J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y S t a n d a r d i z e d p r o t o c o l f o r t h e i n v i t r o c u l t u r e o f A r t e m i s i a a n n u a L . A m e d i c i n a l p l a n t a t h i g h a l t i t u d e s o f N i l g i r i s , t h e W e s t e r n G h a t s . K e y w o r d s : I n v i t r o c u l t u r e , M e d i c i n a l p l a n t , A r t e m i s i a a n n u a , N i l g i r i s , W e s t e r n G h a t s , I n d i a . A B S T R A C T : A r e l i a b l e p r o t o c o l f o r c a l l u s i n d u c t i o n a n d o r g a n o g e n e s i s , a n d s u c c e s s f u l p l a n t l e t s u r v i v a b i l i t y t h r o u g h h a r d e n i n g w e r e d e v e l o p e d f o r l e a f e x p l a n t s o f t h e m e d i c i n a l p l a n t s p e c i e s , A r t e m i s i a a n n u a L . M S m e d i u m c o n t a i n i n g t h e a u x i n , N A A a t 0 . 9 m g / l i s d e t e r m i n e d t o b e t h e o p t i m u m c o n c e n t r a t i o n f o r c a l l u s i n d u c t i o n . H i g h e r s h o o t i n g ( 2 0 . 6 7 / c a l l u s ) w a s p e r f o r m e d i n t h e m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h B A P a n d G A 3 a t 0 . 5 a n d 1 . 0 m g / l r e s p e c t i v e l y w h i l e s u b c u l t u r i n g t h e c a l l u s . M a x i m u m n u m b e r o f r o o t s ( 1 2 . 0 0 r o o t s / s h o o t ) w a s n o t e d t o b e o b t a i n e d i n t h e m e d i u m c o n t a i n i n g I B A a t 0 . 9 m g / l . T h e i n v i t r o r e g e n e r a t e d p l a n t l e t s w e r e s u c c e s s f u l l y a c c l i m a t i z e d ( 8 6 % s u r v i v a b i l i t y r a t e ) i n t h e h a r d e n i n g m e d i u m e n c o m p o s i n g v e r m i c u l a t e , c o i r w a s t e a n d f o r e s t l i t t e r i n t h e r a t i o o f 1 : 1 : 1 b y v o l u m e . 1 7 3 - 1 7 8 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 3 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : G a n e s a n C M a n d P a u l s a m y S . I n s t i t u t i o n : D e p a r t m e n t o f B o t a n y , K o n g u n a d u A r t s a n d S c i e n c e C o l l e g e , C o i m b a t o r e 6 4 1 0 2 9 , T a m i l N a d u , I n d i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : P a u l s a m y S E m a i l : p a u l s a m i @ y a h o o . c o m b i o g a n e s a n @ g m a i l . c o m . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 5 7 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 4 J u l 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 0 8 J u l 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 1 2 J u l 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : G a n e s a n C M a n d P a u l s a m y S . S t a n d a r d i z e d p r o t o c o l f o r t h e i n v i t r o c u l t u r e o f A r t e m i s i a a n n u a L . A m e d i c i n a l p l a n t a t h i g h a l t i t u d e s o f N i l g i r i s , t h e W e s t e r n G h a t s . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 7 3 - 1 7 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h p a p e r

I N T R O D U C T I O N A r t e m i s i a a n n u a L . ( A s t e r a c e a e ) i s a m e d i c i n a l h e r b i n h a b i t i n g a t t h e h i g h a l t i t u d e s o f N i l g i r i s , W e s t e r n G h a t s a t o p e n h a b i t a t s . P r e s e n c e o f h i g h c o n t e n t o f b i o a c t i v e a l k a l o i d s l i k e a r t e m i s i n i n i n A . a n n u a r e c e i v e s a t t e n t i o n t o w a r d s p h a r m a c o l o g i c a l i n d u s t r i e s a s i t i s u s e d f o r t h e t r e a t m e n t o f m a l a r i a l f e v e r ( D u k e e t a l . , 1 9 8 7 ; C h e n e t a l . , 1 9 9 1 ) . A s a r e s u l t o f o v e r e x p l o i t a t i o n , t h e s p e c i e s b e c o m e l o w e r i n p o p u l a t i o n s i z e a t t h e h i g h a l t i t u d e s o f N i l g i r i s ( P a u l s a m y e t a l . , 2 0 0 8 ) . C o n v e n t i o n a l m e t h o d o f p r o p a g a t i o n o f t h i s s p e c i e s t h r o u g h s e e d w a s a l s o n o t s u c c e s s f u l ( P a u l s a m y , 2 0 0 5 ) . H e n c e , i n v i t r o c u l t u r e b y e m p l o y i n g t i s s u e c u l t u r e t e c h n o l o g y h a s b e e n a t t e m p t e d f o r t h i s s p e c i e s t o e n a b l e b u l k p r o d u c t i o n . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S T h e l e a f e x p l a n t s o f A r t e m i s i a a n n u a w e r e c o l l e c t e d f r o m t h e h e a l t h y i n d i v i d u a l s a t N i l g i r i s a n d w a s h e d t h o r o u g h l y w i t h t a p w a t e r , t h e n t h e y w e r e c u t i n t o s m a l l d i s c s o f 0 . 8 c m d i a m e t e r a n d t h e n t r e a t e d w i t h a s u r f a c t a n t , t w e e n 2 0 ( 5 % w / v ) f o r 5 m i n u t e s . A f t e r r e p e a t e d w a s h e s i n d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r , t o e l i m i n a t e t h e f u n g a l c o n t a m i n a t i o n , t h e e x p l a n t s w e r e t r e a t e d w i t h C a r b e n d a z i m ( 5 0 % w / v ) , f u n g i c i d e ( 1 0 % ) f o r 1 5 m i n u t e s a n d r i n s e d w i t h d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r f o r 2 o r 3 t i m e s . T o e l i m i n a t e b a c t e r i a l c o n t a m i n a t i o n e x p l a n t s w e r e a l s o t r e a t e d w i t h 5 % a n t i b i o t i c s ( a m p i c i l l i n a n d r i f a m p i c i n ) f o r 3 0 m i n u t e s f o l l o w e d b y t h r e e r i n s e s i n s t e r i l e d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r . F u r t h e r m o r e , s u r f a c e s t e r i l i z a t i o n w a s c a r r i e d o u t b y d i p p i n g t h e e x p l a n t s i n 0 . 1 % H g C l 2 f o r 3 m i n u t e s f o l l o w e d b y 3 - 4 r i n s e s i n s t e r i l i z e d d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r i n s i d e t h e L a m i n a r a i r f l o w c h a m b e r . L e a f d i s c s w e r e h o r i z o n t a l l y p l a c e d i n P e t r i d i s h e s c o n t a i n i n g M S ( M u r a s h i g e a n d S k o o g , 1 9 6 2 ) m e d i u m f o r t i f i e d w i t h v a r i o u s c o m b i n a t i o n s a n d c o n c e n t r a t i o n s o f d i f f e r e n t g r o w t h r e g u l a t o r s v i z . , B A P , N A A , 2 , 4 - D a n d T D Z f o r c a l l u s i n d u c t i o n . T h e p H o f t h e m e d i u m w a s a d j u s t e d b e t w e e n 5 . 6 a n d 5 . 8 b e f o r e a u t o c l a v i n g a t 1 2 1 o C f o r 2 0 m i n . T h e c u l t u r e w a s i n c u b a t e d a t a c o n s t a n t t e m p e r a t u r e o f 2 5 + 2 o C w i t h 1 4 h p h o t o p e r i o d ( 3 0 0 0 l u x ) a n d 8 h d a r k n e s s . C a l l u s f r o m t h e s e p r i m a r y c u l t u r e s w e r e t r a n s f e r r e d t o M S m e d i u m c o n t a i n i n g d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f B A P , I A A a n d G A 3 f o r s h o o t i n d u c t i o n . A f t e r t h e o r i g i n o f m u l t i p l e s h o o t s , e l o n g a t e d s h o o t s o f 2 c m l o n g w e r e e x c i s e d f r o m t h e c u l t u r e a n d t r a n s f e r r e d t o M S m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f I B A , I A A a n d N A A f o r r o o t i n i t i a t i o n . A f t e r t w o w e e k s , t h e p e r c e n t a g e o f s h o o t f o r m i n g r o o t s , r o o t s p e r s h o o t l e n g t h w e r e a s s e s s e d . R o o t e d s h o o t s w e r e t h o r o u g h l y w a s h e d t o r e m o v e t h e a d h e r i n g g e l a n d p l a n t e d i n p o l y t h e n e b a g s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t h a r d e n i n g m e d i a a n d k e p t i n g r e e n h o u s e f o r a c c l i m a t i z a t i o n . T h e p o t s w e r e w a t e r e d a t o n e d a y i n t e r v a l a n d s u p p l i e d w i t h ½ s t r e n g t h M S s a l t s , t w i c e a w e e k b y s p r a y i n g . T h e s u r v i v a l r a t e o f p l a n t l e t s w a s r e c o r d e d f o r o n e m o n t h a f t e r t r a n s f e r r i n g t o p o l y t h e n e b a g s . T r i p l i c a t e s w e r e m a i n t a i n e d f o r a l l e x p e r i m e n t s . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N T h e n u m b e r o f d a y s r e q u i r e d f o r c a l l u s i n d u c t i o n f r o m t h e l e a f e x p l a n t s o f t h e s t u d y s p e c i e s , A r t e m i s i a a n n u a i s n o t e d t o b e v a r i e d f r o m 1 0 t o 3 0 d a y s a c c o r d i n g t o t h e c o m b i n a t i o n s a n d c o n c e n t r a t i o n s o f t h e g r o w t h r e g u l a t o r s v i z . , B A P , N A A , 2 , 4 - D , I B A a n d T D Z i n t h e M S m e d i u m ( T a b l e 1 ) . I t m a y b e e x p l a i n e d t h a t t h e s p e c i f i c g r o w t h h o r m o n e s a t a p p r o p r i a t e c o n c e n t r a t i o n s c a n p l a y a m a j o r r o l e t o i n d u c e c a l l u s b e s i d e s t h e o t h e r 1 7 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 7 3 - 1 7 8 G a n e s a n e t a l . , 2 0 1 1 F i g u r e 1 . S u c c e s s f u l i n v i t r o c u l t u r e o f A r t e m i s i a a n n u a f r o m t h e l e a f e x p l a n t s . a , E f f e c t i v e c a l l u s f o r m a t i o n i n M S m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 9 m g / l o f N A A . b , H i g h e r r e s p o n s e o f c a l l u s f o r s h o o t f o r m a t i o n i n M S m e d i u m f o r t i f i e d w i t h B A P a t 2 m g / l . c , H i g h d e g r e e o f m u l t i p l e s h o o t f o r m a t i o n w h i l e s u b c u l t u r i n g o n t o M S m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h B A P a n d G A 3 a t 2 . 7 a n d 0 . 9 m g / l r e s p e c t i v e l y . d , M o r e p r o n o u n c e d r o o t f o r m a t i o n d u r i n g s u b c u l t u r i n g o n t o M S m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 9 m g / l o f I B A .

f a c t o r s ( A n a n t h i e t a l . , 2 0 1 1 ) . T h e a m o u n t o f l e a f e x p l a n t r e s p o n d i n g f o r c a l l u s f o r m a t i o n w a s r a n g i n g b e t w e e n 1 0 a n d 8 4 % ( T a b l e 1 ) . M S m e d i u m f o r t i f i e d w i t h N A A a t 0 . 9 m g / l i n i t i a t e d 9 8 . 6 6 % o f l e a f d i s c s f o r c a l l u s f o r m a t i o n ( F i g . 1 a ) f o l l o w e d b y 0 . 7 m g / l o f N A A i n i t i a t e d 8 4 % o f l e a f d i s c s f o r c a l l u s i n g a n d 0 . 5 m g / l o f N A A a n d T D Z e a c h i n i t i a t e d 7 3 % o f d i s c s f o r c a l l u s i n g . T h e o t h e r c o m b i n a t i o n s a n d c o n c e n t r a t i o n s o f g r o w t h h o r m o n e s i n t h e m e d i u m i n i t i a t e d a r o u n d o n l y 2 0 t o 5 0 % o f l e a f d i s c s o f A . a n n u a f o r c a l l u s f o r m a t i o n . B a s k a r a n a n d J a y a b a l a n ( 2 0 0 5 ) e x p l a i n e d t h a t t h e d i f f e r e n t i a l r e s p o n s e o f s a m e o r d i f f e r e n t e x p l a n t s f o r c a l l u s f o r m a t i o n c o u l d b e d u e t o t h e n a t u r e o f t i s s u e , d e g r e e o f t o t i p o t e n c y a n d c o m p o s i t i o n o f m e d i u m w i t h r e s p e c t t o m i c r o n u t r i e n t s a n d h o r m o n e s . F u r t h e r i t i s e x p l a i n e d t h a t t h e v a r i a t i o n i n r e s p o n s e o f d i s c s i n t e r m s o f c a l l u s i n i t i a t i o n m a y b e d u e t o t h e v a r i a t i o n i n d i s t r i b u t i o n o f e n d o g e n o u s l e v e l o f g r o w t h r e g u l a t o r s a s o b s e r v e d i n m a n y o t h e r p l a n t s ( F a r t e r n a l e e t a l . , 2 0 0 2 ; S e n t h i l k u m a r a n d P a u l s a m y , 2 0 1 0 b ) . I t w a s n o t e d t h a t t h e N A A a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h T D Z g e n e r a l l y h a v e t h e e f f i c i e n c y o f i n i t i a t i o n a t h i g h p e r c e n t a g e o f ( > 5 0 % ) l e a f e x p l a n t f o r c a l l u s f o r m a t i o n . I t i n d i c a t e s t h e h i g h e r r e q u i r e m e n t o f c e r t a i n a u x i n s l i k e N A A a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h l o w q u a n t i t y o f c y t o k i n i n s l i k e T D Z f o r c a l l u s f o r m a t i o n o f t h e s t u d y s p e c i e s , A . a n n u a . K a r a p p u s a m y a n d P u l l a i a h ( 2 0 0 7 ) f o r t h e s p e c i e s , B u p l e u r u m d i s t i c h o p h y l l u m a n d S e n t h i l k u m a r a n d P a u l s a m y ( 2 0 1 0 a ) f o r t h e s p e c i e s , A g e r a t u m c o n y z o i d e s a l s o h a v e r e p o r t e d e f f e c t i v e c a l l u s f o r m a t i o n f r o m t h e l e a f e x p l a n t s i n t h e m e d i u m c o n t a i n i n g h i g h q u a n t i t y o f N A A . M a r i a n i e t a l . , ( 2 0 1 1 ) r e p o r t e d t h e r e q u i r e m e n t o f t h e c y t o k i n i n l i k e c o m p o u n d s , T D Z f o r e f f e c t i v e c a l l u s f o r m a t i o n i n t h e o r n a m e n t a l p l a n t , A g l a o n e m a s p . T h e c o l o u r J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 7 3 - 1 7 8 1 7 5 G a n e s a n e t a l . , 2 0 1 1 G r o w t h r e g u l a t o r ( m g / l ) D a y s r e q u i r e d f o r c a l l u s f o r m a t i o n a f t e r i n o c u l a t i o n C a l l u s f o r m a t i o n ( % ) C o l o u r o f t h e c a l l u s B A P N A A 2 , 4 - D I B A T D Z L e a f e x p l a n t L e a f e x p l a n t L e a f e x p l a n t 0 . 5 0 0 0 0 1 0 1 0 . 0 0 ± 2 . 0 0 a G 1 . 0 0 0 0 0 1 2 1 3 . 6 6 ± 1 . 5 2 a G 1 . 5 0 0 0 0 1 4 1 8 . 0 0 ± 2 . 0 0 b G 2 . 5 0 0 0 0 1 6 2 1 . 3 3 ± 1 . 5 3 b c G 3 . 0 0 0 0 0 1 8 2 3 . 3 3 ± 1 . 5 8 c G 0 0 . 1 0 0 0 1 8 2 5 . 0 0 ± 2 . 0 0 c G 0 0 . 3 0 0 . 5 0 2 1 2 9 . 0 0 ± 2 . 0 0 c d G 0 0 . 5 0 1 . 0 0 2 0 3 0 . 0 0 ± 1 . 0 0 d D G 0 0 . 7 0 1 . 5 0 2 3 4 9 . 0 0 ± 2 . 0 0 d D G 0 1 . 0 0 2 . 0 0 2 2 5 7 . 3 3 ± 2 . 5 1 e D G 0 . 5 0 0 . 5 0 0 1 8 3 9 . 0 0 ± 1 . 0 0 f G 1 . 0 0 1 . 0 0 0 1 7 4 4 . 3 3 ± 2 . 0 8 d D G 1 . 5 0 1 . 5 0 0 1 5 4 6 . 6 6 ± 1 . 5 2 d D G 2 . 0 0 2 . 5 0 0 2 1 4 9 . 3 3 ± 2 . 0 8 d L G 2 . 5 0 3 . 0 0 0 1 9 5 1 . 3 3 ± 2 . 0 8 d L G 3 . 0 0 3 . 5 0 0 2 3 5 5 . 0 0 ± 1 . 0 0 e B 0 0 . 1 0 0 0 1 4 3 9 . 6 6 ± 1 . 5 3 f L G 0 0 . 3 0 0 0 1 8 4 9 . 6 6 ± 1 . 5 5 d L G 0 0 . 5 0 0 0 2 0 4 6 . 6 6 ± 1 . 5 9 d B 0 0 . 7 0 0 0 2 1 8 4 . 0 0 ± 4 . 3 5 g L B 0 0 . 9 0 0 0 3 0 9 8 . 6 6 ± 2 . 5 1 h L B 0 0 . 5 0 0 0 . 1 2 2 5 4 . 3 3 ± 1 . 5 8 e D B 0 0 . 5 0 0 0 . 2 1 9 5 4 . 6 6 ± 0 . 5 7 e D B 0 0 . 5 0 0 0 . 3 1 7 5 6 . 6 6 ± 2 . 0 8 e D B 0 0 . 5 0 0 0 . 4 2 5 5 8 . 0 0 ± 3 . 0 0 e D B 0 0 . 5 0 0 0 . 5 2 3 7 3 . 0 0 ± 4 . 0 0 i L B T a b l e 1 . E f f e c t o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f g r o w t h r e g u l a t o r s o n p e r c e n t c a l l u s i n d u c t i o n f r o m l e a f , n o d e a n d i n t e r m o d a l e x p l a n t s o f t h e s p e c i e s , A r t e m i s i a a n n u a . G - G r e e n , D G - D a r k g r e e n , L G - L i g h t g r e e n , B - B r o w n , D B - D a r k b r o w n , L B - L i g h t b r o w n M e a n s i n c o l u m n f o l l o w e d b y d i f f e r e n t l e t t e r ( s ) a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t 5 % l e v e l a c c o r d i n g t o D M R T .

o f t h e c a l l i w a s s h o w i n g w i d e d e g r e e l i k e g r e e n , d a r k g r e e n , l i g h t g r e e n , b r o w n , d a r k b r o w n a n d l i g h t b r o w n a c c o r d i n g t o t h e c o m b i n a t i o n s a n d c o n c e n t r a t i o n s o f t h e g r o w t h r e g u l a t o r s i n t h e M S m e d i u m ( T a b l e 1 ) . T h e r e s u l t s o f t h e s u b c u l t u r i n g e x p e r i m e n t s b y u s i n g t h e s e c o n d a r y e x p l a n t , l e a f d e r i v e d c a l l u s s h o w e d t h a t t h e c y t o k i n i n , B A P a l o n e i n h i g h e r c o n c e n t r a t i o n ( > 1 . 5 m g / l ) ( F i g . 1 b ) o r B A P i n c o m b i n a t i o n w i t h G A 3 h a v e e n h a n c e d t h e r e s p o n s e o f c a l l i f o r s h o o t f o r m a t i o n b y 9 8 a n d 9 0 % r e s p e c t i v e l y ( T a b l e 2 ) . I n a d d i t i o n , g r e a t e r n u m b e r o f 2 0 s h o o t s / c a l l u s w a s a l s o n o t e d t o b e p r o d u c e d w h i l e s u b c u l t u r i n g t h e c a l l i o n M S m e d i u m w i t h B A P a n d G A 3 a t 2 . 7 a n d 0 . 9 m g / l r e s p e c t i v e l y ( T a b l e 2 ) ( F i g . 1 c ) . H o w e v e r , t h e h i g h e r s h o o t l e n g t h o f 1 0 c m w a s a c h i e v e d i n t h e M S m e d i u m f o r t i f i e d w i t h B A P a l o n e a t 2 m g / l ( T a b l e 2 ) . A l l t h e s e f a c t s i n d i c a t e t h a t t h e c y t o k i n i n , B A P i s t h e m o s t e s s e n t i a l g r o w t h r e g u l a t o r f o r e f f e c t i v e s h o o t i n g o f t h e s t u d y s p e c i e s , A . a n n u a . I t i s o f c o m m o n f a c t t h a t c y t o k i n i n i s t h e m a j o r g r o w t h h o r m o n e i n v o l v e d i n s h o o t f o r m a t i o n i n m a n y p l a n t s p e c i e s ( V i j a y k u m a r i e t a l . , 2 0 0 1 ; R o y e t a l . , 2 0 0 8 ; S e n t h i l k u m r a n d P a u l s a m y , 2 0 1 0 a ; S u n d e r a n d J a w a h a r , 2 0 1 1 ) . T h e r o o t i n g a t t r i b u t e s o f A . a n n u a w h i l e s u b c u l t u r i n g t h e s e c o n d a r y e x p l a n t s h o o t s w e r e w e l l p r o n o u n c e d i n t h e M S m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h t h e a u x i n , I B A a l o n e a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s f r o m 0 . 5 t o 0 . 9 m g / l ( T a b l e 3 ) . T h e I B A c o n c e n t r a t i o n a t 0 . 9 m g / l i n i t i a t e d 8 5 % s h o o t s f o r r o o t f o r m a t i o n ( F i g . 1 d ) f o l l o w e d b y 0 . 7 m g / l i n i t i a t e d 8 0 % a n d 0 . 5 m g / l i n i t i a t e d 7 1 % s h o o t s f o r r o o t f o r m a t i o n . T h e n u m b e r o f r o o t s p e r s h o o t w e r e a l s o o b s e r v e d t o b e h i g h e r ( 1 2 r o o t s / s h o o t ) i n t h e M S m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 9 m g / l I B A f o r t h e s t u d y s p e c i e s , A . a n n u a . S i m i l a r l y , t h e r o o t l e n g t h w a s g r e a t e r ( 5 . 1 c m ) d u r i n g t h e s u b c u l t u r i n g o f i n v i t r o c u l t u r e d s h o o t s f o r r o o t s o n M S m e d i u m w i t h I B A a t 0 . 9 m g / l . A l l t h e s e f a c t s s h o w e d t h a t t h e a u x i n , I B A i s t h e m o s t r e q u i r e d g r o w t h r e g u l a t o r f o r s h o o t i n g c h a r a c t e r s o f t h e s t u d y s p e c i e s , A . a n n u a . I t a g r e e s w i t h t h e c o n c e p t t h a t a u x i n s a r e t h e p l a n t h o r m o n e s e n d o g e n o u s l y o r e x o g e n o u s l y i n d u c i n g r o o t f o r m a t i o n i n m a j o r i t y o f p l a n t s p e c i e s ( V a n 1 7 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 7 3 - 1 7 8 G a n e s a n e t a l . , 2 0 1 1 T a b l e 2 . E f f e c t o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f g r o w t h r e g u l a t o r s o n s h o o t i n i t i a t i o n , s h o o t n u m b e r a n d s h o o t l e n g t h a f t e r s u b c u l t u r i n g t h e l e a f d e r i v e d c a l l u s o f t h e s p e c i e s , A r t e m i s i a a n n u a . G r o w t h r e g u l a t o r ( m g / l ) C u l t u r e r e s p o n s e ( % ) N o . o f s h o o t s / c a l l u s S h o o t l e n g t h ( c m ) B A P I A A G A 3 0 . 5 0 . 0 0 . 0 5 7 . 3 3 ± 2 . 0 8 a g 0 8 . 6 6 ± 1 . 5 2 a 0 7 . 5 7 ± 0 . 3 5 a 1 . 0 0 . 0 0 . 0 6 5 . 6 6 ± 3 . 5 1 b 0 9 . 0 0 ± 2 . 0 0 a 0 7 . 9 3 ± 0 . 5 7 a 1 . 5 0 . 0 0 . 0 8 5 . 3 3 ± 3 . 0 5 c 1 2 . 0 0 ± 1 . 0 0 b 0 8 . 8 3 ± 0 . 7 4 a 2 . 0 0 . 0 0 . 0 9 8 . 0 0 ± 2 . 0 0 d 1 4 . 0 0 ± 1 . 0 0 b 1 0 . 2 0 ± 0 . 2 6 b 0 . 5 0 . 2 0 . 0 2 0 . 3 3 ± 3 . 0 5 e 0 6 . 3 3 ± 1 . 5 3 a 0 4 . 8 0 ± 0 . 3 0 c 1 . 0 0 . 4 0 . 0 2 9 . 6 6 ± 1 . 5 3 e 0 7 . 3 3 ± 1 . 5 3 a 0 6 . 5 0 ± 0 . 2 0 c a 1 . 5 0 . 6 0 . 0 4 8 . 3 3 ± 2 . 0 8 a f 0 9 . 6 7 ± 1 . 5 4 a 0 7 . 0 0 ± 0 . 2 0 a 2 . 0 0 . 8 0 . 0 6 2 . 3 3 ± 4 . 5 1 b 1 4 . 0 0 ± 2 . 0 0 b 0 7 . 3 7 ± 0 . 1 5 a 3 . 0 1 . 0 0 . 0 9 3 . 0 0 ± 2 . 0 0 d 1 7 . 6 6 ± 1 . 5 6 c d 0 8 . 5 0 ± 0 . 3 6 a 0 . 3 0 . 0 0 . 1 4 5 . 0 0 ± 2 . 0 0 f 1 2 . 3 3 ± 1 . 5 3 b 0 5 . 0 3 ± 0 . 2 5 c 0 . 6 0 . 0 0 . 2 5 0 . 3 3 ± 3 . 2 1 f 1 5 . 0 0 ± 2 . 0 0 b d 0 5 . 1 3 ± 0 . 1 5 c 0 . 9 0 . 0 0 . 3 5 4 . 0 0 ± 3 . 0 0 a 1 5 . 6 7 ± 1 . 5 3 b d 0 5 . 2 3 ± 0 . 1 5 c 1 . 2 0 . 0 0 . 4 5 5 . 3 3 ± 2 . 0 8 a 1 6 . 6 7 ± 1 . 5 3 b d 0 5 . 2 0 ± 0 . 1 0 c 1 . 5 0 . 0 0 . 5 5 5 . 3 3 ± 1 . 5 3 a 1 7 . 0 0 ± 2 . 0 0 c d 0 5 . 3 0 ± 0 . 1 0 c 1 . 8 0 . 0 0 . 6 5 9 . 6 7 ± 3 . 0 5 g 1 8 . 0 0 ± 2 . 0 0 c d 0 5 . 6 7 ± 0 . 1 5 c 2 . 1 0 . 0 0 . 7 7 0 . 3 3 ± 1 . 5 3 b 1 9 . 6 7 ± 1 . 5 7 c d 0 5 . 9 0 ± 0 . 2 0 c 2 . 4 0 . 0 0 . 8 8 0 . 0 0 ± 1 . 0 0 c 1 9 . 0 0 ± 2 . 0 0 c d 0 5 . 9 0 ± 0 . 1 0 c 2 . 7 0 . 0 0 . 9 9 0 . 0 0 ± 2 . 0 0 e 2 0 . 3 3 ± 2 . 0 8 c d 0 6 . 6 7 ± 0 . 1 5 c a 0 . 5 0 . 0 1 . 0 9 4 . 6 7 ± 2 . 0 8 e 2 0 . 6 7 ± 1 . 5 8 c d 0 7 . 1 0 ± 0 . 2 0 a 1 . 0 0 . 2 1 . 0 4 6 . 3 3 ± 2 . 5 2 a f 0 7 . 0 0 ± 2 . 0 0 a 0 2 . 8 7 ± 0 . 2 0 d 1 . 5 0 . 4 1 . 0 5 0 . 6 7 ± 2 . 5 2 f 0 6 . 6 7 ± 1 . 5 3 a 0 2 . 9 3 ± 0 . 1 5 d 2 . 0 0 . 6 1 . 0 5 1 . 3 3 ± 2 . 5 2 f 0 6 . 0 0 ± 1 . 0 0 a 0 3 . 0 0 ± 0 . 1 0 d c 2 . 5 0 . 8 1 . 0 5 9 . 3 3 ± 2 . 0 8 g 0 7 . 0 0 ± 1 . 0 0 b 0 3 . 4 7 ± 0 . 2 5 d c 3 . 0 1 . 0 1 . 0 7 4 . 0 0 ± 2 . 0 0 b 1 1 . 3 3 ± 1 . 5 3 a 0 4 . 7 0 ± 0 . 2 0 c M e a n s i n c o l u m n s f o l l o w e d b y d i f f e r e n t l e t t e r ( s ) a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t 5 % l e v e l a c c o r d i n g t o D M R T .

E c k a n d K i t t o , 1 9 9 2 ) . S i m i l a r k i n d o f f i n d i n g s o f e f f e c t i v e r o o t f o r m a t i o n b y t h e i n f l u e n c e o f v a r i o u s t y p e s o f a u x i n s i n m a n y p l a n t s p e c i e s h a v e b e e n r e p o r t e d e l s e w h e r e ( M a l l i k a d e v i a n d P a u l s a m y , 2 0 0 9 ; M a h e s h e t a l . , 2 0 1 0 ; L o c e t a l . , 2 0 1 1 ; M u n g o l e e t a l . , 2 0 1 1 ; R a j p u t e t a l . , 2 0 1 1 ) . T h e h a r d e n i n g e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t h i g h d e g r e e o f a c c l i m a t i z a t i o n w a s a c h i e v e d b y p e r f o r m i n g 7 8 % o f p l a n t l e t s u r v i v a b i l i t y i n t h e h a r d e n i n g m e d i u m e n c o m p o s e d b y r e d s o i l , s a n d a n d v e r m i c o m p o s t i n t h e r a t i o o f 1 : 1 : 1 b y v o l u m e . H e n c e , b e f o r e t r a n s p l a n t i n g t h e p l a n t l e t s , h a r d e n i n g m u s t b e d o n e i n t h i s p r e s c r i b e d e n c o m p o s e d m e d i u m f o r h i g h e r s u r v i v a b i l i t y o f p l a n t l e t s . H o w e v e r , f i e l d o b s e r v a t i o n s c a n b e m a d e a f t e r t r a n s p l a n t a t i o n t o k n o w t h e r a t e o f s u r v i v a b i l i t y i n t h e o p e n e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s . T h e p r e s e n t p a p e r d e s c r i b e s a p r i m e a n d e a s y - t o - u s e p r o t o c o l f o r l a r g e s c a l e p r o d u c t i o n o f p l a n t l e t s o f A . a n n u a t h r o u g h l e a f c u l t u r e a n d t h e m e t h o d i s u s e f u l f o r t h e e x s i t u c o n s e r v a t i o n o f t h i s s p e c i e s a s w e l l . I n a d d i t i o n , t h e f i n d i n g s o f t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n p r o v i d e a b a s e l i n e d a t a f o r f u r t h e r r e s e a r c h i n t h i s s p e c i e s . R E F E R E N C E S A n a n t h i P , R a n j i t h a K u m a r i B D , R a m a c h a n d r a n A . 2 0 1 1 . I n v i t r o p r o p a g a t i o n o f R o r i p p a i n d i c a L . f r o m n o d a l a n d s h o o t t i p e x p l a n t s . I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l f o r B i o t e c h n o l o g y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y R e s e a r c h 2 ( 3 ) : 5 1 - 5 5 . B a s k a r a n P a n d J a y a b a l a n N . 2 0 0 5 . R o l e o f b a s a l m e d i a , c a r b o n s o u r c e s a n d g r o w t h r e g u l a t o r s i n m i c r o p r o p a g a t i o n o f E c l i p t a a l b a . A v a l u a b l e J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 7 3 - 1 7 8 1 7 7 G a n e s a n e t a l . , 2 0 1 1 T a b l e 3 . E f f e c t o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f g r o w t h r e g u l a t o r s o n r o o t n u m b e r , r o o t i n g p e r c e n t a g e a n d r o o t l e n g t h a f t e r s u b c u l t u r i n g t h e l e a f c a l l i d e r i v e d s h o o t s o f t h e s p e c i e s , A r t e m i s i a a n n u a . G r o w t h r e g u l a t o r ( m g / l ) S h o o t s r o o t e d ( % ) N o . o f r o o t s / s h o o t R o o t l e n g t h ( c m ) I B A I A A N A A 0 . 1 0 . 0 0 . 1 1 9 . 0 0 ± 1 . 0 0 a 0 5 . 0 0 ± 0 . 8 1 a 2 . 1 0 ± 0 . 2 0 a 0 . 2 0 . 0 0 . 2 2 0 . 6 6 ± 1 . 5 2 a 0 7 . 0 0 ± 0 . 8 2 b 2 . 7 0 ± 0 . 1 0 a b 0 . 3 0 . 0 0 . 3 2 2 . 6 7 ± 2 . 5 1 a 0 8 . 0 0 ± 0 . 8 5 b 3 . 0 3 ± 0 . 1 5 b 0 . 4 0 . 0 0 . 4 2 7 . 3 3 ± 1 . 5 7 b 1 0 . 6 6 ± 1 . 2 4 c 3 . 7 3 ± 0 . 1 6 b 0 . 5 0 . 0 0 . 5 2 9 . 0 0 ± 1 . 0 0 b 0 8 . 6 6 ± 1 . 2 6 b 2 . 8 0 ± 1 . 9 0 a b 0 . 0 0 . 1 0 . 1 2 2 . 3 3 ± 1 . 5 2 a 0 7 . 3 3 ± 1 . 2 7 b 3 . 4 6 ± 0 . 1 5 b 0 . 0 0 . 2 0 . 3 2 6 . 0 0 ± 1 . 0 0 b 1 0 . 0 0 ± 2 . 4 4 c 3 . 5 3 ± 0 . 1 5 b 0 . 0 0 . 3 0 . 5 2 9 . 6 7 ± 1 . 5 4 b 0 9 . 3 3 ± 1 . 2 1 c 3 . 6 3 ± 0 . 1 5 b 0 . 0 0 . 4 0 . 7 4 0 . 0 0 ± 1 . 0 0 c e 0 7 . 0 0 ± 1 . 6 4 b 3 . 8 0 ± 0 . 1 0 b 0 . 0 0 . 5 0 . 9 4 6 . 0 0 ± 1 . 0 1 d 0 9 . 0 0 ± 1 . 6 3 c 4 . 0 6 ± 0 . 1 7 b 0 . 0 0 . 1 0 . 0 3 9 . 0 0 ± 1 . 0 5 c e 1 0 . 6 7 ± 1 . 2 8 c d 2 . 1 7 ± 0 . 2 1 a 0 . 0 0 . 2 0 . 0 4 1 . 6 7 ± 2 . 0 8 c e 0 8 . 6 7 ± 1 . 2 3 b 2 . 7 0 ± 0 . 2 0 a b 0 . 0 0 . 3 0 . 0 4 2 . 6 7 ± 1 . 5 4 c e 1 0 . 0 0 ± 1 . 6 3 c 3 . 0 0 ± 0 . 1 3 b 0 . 0 0 . 4 0 . 0 4 4 . 6 8 ± 1 . 5 2 d f 0 9 . 0 0 ± 2 . 1 6 c 2 . 8 0 ± 0 . 1 0 a b 0 . 0 0 . 5 0 . 0 4 8 . 3 3 ± 1 . 2 7 f 0 8 . 6 7 ± 1 . 2 5 b 3 . 1 3 ± 0 . 2 5 b 0 . 1 0 . 0 0 . 0 5 0 . 6 6 ± 2 . 5 1 f 0 7 . 0 0 ± 1 . 6 3 b 3 . 2 0 ± 0 . 2 7 b 0 . 3 0 . 0 0 . 0 6 0 . 0 0 ± 1 . 0 0 g 0 9 . 6 6 ± 1 . 2 6 c 4 . 0 3 ± 0 . 1 5 b d 0 . 5 0 . 0 0 . 0 7 1 . 0 0 ± 2 . 0 0 h 1 1 . 6 6 ± 1 . 2 7 c d 4 . 4 3 ± 0 . 3 1 b d 0 . 7 0 . 0 0 . 0 8 0 . 0 0 ± 1 . 0 0 i 1 0 . 3 3 ± 1 . 2 0 c d 4 . 8 0 ± 0 . 2 0 d 0 . 9 0 . 0 0 . 0 8 5 . 0 0 ± 1 . 0 0 j 1 2 . 0 0 ± 0 . 8 1 d 5 . 1 0 ± 0 . 1 0 d 1 . 0 0 . 0 0 . 1 4 1 . 6 6 ± 1 . 5 2 c e 1 1 . 3 3 ± 1 . 2 7 c d 3 . 2 6 ± 0 . 1 5 b 1 . 0 0 . 0 0 . 2 4 7 . 0 0 ± 2 . 0 0 f 0 9 . 0 0 ± 1 . 6 3 c 3 . 6 0 ± 0 . 2 0 b 1 . 0 0 . 0 0 . 3 5 0 . 6 6 ± 2 . 0 8 f 0 7 . 3 3 ± 1 . 2 5 b 3 . 7 3 ± 0 . 2 0 b 1 . 0 0 . 0 0 . 4 5 6 . 0 0 ± 1 . 0 0 g 0 5 . 0 0 ± 0 . 8 1 a 3 . 7 3 ± 0 . 1 5 b 1 . 0 0 . 0 0 . 5 6 0 . 0 0 ± 1 . 0 0 g 0 6 . 0 0 ± 0 . 8 3 a 3 . 9 0 ± 0 . 1 0 b M e a n s i n c o l u m n s f o l l o w e d b y d i f f e r e n t l e t t e r ( s ) a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t 5 % l e v e l a c c o r d i n g t o D M R T .

m e d i c i n a l h e r b . K M I T L S c i . J . 5 ( 2 ) : 4 6 9 - 4 8 2 . C h e n P K , L e a t h e r G a n d P o l a t n i c k M . 1 9 9 1 . C o m p a r a t i v e s t u d y o n a r t e m i s i n i n , 2 , 4 - D , a n d g l y p h o s a t e . J . A g r . F o o d C h e m . , 3 9 : 9 9 1 - 9 9 4 . D u k e S O , V a u g h n K C , C r o o m E M a n d E l s o h l y H N . 1 9 8 7 . A r t e m i s i n i n , a c o n s t i t u e n t o f a n n u a l w o r m w e e d ( A r t e m i s i a a n n u a ) , i s a s e l e c t i v e p h y t o t o x i n . W e e d S c i e n c e 3 5 : 4 9 9 - 5 0 5 . F r a t e r n a l e D G i a m p e r i L , R i c c i D a n d R o c c h i M B L . 2 0 0 2 . M i c r o p r o p a g a t i o n o f B u p l e u r m f r u t i c o s u m : T h e e f f e c t o f t r i a c o n t a n o l . P l a n t C e l l , T i s s u e a n d O r g a n C u l t u r e 6 9 : 1 3 5 - 1 4 0 . K a r u p p u s a m y S a n d P u l l a i a h T . 2 0 0 7 . I n v i t r o s h o o t m u l t i p l i c a t i o n o f B u p l e u r u m d i s t i c h o p h y l l u m W i g h t . - A n a t i v e m e d i c i n a l p l a n t o f S o u r t h e r n I n d i a . P l a n t T i s s u e C u l t u r e & B i o t e c h n o l o g y 1 7 ( 2 ) : 1 1 5 - 1 2 4 . L o c N H a n d K i e t H V . 2 0 1 1 . M i c r o p r o p a g a t i o n o f S o l a n u m h a i n a n e n s e H a n c e . A n n a l s o f B i o l o g i c a l R e s e a r c h 2 ( 2 ) : 3 9 4 - 3 9 8 . M a h e s h C M , R a m r a j M a n d V i d y a P . 2 0 1 0 . H i g h f r e q u e n c y p l a n t r e g e n e r a t i o n f r o m s h o o t t i p e x p l a n t s o f C i t r u l l u s c o l o c y n t h i s ( L i n n . ) S c h a r e d . A n i m p o r t a n t m e d i c i n a l h e r b . A f r i c a n J o u r n a l o f B i o t e c h n o l o g y 9 ( 3 1 ) : 5 0 3 7 - 5 0 4 1 . M a l l i k a d e v i T a n d P a u l s a m y S . 2 0 0 9 . M i c r o p r o p a g a t i o n o f t h e m e d i c i n a l p l a n t P l u m b a g o z e y l a n i c a L i n n . P l a n t C e l l B i o t e c h n o l o g y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y 1 0 ( 1 & 2 ) : 6 9 - 7 4 . M a r i a n i T S , F i t r i a n i A , T e i x e i r a d a S i l v a J A , W i c a k s o n o A a n d C h i a T F . 2 0 1 1 . M i c r o p r o p a g a t i o n o f A g l a o n e m a u s i n g a x i l l a r y s h o o t e x p l a n t s . I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f B a s i c a n d A p p l i e d S c i e n c e s 1 1 ( 1 ) : 4 6 - 5 3 . M u n g o l e A J , D o i f o d e V D , K a m b l e R B , C h a t u r v e d i A a n d Z a n w a r P . 2 0 1 1 . I n - v i t r o c a l l u s i n d u c t i o n a n d s h o o t r e g e n e r a t i o n i n P h y s a l i s m i n i m a L . A n n a l s o f B i o l o g i c a l R e s e a r c h 2 ( 2 ) : 7 9 - 8 5 . M u r a s h i g e T a n d S k o o g . 1 9 6 2 . A r e v i s e d m e d i u m f o r r a p i d g r o w t h a n d b i o a s s a y s w i t h t o b a c c o t i s s u e c u l t u r e s . P h y s i o l . P l a n t 1 5 : 4 7 3 - 4 9 7 . P a u l s a m y S . 2 0 0 5 . E v a l u a t i o n o f c o n s e r v a t i o n s t r a t e g i e s f o r t h e s u s t a i n a b l e u t i l i z a t i o n o f h e r b a c e o u s b i o r e s o u r c e s i n t h e s h o a l s o f N i l g i r i s , t h e W e s t e r n G h a t s . A n n u a l P r o g r e s s R e p o r t , M i n i s t r y o f E n v i r o n m e n t a n d F o r e s t s S c h e m e , G o v t . o f I n d i a , N e w D e l h i . P a u l s a m y S , S e n t h i l k u m a r P a n d S h i v a s h a n m u g a m M . 2 0 0 8 . C l o n a l m u l t i p l i c a t i o n s t r a t e g i e s f o r m e d i c i n a l p l a n t s i n h a b i t i n g N i l g i r i B i o s p h e r e R e s e r v e , t h e W e s t e r n G h a t s , I n d i a . J o u r n a l o f T h e o r e t i c a l a n d E x p e r i m e n t a l B i o l o g y 4 ( 3 ) : 1 1 5 - 1 1 9 . R a j p u t H J , J a d h a v S B a n d K a t w a t e S M . 2 0 1 1 . E f f e c t o f g r o w t h r e g u l a t o r s o n c a l l u s i n i t i a t i o n a n d p l a n t l e t r e g e n e r a t i o n f r o m l e a f e x p l a n t s i n G e r b e r a j a m e s o n i i B o l u s . A d . P l a n t S c i . 2 4 ( 1 ) : 2 1 - 2 4 . R o y A , G h o s h S , C h a u d h u r i M a n d S a h a P K . 2 0 0 8 . E f f e c t o f d i f f e r e n t p l a n t h o r m o n e s o n c a l l u s i n d u c t i o n i n G y m n e m a s y l v e s t r i s R . B r . ( A s c l e p i d a c e a e ) . A f r i c a n J o u r n a l o f B i o t e c h n o l o g y 7 ( 1 3 ) : 2 2 0 9 - 2 2 1 1 . S e n t h i l k u m a r P a n d P a u l s a m y S . 2 0 1 0 a . S t a n d a r d i z a t i o n o f p r o t o c o l f o r t h e p r o p a g a t i o n o f t h e e x o t i c m e d i c i n a l h e r b , A g e r a t u m c o n y z o i d e s b y e m p l o y i n g t i s s u e c u l t u r e t e c h n o l o g y . J o u r n a l o f E x o t o x i c o l o g y a n d E n v i r o n m e n t M o n i t o r i n g 2 0 ( 4 ) : 3 9 3 - 4 0 0 . S e n t h i l k u m a r P a n d P a u l s a m y S . 2 0 1 0 b . C o n s e r v a t i o n o f a n e n d e m i c m e d i c i n a l p l a n t , A n a p h a l i s e l i p t i c a D C . b y e m p l o y i n g p l a n t t i s s u e c u l t u r e t e c h n i q u e . J o u r n a l o f A p p l i e d a n d N a t u r a l S c i e n c e 2 ( 1 ) : 1 7 - 2 1 . S u n d a r A N a n d J a w a h a r M . 2 0 1 1 . I n v i t r o p l a n t r e g e n e r a t i o n f r o m l e a f a n d s t e m e x p l a n t s o f S o l a n u m x a n t h o c a r p u m S c h a r d & W e n d l . a n i m p o r t a n t m e d i c i n a l h e r b . A d . P l a n t S c i . 2 4 ( 1 ) : 1 - 3 . V a n E c k J M . a n d K i t t o S L . 1 9 9 2 . R e g e n e r a t i o n o f p e p p e r m i n t a n d o r a n g e m i n t f r o m l e a f d i s k s . P l a n t C e l l , T i s s u e a n d O r g a n C u l t u r e 3 0 ( 1 ) : 4 1 - 4 9 . V i j a y k u m a r i P , K a v i K i s h o r e P B a n d B h a l l l a J K . 2 0 0 1 . I n v i t r o p l a n t r e g e n e r a t i o n i n p i g e o n p e a ( C a j a n u s c a j a n ( L . ) M i l l s p ) v i a o r g a n o g e n e s i s . P l a n t C e l l B i o t e c h n o l o g y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y 2 : 4 9 - 5 6 . 1 7 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 7 3 - 1 7 8 G a n e s a n e t a l . , 2 0 1 1