J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y D N A b a r c o d i n g , p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s a n d s p e c i a t i o n o f G e n u s : P l e c t r o p o m u s i n A n d a m a n c o a s t K e y w o r d s : D N A b a r c o d e , S e r r a n i d a e , P h y l o g e n e t i c a n d A n d a m a n S e a . A B S T R A C T : D N A b a r c o d e t e c h n i q u e h a s b e e n r e c e n t l y p r o m o t e d a s a m e t h o d f o r b o t h a s s i g n i n g s p e c i m e n s t o k n o w n s p e c i e s a n d f o r d i s c o v e r i n g n e w a n d c r y p t i c s p e c i e s . T h e p r e s e n t s t u d y c a r r i e d o u t f o r t h e b a r c o d e s e q u e n c e s f o r i d e n t i f i c a t i o n o f t h e P l e c t r o p o m u s l e o p a r d u s . T h e r e s u l t s o f s h o r t e r s e q u e n c e 1 1 3 b p o f P l e c t r o p o m u s l e o p a r d u s i s e f f e c t i v e t o i d e n t i f y a s p e c i m e n a n d c o n f i r m u p t o a s p e c i e s l e v e l . T h i s s e q u e n c e a l s o e x h i b i t e d d e e p i n t e r s p e c i f i c d i v e r g e n c e s t h a t a l l o w e d f o r e f f i c i e n t d i s c r i m i n a t i o n a m o n g t h e G r o u p e r s p e c i e s . T h i s m i n i b a r c o d e s e q u e n c e t e c h n i q u e m i g h t b e u s e d e f f i c i e n t l y t o d i s t i n g u i s h P l e c t r o p o m u s l e o p a r d u s w i t h m i n i m a l e x p e n d i t u r e a n d e f f o r t s . T h e s e r e s u l t s a l s o s u p p o r t t h a t f o r m a l i n f i x a t i o n s a m p l e s c a n a l s o b e u s e d f o r D N A m o l e c u l a r t a x o n o m y . 1 7 9 - 1 8 3 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 3 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : S a c h i t h a n a n d a m ¹ V , M o h a n ¹ P M , D h i v y a ¹ P , M u r u g a n a n d a m 2 N , B a s k a r a n ¹ R , C h a a i t h a n y a ² I K a n d V i j a y a c h a r i ² P . I n s t i t u t i o n : 1 . D e p a r t m e n t o f O c e a n S t u d i e s a n d M a r i n e B i o l o g y , P o n d i c h e r r y U n i v e r s i t y , A n d a m a n a n d N i c o b a r I s l a n d s , I n d i a . 2 . R e g i o n a l M e d i c a l R e s e a r c h c e n t r e ( I C M R ) , A n d a m a n a n d N i c o b a r I s l a n d s , I n d i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : D r . P M . M o h a n , P h . D . , E m a i l : p m m t u @ y a h o o . c o m , p m m p u @ r e d i f f m a i l . c o m P h o n e N o : + 9 1 - 9 4 3 4 2 8 3 2 9 2 W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 5 6 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 4 J u l 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 0 8 J u l 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 1 8 J u l 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : S a c h i t h a n a n d a m V , M o h a n P M , D h i v y a P , M u r u g a n a n d a m N , B a s k a r a n R , C h a a i t h a n y a I K a n d V i j a y a c h a r i P . D N A b a r c o d i n g , p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s a n d s p e c i a t i o n o f G e n u s : P l e c t r o p o m u s i n A n d a m a n c o a s t J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 7 9 - 1 8 3 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h p a p e r

I N T R O D U C T I O N P i s c e s p h y l u m i s a h i g h l y d i v e r s e g r o u p a m o n g t h e v e r t e b r a t e a n d e x h i b i t a d e e p p h e n o t y p i c c h a n g e s d u r i n g d e v e l o p m e n t ; i t s i d e n t i f i c a t i o n a n d c o n f i r m a t i o n n e e d s a m o d e r n t o o l . A m o n g a l l t h e m e t h o d s D N A b a r c o d e i s a n e f f i c i e n t m e t h o d f o r s p e c i e s - l e v e l i d e n t i f i c a t i o n u s i n g a n a r r a y o f s p e c i e s s p e c i f i c m o l e c u l a r t a g s d e r i v e d f r o m 5 9 r e g i o n o f t h e m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e c o x i d a s e I ( m t C O I ) g e n e ( w a r d e t a l . , 2 0 0 5 ) . T w e n t y - e i g h t s p e c i e s h a v e b e e n r e p o r t e d u n d e r E p i n e p h e l u s , f r o m t h e e a s t a n d w e s t c o a s t s o f I n d i a a n d t h e i s l a n d s o f L a k s h a d w e e p i n t h e A r a b i a n S e a a n d A n d a m a n a n d N i c o b a r i n t h e B a y o f B e n g a l ( J a m e s e t a l . , 1 9 9 6 ) . G e n e r a l l y g r o u p e r s a r e i d e n t i f i e d b y t h e i r c o l o u r p a t t e r n s o r a s u i t e o f m o r p h o l o g i c c h a r a c t e r s l i k e b o d y c o n f i g u r a t i o n , s i z e , n u m b e r o f b o d y p a r t s e t c . T h o u g h g e n e r a l l y t h e c o l o u r p a t t e r n s i n m e d i u m - s i z e d f i s h e s a r e d i s t i n c t i v e e n o u g h t o i d e n t i f y d i f f e r e n t s p e c i e s , o n e n e e d t o b e a w a r e o f i n t r a s p e c i f i c v a r i a t i o n s i n c o l o u r p a t t e r n s o f j u v e n i l e s , w h i c h m a y b e c o m p l e t e l y d i f f e r e n t f r o m t h e a d u l t s o f t h e s a m e s p e c i e s ( H e e m s t r a a n d R a n d a l l , 1 9 9 3 ) . H e n c e i d e n t i f i c a t i o n b a s e d o n m o r p h o l o g y i n g r o u p e r s h a s t o b e s u p p o r t e d b y o t h e r t e c h n i q u e s i n c l u d i n g D N A b a r c o d i n g . C o n s e q u e n t l y t h e p h y l o g e n e t i c b a s e d s t u d y r e l a t e d t o s e r r i a n i d a e f i s h e s a r e v e r y l e s s r e p o r t e d i n A n d a m a n a n d N i c o b a r I s l a n d s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S S a m p l e c o l l e c t i o n a n d p r e s e r v a t i o n F a m i l y S e r r i a n i d a e ( G r o u p e r ) w e r e c o l l e c t e d f r o m l o c a l f i s h l a n d i n g c e n t r e a t P o r t B l a i r , A n d a m a n . C o l l e c t e d s a m p l e s w e r e i d e n t i f i e d m o r p h o m e t r i c a l l y w i t h F A O s h e e t s ( H e e m s t r a a n d R a n d a l l , 1 9 9 3 ) a n d s t o r e d i n f o r m a l i n . T h e p i e c e o f m u s c l e c o l l e c t e d a b o v e t h e l a t e r a l l i n e w a s s t o r e d a t - 2 0 ° C f o r D N A e x t r a c t i o n . D N A e x t r a c t i o n a n d P C R r e a c t i o n T o t a l D N A e x t r a c t e d f r o m 0 . 2 5 g o f t i s s u e b y t h e s t a n d a r d p r o t e i n a s e - K / p h e n o l - c h l o r o f o r m - i s o a m y l a l c o h o l - e t h a n o l m e t h o d ( S a m b r o o k e t a l . , 1 9 8 9 ) . A n a p p r o x i m a t e l y 6 5 0 b p s e c t i o n o f t h e m i t o c h o n d r i a l ( m t ) D N A g e n o m e f r o m t h e C O I g e n e w a s a m p l i f i e d u s i n g p u b l i s h e d u n i v e r s a l p r i m e r o f t w o s e t ( W a r d e t a l . , 2 0 0 5 ) . T h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) c o m p o n e n t s p e r 5 0 m l r e a c t i o n w e r e a s f o l l o w s : P C R b u f f e r ( 1 0 X ) , M g C l 2 ( 2 5 m M ) , d N T P ( 1 0 m m ) , F o r w a r d P r i m e r ( 3 0 n g / m l ) , R e v e r s e P r i m e r ( 3 0 n g / m L ) 1 m l , T a q p o l y m e r a s e ( 3 U ) , u l t r a p u r e w a t e r , D N A ( 1 0 0 n g / m l ) . T h e P C R c y c l i n g p a r a m e t e r s w e r e a s f o l l o w s , i n 9 5 ° C f o r 5 m i n t h e T a q P o l y m e r a s e w e r e i n i t i a l l y d e n a t u r e d f o l l o w e d b y 4 0 c y c l e s o f d e n a t u r a t i o n f o r 3 0 s e c a t 9 5 ° C , a n n e a l i n g a t 5 8 ° C f o r 6 0 s e c a n d e x t e n s i o n a t 7 2 ° C f o r 6 0 s e c , A f t e r t h e c o m p l e t i o n o f 4 0 c y c l e s a f i n a l e x t e n s i o n s t e p o f 7 m i n t s a t 7 2 ° C w a s p e r f o r m e d . T h e P C R p r o d u c t s w e r e t e s t e d i n 1 % A g a r o s e g e l , v i s u a l i z e d a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g G e l D o c S y s t e m . N u c l e o t i d e s e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d u s i n g t h e S a n g e r m e t h o d ( S a n g e r e t a l . , 1 9 7 7 ) m o d i f i e d b y C h e n a n d S e e b u g ( C h e n , e t a l . , 1 9 8 5 ) . S e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d u s i n g B i g D y e T e r m i n a t o r C y c l e S e q u e n c i n g k i t , f o l l o w i n g m a n u f a c t u r e r ’ s i n s t r u c t i o n s ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A , U S A ) . T h e s e q u e n c i n g w a s d o n e b o t h i n t h e f o r w a r d a n d r e v e r s e d i r e c t i o n s . S e q u e n c e A n a l y s i s T h e D N A s e q u e n c e s o f p h e n o t y p i c a l l y i d e n t i f i e d f i s h e s w e r e a s s e m b l e d u s i n g t h e S e q M a n I I v e r s i o n 5 . 0 3 ( D N A S T A R ) a n d a l i g n e d u s i n g C l u s t a l W p a i r w i s e a n d m u l t i p l e a l i g n m e n t w a s c o m p l e t e d f o r p h y l o g e n e t i c i d e n t i f i c a t i o n . M o l e c u l a r e v o l u t i o n a r y a n a l y s e s w e r e c o n d u c t e d u s i n g M E G A v e r s i o n 4 ( T a m u r a e t a l . , 2 0 0 7 ) . R E S U L T D N A s e q u e n c e s w e r e s u b m i t t e d t o G e n B a n k ( P u b M e d ) a n d t h e i r a c c e s s i o n n u m b e r i s J F 4 1 4 5 9 4 ( T a b l e . 1 ) . O u t o f 6 5 1 – 6 5 5 b p b a s i c t a x o n o m i c s e q u e n c e s l e n g t h , t h e p r e s e n t s t u d y e x h i b i t t h e s e q u e n c e s o f 1 1 3 b p f o r P l e c t r o p o m u s l e o p a r d u s . A l l a s s e m b l a g e s o f c o n s p e c i f i c i n d i v i d u a l s h a d b o o t s t r a p s u p p o r t o f v e r y v a s t s p e c i e s d i v e r g e n c e s c o m p a r e d w i t h o t h e r s a m e s p e c i e s D N A s e q u e n c e s c o l l e c t e d f r o m N C B I g e n b a n k a n d a l g o r i t h m s u s e d i n M E G A 4 . T h e o v e r a l l a v e r a g e w i t h i n s p e c i e s K 2 P d i s t a n c e s i s 0 . 2 1 6 1 8 , w i t h v e r y l e s s i n E U 5 9 5 2 3 3 P l e c t r o p o m u s l e o p a r d u s , f o r D Q 1 0 1 2 7 0 P l e c t r o p o m u s l e o p a r d u s . W h i l e G U 6 7 4 0 4 7 p e r c i f o r m e s s p e c i e s w i t h 5 2 % w e r e s l i g h t l y s h o w i n g h i g h e r d i s t a n c e s . T h e c o n g e n e r i c d i s t a n c e s w a s 3 4 % w h i c h w a s h i g h e r t h a n c o n s p e c i f i c d i s t a n c e s o f s p e c i e s c o m p a r e d w i t h A n d a m a n P l e c t r o p o m u s l o e p a r d u s d i s t a n c e a n d i t s r a n g e i s 1 0 - 1 1 % . D I S C U S S I O N A N D C O N C L U S I O N S T h e s e q u e n c e r e s u l t s o f D N A b a r c o d e f o r P l e c t r o p o m u s l e o p a r d u s r e v e a l e d t h e p o t e n t i a l a b i l i t y o f m i n i - b a r c o d e s t o d i s c r i m i n a t e a m o n g s p e c i e s . W h i l e m i n i - b a r c o d e s p r o d u c e d d i v e r g e n c e v a l u e s c o m p a r a b l e t o f u l l - l e n g t h b a r c o d e s i n b o t h 1 8 0 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 7 9 - 1 8 3 S a c h i t h a n a n d a m e t a l . , 2 0 1 1

d a t a s e t s , t h e y w e r e s o m e w h a t l e s s e f f e c t i v e i n d i s c r i m i n a t i n g a m o n g t h e s p e c i e s i n l a r g e a s s e m b l a g e s ( e . g . 2 0 4 s p e c i e s o f A u s t r a l i a n f i s h e s ) . H o w e v e r , m o s t a p p l i c a t i o n s o f m i n i b a r c o d e s w i l l n o t i n v o l v e c a s e s t h a t s e e k t o p l a c e a s p e c i m e n a m o n g a l l k n o w n s p e c i e s , b u t r a t h e r w i t h i n a s m a l l a s s e m b l a g e . I n t h e s p e c i e s o f P l e c t r o p o m u s l e o p a r d u s , m i n i - b a r c o d e s w e r e p o s i t i o n e d s p e c i f i c a l l y t o d i s c r i m i n a t e t h i s s p e c i e s p a i r , a n d t h e i r r e l a t i v e l y s h o r t l e n g t h s t o o k i n t o a c c o u n t t h e o l d a g e o f t h e s p e c i m e n s . I n a d d i t i o n , t h e f a c t t h a t t h e f o r w a r d p r i m e r s i n t h e t w o m i n i - b a r c o d e s w e r e d e s i g n e d s p e c i f i c a l l y f o r t h i s s p e c i e s c o m p l e x m i g h t h a v e p o s i t i v e l y i n f l u e n c e d t h e c h a n c e o f a m p l i f y i n g p o t e n t i a l l y d e g r a d e d D N A . I n t e r e s t i n g l y , a s i m i l a r s i z e d f r a g m e n t f r o m t h e o t h e r e n d o f t h e b a r c o d e r e g i o n w o u l d h a v e a c h i e v e d i d e n t i f i c a t i o n . F u l l - l e n g t h b a r c o d e s e q u e n c e s c a n b e e a s i l y a n d c h e a p l y o b t a i n e d f r o m r e c e n t l y c o l l e c t e d t i s s u e o r f r o m t h o s e p r e s e r v e d f o r D N A e x t r a c t i o n ( H a j i b a b a e i e t a l . 2 0 0 5 ) . T h e r e s u l t a n t r e c o r d s p r o v i d e a ‘ g o l d s t a n d a r d ’ w i t h h i g h c o n f i d e n c e f o r s p e c i e s d i s c r i m i n a t i o n w i t h i n l a r g e s p e c i e s p o o l s ( H e b e r t e t a l . 2 0 0 3 a , 2 0 0 3 b ; S m i t h e t a l . 2 0 0 5 , 2 0 0 6 ; W a r d e t a l . 2 0 0 5 ; H a j i b a b a e i e t a l . 2 0 0 6 ) . T h i s s t u d y c o n f i r m s t h a t s h o r t b a r c o d e s e q u e n c e s ( 1 1 3 b p ) a r e a l s o v a l u a b l e f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f s p e c i m e n s f r o m s e l e c t e d n a r r o w t a x o n o m i c a r r a y s , s u c h a s c o m p a r i n g a n e w l y c o l l e c t e d s p e c i m e n . S i m i l a r l y , i t m a y w e l l b e p o s s i b l e t o e m p l o y m i n i - b a r c o d e s f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f f o r m a l i n - f i x e d s a m p l e s , w h i c h o f t e n c o n t a i n h i g h l y f r a g m e n t e d D N A ( S c h a n d e r & K e n n e t h 2 0 0 3 ) . M i n i - b a r c o d e s m a y a l s o p r o v i d e t h e o p t i o n t o e m p l o y a l t e r n a t i v e s e q u e n c i n g m e t h o d s , s u c h a s p y r o s e q u e n c i n g ( F a k h r a i - R a d e t a l . 2 0 0 2 ) , t h a t y i e l d o n l y s h o r t s e q u e n c e s , b u t o f f e r l o w e r c o s t s a n d h i g h e r t h r o u g h p u t t h a n s t a n d a r d a p p r o a c h e s . T h e s t u d y h a s s u c c e s s f u l l y p r o v e d t h e u t i l i t y o f C O I d i v e r g e n c e s i n i d e n t i f y i n g a l l t h e P l e c t r o p o m u s l e o p a r d u s f i s h e s i n A n d a m a n S e a w i t h m i n i m u m b a s e p a i r ( 1 1 3 ) . T h e p r e s e n t a n a l y s i s w a s n o t m e a n t t o b e e x h a u s t i v e , b u t t o h i g h l i g h t t h e m o s t i m p o r t a n t f e a t u r e o f m t C O I s e q u e n c e s i n d i s t i n g u i s h i n g c l o s e l y r e l a t e d s p e c i e s a n d i n t r a - s p e c i f i c d i s t a n c e s w h i c h p r o v e b e y o n d d o u b t . F u r t h e r s t u d i e s i n v o l v i n g o t h e r f a m i l y a n d g r o u p s o f m a r i n e f i s h e s o f t h e a r e a a n d a l s o b y i n c r e a s i n g t h e s a m p l e s i z e i n f u t u r e s t u d i e s w i l l c l a r i f y t h e i s s u e s . A C K N O W L E D G M E N T W e a r e t h a n k f u l t o t h e a u t h o r i t i e s w h o p r o v i d e d f a c i l i t y , t o c a r r y o u t t h i s w o r k i n P o n d i c h e r r y U n i v e r s i t y a n d R e g i o n a l M e d i c a l R e s e a r c h C e n t r e ( I C M R ) , P o r t B l a i r . R E F E R E N C E C h e n E Y , S e e b u r g P H . 1 9 8 5 . S u p e r c o i l s e q u e n c i n g : a f a s t a n d s i m p l e m e t h o d f o r s e q u e n c i n g p l a s m i d D N A . D N A 2 : 1 6 5 - 1 7 0 . F a k h r a i - R a d H , P o u r m a n d N , R o n a g h i M . 2 0 0 2 . P y r o s e q u e n c i n g : a n a c c u r a t e d e t e c t i o n p l a t f o r m f o r s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s . H u m a n M u t a t i o n 1 9 : 4 7 9 - 4 8 5 . H a j i b a b a e i M , G r e g o r y A , S i n g e r C , H i c k e y D A . 2 0 0 6 . B e n c h m a r k i n g D N A B a r c o d i n g : a n a s s e s s m e n t u s i n g a v a i l a b l e p r i m a t e s e q u e n c e s . G e n o m e 4 9 : 8 5 1 - 8 5 4 . D o i : 1 0 . 1 1 3 9 / G 0 6 - 0 2 5 . H a j i b a b a e i H , D e W a r d J R , I v a n o v a N V , R a t n a s i n g h a m S , D o o h R T , K i r k S L , M a c k i e P M , H e b e r t P D N . 2 0 0 5 . C r i t i c a l f a c t o r s f o r a s s e m b l i n g a h i g h v o l u m e o f D N A b a r c o d e s . P h i l . T r a n s . R . S o c . B . 1 0 : 1 - 9 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 7 9 - 1 8 3 1 8 1 S a c h i t h a n a n d a m e t a l . , 2 0 1 1 D e f i n i t i o n L o c u s P l e c t r o p o m u l e o p a r d u s C O I g e n e C D S A c c e s s i o n N u m b e r J F 4 1 4 5 9 4 S u b m i t t e d D a t e V R T 0 8 - A P R - 2 0 1 1 C l a s s i f i c a t i o n E u k a r y o t a ; M e t a z o a ; C h o r d a t a ; C r a n i a t a ; V e r t e b r a t a ; E u t e l e o s t o m i ; A c t i n o p t e r y g i i ; N e o p t e r y g i i ; T e l e o s t e i ; E u t e l e o s t e i ; N e o t e l e o s t e i ; A c a n t h o m o r p h a ; A c a n t h o p t e r y g i i ; P e r c o m o r p h a ; P e r c i f o r m e s ; P e r c o i d e i ; S e r r a n i d a e ; E p i n e p h e l i n a e ; P l e c t r o p o m u s . A l i g n m e n t o f P a r t i a l S e q u e n c e o f C O I G e n e 1 1 3 b p . P l e c t r o p o m u s l e o p a r d u s . > 1 t c a t t a a c a t g a a a c c c c c t g c t a t c t c t c a a t a c c a g a c c c c c c t a t t c g t a t g a g c a g t c c t a a t t a c t g c a g t t c t t c t t c t c c t a t c a c t a c c t g t t c t a g c t g c t g g a . P r o t e i n _ I D , T r a n s l a t e D e t a i l s = " A E B 3 1 2 2 8 " = " I N M K P P A I S Q Y Q T P L F V W A V L I T A V L L L L S L P V L A A G " T a b l e 1 D N A S e q u e n c e s d e t a i l s o f P l e c t r o p o m u s l e o p a r d u s i n G e n B a n k f i l e s v e r s i o n