d s , t a n n i n s , s a p o n i n s . F o r H I V p r o t e a s e i n h i b i t o r a c t i v i t y , w e u s e d p e p s i n a s s a y a s a s u b s t i t u t e f o r s c r e e n i n g H I V p r o t e a s e i n h i b i t o r s i n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n . T h e m e t h a n o l a n d e t h a n o l e x t r a c t s o f s t e m a n d f l o w e r h a v e s h o w e d s i g n i f i c a n t i n h i b i t i o n o f p r o t e a s e a c t i v i t y a s c o m p a r e d t o s t a n d a r d ( P e p s t a t i n A ) . 2 8 5 - 2 9 1 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 4 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : G o v i n d a p p a M 1 , A n i l K u m a r N V 2 a n d G u s t a v o S a n t o y o 3 . I n s t i t u t i o n : 1 D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , S h r i d e v i I n s t i t u t e o f E n g i n e e r i n g & T e c h n o l o g y , S i r a R o a d , T u m k u r - 5 7 2 1 0 6 , K a r n a t a k a , I N D I A , 2 D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y , M a n i p a l I n s t i t u t e o f T e c h n o l o g y , M a n i p a l U n i v e r s i t y , M a n i p a l - 5 7 6 1 0 4 , K a r n a t a k a . 3 P r o f e s s o r I n v e s t i g a d o r T i t u l a r “ A ” , I I Q B - U M S N H , E d i f i c i o A 1 ( B 5 ) , C i u d a d U n i v e r s i t a r i a , M o r e l i a , M i c h o a c a n , M e x i c o , C . P . 5 8 0 3 0 . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : G o v i n d a p p a M E m a i l : d r a v i d a t e j a 0 7 @ y a h o o . c o . i n P h o n e N o : + 9 1 - 9 6 8 6 1 1 4 8 4 7 F a x : + 9 1 - 8 1 6 - 2 2 1 2 6 2 9 W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 6 9 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 2 9 J u l 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 1 1 A u g 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 3 0 A u g 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : G o v i n d a p p a M , A n i l K u m a r N V a n d G u s t a v o S a n t o y o . C r o t a l a r i a p a l l i d a e x t r a c t s a s a p u t a t i v e H I V - p r o t e a s e i n h i b i t o r s . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 8 5 - 2 9 1 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h p a p e r

I N T R O D U C T I O N A n u m b e r o f a n t i - H I V d r u g s u s e d i n c o n v e n t i o n a l A I D S t h e r a p y a r e a v a i l a b l e i n t h e m a r k e t , u n f o r t u n a t e l y t h e a d m i n i s t r a t i o n o f t h e s e c o m p o u n d s c l i n i c a l l y t o t h e A I D S p a t i e n t s e x h i b i t e d s e r i o u s s i d e e f f e c t s ( S c i n a z i e t a l . , 1 9 9 2 ) . A s t h e d a t a s h o w s , r a p i d s p r e a d o f A I D S e p i d e m i c a n d a p p e a r a n c e o f H I V s t r a i n r e s i s t a n c e t o t h e c u r r e n t l y a v a i l a b l e d r u g s s u g g e s t s t h a t a n e f f e c t i v e a n d d u r a b l e c h e m o t h e r a p y i s r e q u i r e d i n h e r i t a b l y f o r i t s t r e a t m e n t . T h e u s e o f i n n o v a t i v e c o m b i n a t i o n s o f d r u g s h a v i n g d i v e r s e m e c h a n i s m s o f a n t i - H I V a c t i v i t y ( T a n t i l l o e t a l . , 1 9 9 4 ; B a l z a r i n i e t a l . , 1 9 9 6 ; L i p s k y , 1 9 9 6 ) a n d c o n t i n u o u s n e e d f o r a l t e r n a t i v e i n h i b i t o r s a r e a l s o n e e d e d t o b e d e v e l o p e d p r o g r e s s i v e l y ( S i n g h e t a l . , 2 0 1 0 ) . N e w a n t i - H I V a g e n t s w i t h s u c h a c t i v i t i e s m a y b e i d e n t i f i e d t h r o u g h a v a r i e t y o f a p p r o a c h e s , o n e o f i s t h r o u g h t h e b e i n g s c r e e n i n g o f n a t u r a l p r o d u c t s . P l a n t p r o d u c t s h a v e a t t r a c t e d a t t e n t i o n a s p o s s i b l e a n t i - H I V d r u g s , t a r g e t e d o n t h e s p e c i f i c s t e p s o f t h e v i r a l l i f e c y c l e , s u c h a s v i r a l a t t a c h m e n t a n d e n t r y a s w e l l a s o n e s s e n t i a l e n z y m e s a n d p r o t e i n s t h a t p l a y a r o l e d u r i n g v i r a l g e n o m e t r a n s c r i p t i o n a r e i d e n t i f i e d ( M a t s u s e e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e a p p r o v e d m e d i c a t i o n s c u r r e n t l y i n u s e a r e m a i n l y r e s t r i c t e d t o t a r g e t t h e t w o v i r a l e n z y m e s , P r o t e a s e a n d R e v e r s e T r a n s c r i p t a s e ( R T ) . T h e s e i n h i b i t o r s a r e v e r y e x p e n s i v e a n d t h i s h a s l e d t o a g l o b a l d e m a n d f o r b r o a d e r , s a f e r a n d a l s o c h e a p e r m e d i c a t i o n s ( N o t k a e t a l . , 2 0 0 4 ) . H I V p r o t e a s e h a s b e e n s u g g e s t e d a s a p o t e n t i a l t a r g e t f o r A I D S t h e r a p y f o r a l o n g t i m e ( K r a m e r , 1 9 8 6 ; S i n g h e t a l . , 2 0 1 0 ) , l a t e r i t w a s s h o w n t h a t a f r a m e - s h i f t m u t a t i o n s i n t h e p r o t e a s e r e g i o n o f t h e p o l - g e n e p r e v e n t e d c l e a v a g e o f t h e g a g p o l y p r o t e i n p r e c u r s o r , w h i c h i s e s s e n t i a l f o r t h e m u t a t i o n o f t h e H I V p a r t i c l e s . B l o c k a g e o f H I V p r o t e a s e l e a d s t o t h e f o r m a t i o n o f i m m a t u r e n o n i n f e c t i o u s v i r i o n s ( K h o l , 1 9 8 8 ) . T h e H I V a s p a r t i c p r o t e a s e ( H I V - P R ) 1 i s a k e y e n z y m e i n t h e v i r u s l i f e c y c l e a n d w a s e a r l i e r p e r c e i v e d a s a p r o m i s i n g t h e r a p e u t i c t a r g e t a n d i t s i n h i b i t i o n h a s b e c o m e s u c c e s s f u l l y u s e d i n t h e t r e a t m e n t o f A I D S . L i t e r a t u r e s u r v e y s h o w s t h a t t h e r e a r e g r e a t p o t e n t i a l n a t u r a l p r o d u c t s a c t i n g a s H I V p r o t e a s e i n h i b i t o r s f o r e g ; l i m o n i n a n d n o m i l i n f r o m C i t r u s s p . ( B a t t i n e l l i , 2 0 0 3 ) , m a s l i n i c a c i d f r o m G e u m j a p o n i c u m ( X u , 1 9 9 6 ) , o x y g e n a t e d t r i t e r p e n o i d s ( G a n o d e r i c a c i d - α ) f r o m G a n o d e r m a l u c i d u m ( M e k k a w y , 1 9 9 8 ) , u r s o l i c a c i d a n d u v a o l f r o m C r a t a e g u s p i n a t i t i d s ( M i n , 1 9 9 9 ) , c o u m a r i n s f r o m C a l o p h y l l u m b r a s i l i e n s e ( R i c a r d o e t a l . , 2 0 0 4 ) a n d o t h e r n a t u r a l p r o d u c t s ( C h i n s e m b u a n d H e d i m b i , 2 0 1 0 ) . C r o t a l a r i a p a l l i d a i s a t e r r e s t r i a l , a n n u a l , e r e c t h e r b , u p t o 1 5 0 c m t a l l . T a p r o o t w h i t e o r b r o w n a n d s t e m g r o o v e d , s o l i d , g l a b r o u s . S t i p u l e s p r e s e n t . L e a v e s t r i f o l i o l a t e , a l t e r n a t e s p i r a l , s t a l k e d , l e a f l e t s e l l i p t i c o r o b o v a t e , m o r e t h a n 2 c m l o n g / w i d e , h a i r y o n u p p e r s u r f a c e , m a r g i n e n t i r e , a p e x o b t u s e o r r o u n d e d , b a s e a c u t e , p i n n a t e l y v e i n e d . F l o w e r s b i s e x u a l , g r o u p e d t o g e t h e r i n a t e r m i n a l r a c e m e , s t a l k e d , p e t a l s 5 , y e l l o w . F r u i t a r o u n d e d p o d . A n o v e l a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e h a s b e e n e x h i b i t e d a s a s t r o n g a n t i m i c r o b i a l a g e n t a g a i n s t h u m a n p a t h o g e n i c m i c r o - o r g a n i s m s ( P e l l e g r i n i e t a l . , 2 0 0 9 ) a n d l e c t i n ( R e g o e t a l . , 2 0 0 2 ) . I n t h e f o l k a n d A y u r v e d i c m e d i c i n e s , C . j u n c e a i s u s e d a s b l o o d p u r i f i e r , a b o r t i f i c i e n t , a s t r i n g e n t , d e m u l c e n t , e m e t i c , p u r g a t i v e a n d i n t h e t r e a t m e n t o f a n a e m i a , i m p e t i g o , m e n o r r h a g i a a n d p s o r i a s i s ( C h a u h a n a n d S i n g h , 2 0 1 0 ) . C r o t a l a r i a s p e c i e s p o s s e s s e s a n t i c a n c e r p r o p e r t i e s ( K u m a r e t a l . , 2 0 0 8 ) . P r e s e n c e o f c o u m a r i n h a s r e p o r t e d f r o m C r o t a l a r i a m a d h u r e n s i s ( B h a k s h u e t a l . , 2 0 0 8 ) a n d C r o t a l a r i a r a m o s i s s i m a ( R a o a n d N a r u k u l l a , 2 0 0 7 ) . T h e l i t e r a t u r e s u r v e y i n d i c a t e s t h a t t h e r e a r e n o r e p o r t s a v a i l a b l e f r o m I n d i a r e g a r d i n g t h e p h y t o c h e m i c a l s a n d t h e i r a n t i - H I V p r o p e r t i e s o f C . p a l l i d a . I n t h e p r e s e n t s t u d y w a s a i m e d t o e x a m i n e t h e p h y t o c h e m i c a l a n a l y s i s o f m e t h a n o l a n d e t h a n o l e x t r a c t o f s t e m , l e a v e s a n d f l o w e r o f C . p a l l i d a a n d w a s s c r e e n e d f o r a n t i - H I V p r o p e r t i e s u s i n g s t a n d a r d m e t h o d s . T h e f i n d i n g s f r o m t h i s w o r k m a y a d d t o t h e o v e r a l l v a l u e o f t h e m e d i c i n a l p o t e n t i a l o f t h e p l a n t . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S C o l l e c t i o n o f p l a n t m a t e r i a l T h e p l a n t w a s c o l l e c t e d i n N o v e m b e r 2 0 0 9 f r o m t h e c o l l e g e c a m p u s , S h r i d e v i I n s t i t u t e o f E n g i n e e r i n g & T e c h n o l o g y , S i r a R o a d , T u m k u r , K a r n a t a k a , I n d i a . T h e p l a n t w a s i d e n t i f i e d b y t h e i r v e r n a c u l a r n a m e s a n d l a t e r i t w a s c o m p a r e d w i t h t h e h e r b a r i u m o f D e p a r t m e n t o f S t u d i e s i n B o t a n y , M a n a s a G a n g o t h r i , U n i v e r s i t y o f M y s o r e , M y s o r e a n d G o v e r n m e n t A y u r v e d i c C o l l e g e , M y s o r e , I n d i a . E x t r a c t P r e p a r a t i o n E a c h i n d i v i d u a l p l a n t p a r t s w e r e u s e d i n t h e e x t r a c t i o n f o l l o w e d b y m e t h o d o l o g y a s d e s c r i b e d b y M a r t i n o e t a l . ( 2 0 0 6 ) . M i c r o w a v e a s s i s t e d e x t r a c t i o n w a s p e r f o r m e d u s i n g a c l o s e d - v e s s e l s y s t e m ( G M S 1 7 M 0 7 W H G X S O L O M i c r o w a v e ) . T w o g r a m s o f p o w d e r e d d i f f e r e n t p l a n t p a r t s w e r e s u b j e c t e d t o e x t r a c t i o n i n a v e s s e l w i t h o f s o l v e n t 2 8 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 8 5 - 2 9 1 G o v i n d a p p a e t a l . , 2 0 1 1

( e t h a n o l a n d m e t h a n o l ) u p t o t h e v o l u m e o f 2 m l f o r t w o c y c l e s o f 5 m i n i n d i v i d u a l l y . T h e r e s u l t i n g e x t r a c t s w e r e f i l t e r e d t h r o u g h W h a t m a n f i l t e r N o . 2 . C l a r i f i e d s u p e r n a t a n t w a s k e p t i n r e f r i g e r a t i o n f o r f u r t h e r s t u d i e s ( p h y t o c h e m i c a l a n a l y s i s , c o u m a r i n i d e n t i f i c a t i o n a n d H I V p r o t e a s e i n h i b i t i o n ) . P h y t o c h e m i c a l a n a l y s i s P h y t o c h e m i c a l a n a l y s i s w a s c a r r i e d o u t f o r s a p o n i n s , f l a v o n o i d s , t e r p e n o i d s , s t e r o i d s , p h e n o l , a l k a l o i d s ( O b d o n i a n d O c h u k o , 2 0 0 1 ) , t a n n i n s ( K a u r a n d A r o r a , 2 0 0 9 ) a n d c o u m a r i n s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y a s d e s c r i b e d b y Y a o e t a l . ( 2 0 0 8 ) . W a g n e r ’ s a n d H e g e r ’ s r e a g e n t s w e r e u s e d f o r a l k a l o i d f o a m t e s t f o r s a p o n i n s , M g - H C l a n d Z n - H C l f o r f l a v o n o i d s , K e l l e r - K i l l a n i t e s t f o r c a r d i a c g l y c o s i d e s , S a l k o n o s k i t e s t f o r t e r p e n o i d s , a c e t i c a n h y d r i d e a n d s u l p h u r i c a c i d f o r s t e r o i d s , c h l o r i d e a n d g e l a t i n f o r t a n n i n s , f e r r i c c h l o r i d e f o r p h e n o l , h e x a n e a n d d i l u t e d a m m o n i a f o r a n t h r a q u i n o n e s t e s t . A l l t h e s e e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t f o r e a c h s o l v e n t e x t r a c t s s e p a r a t e l y . E n z y m e p e p s i n i n h i b i t i o n a s s a y P e p s i n h a s a q u i t e c l o s e r e s e m b l a n c e i n p r o t e o l y t i c a c t i v i t y w i t h H I V - 1 p r o t e a s e o n e k e y e n z y m e o f H I V - 1 l i f e c y c l e a s b o t h o f t h e m b e l o n g t o s a m e a s p a r t a t e e n z y m e f a m i l y ( M a r i a e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h i s e n z y m e w a s u s e d a s s u b s t i t u t e o f H I V - 1 p r o t e a s e t o c h e c k o u t a n t i - H I V a c t i v i t y o f p l a n t e x t r a c t s i n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n ( S i n g h e t a l . , 2 0 1 0 ) . W e f o l l o w e d t h e m e t h o d o f A o y a g i ( 1 9 7 8 ) a n d S i n g h e t a l . ( 2 0 1 0 ) , f o r t h i s a s s a y , 5 0 µ g p e p s i n , 8 0 0 µ g h a e m o g l o b i n a n d d i f f e r e n t p a r t s e x t r a c t s w e r e t a k e n i n 5 0 0 µ l o f r e a c t i o n m i x t u r e . T h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o i n c u b a t e a t 3 7 0 C , a f t e r 2 0 m i n , 7 0 0 µ l o f 5 % T C A w a s a d d e d t o s t o p t h e r e a c t i o n . I t w a s t h e n c e n t r i f u g e d a t 1 4 , 0 0 0 g f o r 5 m i n a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s c o l l e c t e d . O p t i c a l D e n s i t y ( O D ) w a s r e c o r d e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y a t 2 8 0 n m . S e p a r a t e b l a n k s w e r e u s e d o r b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e c o n t r o l a s w e l l a s f o r s a m p l e . F o r p o s i t i v e c o n t r o l e n z y m e a n d s u b s t r a t e w e r e t a k e n a n d f o l l o w e d t h e a b o v e p r o c e d u r e a n d f o r n e g a t i v e c o n t r o l p e p s t a t i n A w a s t a k e n a s a w e l l k n o w n i n h i b i t o r o f b o t h p e p s i n a n d H I V - p r o t e a s e . E a c h s a m p l e w a s t a k e n i n t r i p l i c a t e , s o t h i s a s s a y g i v e s r e p r o d u c i b l e r e s u l t s . R E S U L T S P h y t o c h e m i c a l a n a l y s i s T h e p h y t o c h e m i c a l s c r e e n i n g s h o w e d t h a t t h e t w o d i f f e r e n t s o l v e n t e t h a n o l a n d m e t h a n o l e x t r a c t s o f C . p a l l i d a , t h e a l k a l o i d s , f l a v o n o i d s , t e r p e n o i d s , s a p o n i n s , p h e n o l s , c a r d i a c g l y c o s i d e s , s t e r o i d s , c o u m a r i n a n d t a n n i n s w e r e p r e s e n t i n a l l t h e s o l v e n t e x t r a c t s . T h e m e t h a n o l e x t r a c t y i e l d e d s t r o n g l y a l l t h e p h y t o c h e m i c a l s c o m p a r e d t o e t h a n o l ( T a b l e 1 ) . I n e t h a n o l l e a f e x t r a c t s , i t J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 8 5 - 2 9 1 2 8 7 G o v i n d a p p a e t a l . , 2 0 1 1 S a m p l e P h y t o c h e m i c a l s F l a v o n o i d s T e r p e n o i d s P h e n o l C a r d i a c g l y c o s i d e s T a n n i n S t e r o i d s S a p o n i n s C o u m a r i n s A n t h r a q u i n o n e s E t h a n o l e x t r a c t L e a f - + - + + + + + - F l o w e r + + - + + + + + - S t e m + + - + + + + + - M e t h a n o l e x t r a c t L e a f - + + + + + + + - F l o w e r + + + + + + + + - S t e m + + - + + + + + - T a b l e 1 . P h y t o c h e m i c a l a n a l y s i s o f m e t h a n o l a n d e t h a n o l e x t r a c t s o f C r o t a l a r i a p a l l i d a R e p e a t e d t h e e a c h e x p e r i m e n t s t h r i c e , + : p r e s e n c e , - : a b s e n t