J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y M i c r o b i a l d i v e r s i t y a n d b i o r e m e d i a t i o n o f d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t K e y w o r d s : D i s t i l l e r y e f f l u e n t , M i c r o b i a l d i v e r s i t y , B i o r e m e d i a t i o n , P h y s i c o - C h e m i c a l a n a l y s i s . A B S T R A C T : T h e r o l e o f c y a n o b a c t e r i a i n d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t w a s s t u d i e d i n K a n c h i p u r a m T a m i l n a d u , I n d i a . T o t a l l y 1 2 s p e c i e s o f c y a n o b a c t e r i a b e l o n g i n g t o 6 g e n e r a f a l l i n g u n d e r 4 f a m i l i e s w e r e i d e n t i f i e d . S i x d i f f e r e n t g e n e r a o f b a c t e r i a a n d 3 d i f f e r e n t g e n e r a o f f u n g i w e r e i s o l a t e d a n d i d e n t i f i e d . A m o n g t h e c y a n o b a c t e r i a i s o l a t e d , N o s t o c m u s c o r u m w a s s e l e c t e d t o t r e a t t h e e f f l u e n t . D i s t i l l e r i e s e f f l u e n t w a s t h e p o t e n t i a l s o u r c e o f c y a n o b a c t e r i a . N o s t o c m u s c o r u m w a s f o u n d t o b e t h e m o s t d o m i n a t e d g e n u s i n t h i s e f f l u e n t ( h e t e r o c y s t o r g a n i s m ) . T h e i n o c u l a t i o n o f N o s t o c m u s c o r u m r e s u l t e d i n r e m o v a l o f v a r i o u s c h e m i c a l s a s w e l l a s n u t r i e n t s s u c h a s n i t r o g e n , a m m o n i a a n d p h o s p h o r u s f r o m t h e e f f l u e n t . I t i s c o n c l u d e d t h a t N o s t o c m u s c o r u m , a c y a n o b a c t e r i a f o u n d i n t h e d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t , c o u l d b e p o t e n t i a l l y e m p l o y e d f o r t h e t r e a t m e n t o f d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t . 1 5 3 - 1 6 2 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 3 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : G a n a p a t h y S e l v a m G 1 , B a s k a r a n R 2 a n d M o h a n P M 3 . I n s t i t u t i o n : 1 D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , A . V . V . M , S r i P u s h p a m C o l l e g e ( A u t o n o m o u s ) , T h a n j a v u r , T a m i l N a d u , I n d i a . 2 a n d 3 D e p a r t m e n t o f O c e a n S t u d i e s a n d M a r i n e B i o l o g y , P o n d i c h e r r y U n i v e r s i t y , P o r t B l a i r , A n d a m a n a n d N i c o b a r I s l a n d - 7 4 4 1 0 3 , I n d i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : B a s k a r a n R . E m a i l : s i v a n . t h a m i l a n @ g m a i l . c o m P h o n e N o : 0 3 1 9 2 2 1 3 1 2 6 F a x : 0 3 1 9 2 2 6 1 5 6 8 W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 4 9 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 2 2 J u n 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 0 2 J u l 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 0 7 J u l 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : G a n a p a t h y S e l v a m G , B a s k a r a n R a n d M o h a n P M . M i c r o b i a l d i v e r s i t y a n d b i o r e m e d i a t i o n o f d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 5 3 - 1 6 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h p a p e r

I N T R O D U C T I O N B i o r e m e d i a t i o n i s a p o l l u t i o n c o n t r o l t e c h n o l o g y t h a t u s e s b i o l o g i c a l s y s t e m s t o c a t a l y s e t h e d e g r a d a t i o n o r t r a n s f o r m a t i o n o f v a r i o u s t o x i c c h e m i c a l s t o l e s s h a r m f u l f o r m s . P o l l u t i o n o f w a t e r a n d l a n d d u e t o h a z a r d o u s t o x i c w a s t e s h a s b e c o m e a m a j o r g l o b a l c o n c e r n . T h e i n d u s t r i a l , m u n i c i p a l a n d a g r i c u l t u r a l w a s t e s w h i c h a r e l e g a l l y o r i l l e g a l l y d i s c h a r g e d i n t o t h e e n v i r o n m e n t a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e e n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o n ( L a n g e t a l . , 1 9 9 9 a n d B a k a r e e t a l . , 2 0 0 3 ) . A m o n g t h e m a j o r i n d u s t r i e s i n I n d i a , d i s t i l l e r y i s o n e o f t h o s e t h a t c o n t r i b u t e t o w a t e r p o l l u t i o n . T h e r e a r e n e a r l y 2 9 0 d i s t i l l e r y u n i t p r e s e n t i n I n d i a , o f w h i c h , 1 7 u n i t s a r e l o c a t e d i n T a m i l n a d u . A l l t h e s e d i s t i l l e r y i n d u s t r i e s u s e m o l a s s e s o b t a i n e d f r o m s u g a r i n d u s t r i e s a s r a w m a t e r i a l a n d g e n e r a t e l a r g e a m o u n t e f f l u e n t s . A l c o h o l i s s e p a r a t e d b y d i s t i l l a t i o n a n d t h e r e s i d u a l l i q u o r i s d i s c h a r g e d a s e f f l u e n t . T h i s e f f l u e n t c a l l e d a s s p e n t w a s h , i s h o t , p H i s h i g h l y a c i d i c , d a r k c o l o u r e d n a t u r e . E s t i m a t e d q u a n t i t y o f d i s t i l l e r y w a s t e g e n e r a t e d i n I n d i a i s 8 0 5 7 k i l o l i t r e s p e r d a y . T h e w a s t e i s h i g h l y h a z a r d o u s i n n a t u r e b e c a u s e o f v e r y h i g h C O D a n d B O D l e v e l s . S a t y a w a l i a n d B a l a k r i s h n a n ( 2 0 0 8 ) s t u d i e d t h e m o l a s s e s - b a s e d d i s t i l l e r i e s a r e o n e o f t h e m o s t p o l l u t i n g i n d u s t r i e s g e n e r a t i n g l a r g e v o l u m e s o f h i g h s t r e n g t h w a s t e w a t e r . D i f f e r e n t p r o c e s s e s c o v e r i n g a n a e r o b i c , a e r o b i c a s w e l l a s p h y s i c o - c h e m i c a l m e t h o d s h a v e b e e n e m p l o y e d t o t r e a t t h i s e f f l u e n t . A n a e r o b i c t r e a t m e n t i s t h e m o s t a t t r a c t i v e p r i m a r y t r e a t m e n t d u e t o o v e r 8 0 % B O D r e m o v a l c o m b i n e d w i t h e n e r g y r e c o v e r y i n t h e f o r m o f b i o g a s . F u r t h e r t r e a t m e n t t o r e d u c e r e s i d u a l o r g a n i c l o a d a n d c o l o u r i n c l u d e s v a r i o u s : ( i ) b i o l o g i c a l m e t h o d s e m p l o y i n g d i f f e r e n t f u n g i , b a c t e r i a a n d a l g a e , a n d ( i i ) P h y s i c o - c h e m i c a l m e t h o d s s u c h a s a d s o r p t i o n , c o a g u l a t i o n / p r e c i p i t a t i o n , o x i d a t i o n a n d m e m b r a n e f i l t r a t i o n . I n r e c e n t y e a r s , u r b a n p e o p l e a r e f a c i n g m a n y p r o b l e m s a n d w a t e r p o l l u t i o n i s o n e a m o n g t h e m . E n v i r o n m e n t a l i s t a n d g o v e r n m e n t a r e l o o k i n g f o r e f f i c i e n t , c h e a p a n d l a s t i n g s o l u t i o n s t o w a s t e t r e a t m e n t a n d r e c y c l i n g . P h y s i c o - c h e m i c a l m e t h o d s o f w a s t e w a t e r t r e a t m e n t a r e i n e v i t a b l y c o s t i n t e n s i v e a n d c a n n o t b e e m p l o y e d i n a l l i n d u s t r i e s e s p e c i a l l y i n d e v e l o p i n g c o u n t r i e s l i k e I n d i a . H e n c e , i n r e c e n t y e a r s , t h e i m p o r t a n c e o f b i o l o g i c a l t r e a t m e n t s y s t e m s h a s a t t r a c t e d t h e a t t e n t i o n o f w o r k e r s a l l o v e r t h e w o r l d a n d h a s h e l p e d i n d e v e l o p i n g r e l a t i v e l y e f f i c i e n t , l o w c o s t w a s t e t r e a t m e n t s y s t e m s . A l g a l s y s t e m s , m o r e p a r t i c u l a r l y t h e c y a n o b a c t e r i a , a r e n o t o n l y u s e f u l i n t r e a t i n g t h e w a s t e b u t a l s o p r o d u c i n g a v a r i e t y o f u s e f u l b y p r o d u c t s f r o m t h e b i o m a s s ( S u b r a m a n i a n a n d S h a n m u g a s u n d a r a m , 1 9 8 6 ) . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f C y a n o b a c t e r i a E f f l u e n t w a s c o l l e c t e d f r o m t h e D i s t i l l e r i e s , P a d a p p a i , K a n c h i p u r a m ( T N ) , I n d i a w h e r e o v e r d i l u t e d e f f l u e n t h a s b e e n r e l e a s e d f r o m t h e f a c t o r y . S t a n d a r d m i c r o b i o l o g i c a l m e t h o d s w e r e f o l l o w e d f o r i s o l a t i o n o f C y a n o b a c t e r i a f r o m t h e s e s a m p l e s . A l g a l s a m p l e s w e r e m i c r o s c o p i c a l l y e x a m i n e d a n d p l a t e d o n s o l i d a g a r m e d i u m - B G 1 1 ( R i p p k a e t a l . , 1 9 7 9 ) . T h e i n o c u l a t e d p l a t e s w e r e i n c u b a t e d i n c u l t u r e r o o m ( t e m p e r a t u r e m a i n t a i n e d a t 2 5 ± 2 o C f i t t e d w i t h c o o l w h i t e f l u o r e s c e n t t u b e e m i t t i n g 2 5 0 0 l u x f o r 1 8 h r s a d a y ) a n d w e r e r e g u l a r l y e x a m i n e d f o r t h e g r o w t h o f c y a n o b a c t e r i a . C o l o n i e s a p p e a r i n g o n s o l i d m e d i u m w e r e p i c k e d u p a n d t r a n s f e r r e d t o l i q u i d m e d i u m . B y r e p e a t e d s t r e a k i n g , c u l t u r e s w e r e m a d e u n i a l g a l a n d m a i n t a i n e d i n B G 1 1 l i q u i d m e d i u m . I d e n t i f i c a t i o n o f a l g a l f o r m s w a s m a d e w i t h t h e h e l p o f k e y s g i v e n b y D e s i k a c h a r y ( 1 9 5 9 ) a n d G e i t l e r ( 1 9 3 2 ) . I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f f u n g i S t a n d a r d s e r i a l d i l u t i o n m e t h o d w a s u s e d f o r t h e i s o l a t i o n o f f u n g u s , 1 m l o f d i l u t e d s a m p l e w a s p l a t e d i n p e t r i d i s h e s c o n t a i n i n g P o t a t o D e x t r o s e A g a r m e d i u m a c c u m u l a t e d w i t h S t r e p t o m y c i n s u l f a t e 1 0 0 µ g / m l ( P D A ) t o i n h i b i t t h e b a c t e r i a l g r o w t h . T h e f u n g u s w e r e p u r i f i e d a n d m o u n t e d o v e r a c l e a n s l i d e , s t a i n e d w i t h l a c t o p h e n o l a n d c o t t o n b l u e a n d o b s e r v e d u n d e r t h e m i c r o s c o p e . T h e f u n g u s w e r e i d e n t i f i e d b y u s i n g s t a n d a r d m a n u a l s , s u c h a s M a n u a l o f s o i l f u n g i ( G i l l m a n , 1 9 5 7 ) , D e m a t i a c e o u s H y p h o m y c e t e s ( E l l i s , 1 9 7 1 ) , M o r e D e m a t i a c e o u s H y p h o m y c e t e s ( E l l i s , 1 9 7 6 ) , H y p h o m y c e t e s ( S u b r a m a n i a n , 1 9 7 1 ) . I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f B a c t e r i a B a c t e r i a w e r e i s o l a t e d b y s t a n d a r d m e t h o d u s i n g n u t r i e n t a g a r . ( D i f c o M a n u a l , 1 9 5 3 ) . T h e p u r i f i e d b a c t e r i a l c u l t u r e s w e r e u s e d f o r i d e n t i f i c a t i o n . T h e b a c t e r i a w e r e i d e n t i f i e d b a s e d o n c o l o n y c h a r a c t e r i s t i c s , g r a m s t a i n i n g m e t h o d s a n d b y v a r i o u s b i o c h e m i c a l s t u d i e s a s g i v e n b y B e r g e y a n d B u c h a n a n ( 1 9 7 4 ) . T r e a t m e n t o f d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t b y N o s t o c m u s c o r u m S t e r i l i z e d E r l e n m a y e r f l a s k s ( 2 5 0 m l ) w e r e u s e d f o r t h e e x p e r i m e n t s . T h e i n i t i a l p h y s i c o - c h e m i c a l a n a l y s i s o f e f f l u e n t w a s m a d e f o l l o w i n g t h e S t a n d a r d M e t h o d s ( A P H A , 1 9 7 5 ) . T h e f o l l o w i n g t r e a t m e n t s w e r e e m p l o y e d i n o r d e r t o 1 5 4 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 5 3 - 1 6 2 G a n a p a t h y S e l v a m e t a l . , 2 0 1 1

s t u d y t h e i n t e r a c t i o n o f C y a n o b a c t e r i u m w i t h t h e d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t . E f f l u e n t u n i n o c u l a t e d w a s t a k e n a s , c o n t r o l f o r p h y s i c o c h e m i c a l a n a l y s i s ( C ) . B G 1 1 m e d i u m i n o c u l a t e d w i t h N o s t o c m u s c o r u m f o r t h e e s t i m a t i o n o f g r o w t h ( C O ) . I n o c u l a t i o n w a s m a d e b y a d d i n g 3 . 0 m l u n i f o r m s u s p e n s i o n o f N o s t o c m u s c o r u m s e p a r a t e l y ( 0 . 0 3 m g m l - 1 ) . T h e e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d u n d e r c o n t r o l l e d c o n d i t i o n s ( T e m p e r a t u r e 2 5 ± 2 o C w i t h l i g h t i n t e n s i t i e s o f 2 5 0 0 l a x p r o v i d e d f o r m o v e r h e a d c o o l w i t h f l u o r e s c e n t t u b e s ) f o r o n e m o n t h . S i n c e t h e g r o w t h o f N o s t o c m u s c o r u m w a s v e r y s l o w i n t h e e f f l u e n t , a l o n g d u r a t i o n w a s p r o v i d e d t o g e t a c u l t u r e o f e x p o n e n t i a l g r o w t h . T h e c u l t u r e s w e r e h a r v e s t e d o n e v e r y 5 t h d a y b y f i l t r a t i o n t h r o u g h f i l t e r p a p e r a n d w a s h e d r e p e a t e d l y w i t h d i s t i l l e d w a t e r . T h e f i l t e r e d e f f l u e n t s ( i n o c u l a t e d a n d c o n t r o l ) w e r e u s e d f o r p h y s i c o c h e m i c a l a n a l y s i s . N o s t o c m u s c o r u m o b t a i n e d b o t h f r o m t h e m e d i u m a n d e f f l u e n t s w e r e u s e d f o r t h e e s t i m a t i o n o f g r o w t h ( e s t i m a t i o n o f c h l o r o p h y l l a ) . E s t i m a t i o n o f C h l o r o p h y l l a T h e c u l t u r e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 5 , 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n u t e s . T h e p e l l e t s w e r e w a s h e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r ; s u s p e n d e d i n 8 0 p e r c e n t m e t h a n o l a n d v o r t e x e d t h o r o u g h l y . T h e n t h e t u b e s w e r e c o v e r e d w i t h a l u m i n i u m f o i l t o p r e v e n t s o l v e n t e v a p o r a t i o n a n d i n c u b a t e d i n a w a t e r b a t h s e t a t 6 0 o C f o r 1 h r , i n d a r k w i t h o c c a s i o n a l s h a k i n g . A f t e r 1 h r t h e c o n t e n t s w e r e c o o l e d a n d c e n t r i f u g e d a t 5 , 0 0 0 x g f o r 5 m i n u t e s . T h e s u p e r n a t a n t w a s s a v e d a n d t h e a b o v e p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d t w i c e t o e n s u r e c o m p l e t e e x t r a c t i o n o f t h e p i g m e n t . T h e p o o l e d s u p e r n a t a n t w a s m a d e u p t o a k n o w n v o l u m e w i t h 8 0 p e r c e n t m e t h a n o l ( t o c o m p e n s a t e t h e s o l v e n t l o s s d u r i n g h e a t i n g ) . T h e a b s o r b e n c y w a s m e a s u r e d a t 6 6 3 n m i n S p e c t r o n i c 2 0 a g a i n s t m e t h a n o l b l a n k . P h y s i c o - c h e m i c a l A n a l y s i s o f d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t T h e p h y s i c o - c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e d i s t i l l e r y e f f l u e n t l i k e p H , C a r b o n d i o x i d e , a l k a l i n i t y ( C a r b o n a t e a n d B i c a r b o n a t e ) , D i s s o l v e d o x y g e n , B i o l o g i c a l O x y g e n D e m a n d , C h e m i c a l O x y g e n D e m a n d ( C O D ) , N i t r a t e , N i t r i t e , A m m o n i a , t o t a l p h o s p h o r u s , i n o r g a n i c p h o s p h a t e , O r g a n i c p h o s p h a t e , C a l c i u m , M a g n e s i u m a n d C h l o r i d e w e r e a n a l y z e d f o l l o w i n g t h e p r o c e d u r e o f A p h a ( 1 9 7 5 ) . B i o c h e m i c a l a n a l y s i s o f N o s t o c m u s c o r u m B i o c h e m i c a l a n a l y s i s o f N o s t o c m u s c o r u m s u c h a s C a r b o h y d r a t e ( D u b o i s e t a l . , 1 9 5 6 ) , P r o t e i n ( L o w r y e t a l . , 1 9 5 1 ) , a m i n o a c i d . ( J a y a r a m a n , 1 9 8 1 ) a n d L i p i d s ( S a t o a n d M u r a t a , 1 9 8 8 ) , w e r e a n a l y z e d f o r t h e e s t i m a t i o n o f b i o c h e m i c a l c o m p o u n d v a r i a t i o n i n e f f l u e n t t r e a t e d a n d c o n t r o l c u l t u r e . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N I s o l a t i o n o f c y a n o b a c t e r i a : I n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n s t o t a l l y 1 2 s p e c i e s ( F i g - 1 a n d T a b l e - 1 ) o f c y a n o b a c t e r i a d i s t r i b u t e d i n f i v e g e n e r a f a l l i n g u n d e r f o u r d i f f e r e n t f a m i l i e s w e r e i d e n t i f i e d f r o m t h e d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t p o l l u t e d h a b i t a t . A m o n g t h e g e n e r a , O s c i l l a t o r i a w i t h s i x s p e c i e s f o l l o w e d b y P h o r m i d i u m t w o s p e c i e s , L y n g b y a , M i c r o c y s t i s , N o s t o c a n d P l e c t o n e m a w i t h s i n g l e s p e c i e s e a c h . T h i s i s a t t r i b u t e d t o f a v o r a b l e c o n d i t i o n s o f o x i d i z a b l e o r g a n i c m a t t e r , l e s s D O a n d h i g h c a l c i u m c o n t e n t ; ( T a b l e 4 ) a n o b s e r v a t i o n w h i c h s u p p o r t s V e n k a t e s w a r a l u ( 1 9 6 9 ) w h o o b s e r v e d t h a t h i g h o r t h o p h o s p h a t e l e v e l s f a v o r e d t h e d e v e l o p m e n t o f c y a n o b a c t e r i a l b l o o m . S i m i l a r o b s e r v a t i o n s w e r e m a d e i n t h e p r e s e n t s t u d y w i t h r e f e r e n c e t o v a r i o u s n u t r i e n t s ( T a b l e - 4 ) . H e t e r o c y s t o u s c y a n o b a c t e r i a h a v e n o t b e e n r e c o r d e d i n p o l l u t e d w a t e r s r i c h i n n i t r o g e n ( B o o m i n a t h a n e t a l . , 2 0 0 7 ) . I n c o n t r a r y t o t h a t p r e s e n t s t u d y h e t e r o c y s t o u s c y a n o b a c t e r i a h a v e a l r e a d y b e e n r e c o r d e d a n d i s b e c a u s e o f t h e p r e s e n c e o f l o w e r c o n c e n t r a t i o n o f v a r i o u s f o r m s o f n i t r o g e n e f f l u e n t a s s u g g e s t e d b y V i j a y a k u m a r e t a l . , ( 2 0 0 7 ) . I s o l a t i o n o f f u n g i a n d B a c t e r i a : I n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n , a t o t a l o f t h r e e d i f f e r e n t g e n e r a o f f u n g u s w e r e i s o l a t e d a n d i d e n t i f i e d . A m o n g t h e g e n e r a A s p e r g i l l u s w i t h f o u r J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 5 3 - 1 6 2 1 5 5 G a n a p a t h y S e l v a m e t a l . , 2 0 1 1 F i g - 1 M i c r o b i a l d i v e r s i t y o f d i s t i l l e r y e f f l u e n t

s p e c i e s d o m i n a n t g i v e n i n ( F i g - 1 a n d T a b l e - 2 ) . J a g a n a t h a n ( 2 0 0 6 ) i s o l a t e d 2 1 s p e c i e s f r o m o i l r e f i n e r y e f f l u e n t p o l l u t e d h a b i t a t w i t h A s p e r g i l l u s a s t h e d o m i n a n t g e n u s . F r o m t h e d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t , s i x d i f f e r e n t s p e c i e s o f b a c t e r i a w e r e i s o l a t e d ( F i g - 1 a n d T a b l e - 3 ) . P u r s u i n g t h e l i t e r a t u r e , t h e r e h a s n o t b e e n m u c h w o r k r e g a r d i n g t h e i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f b a c t e r i a f r o m d y e a n d o t h e r r e l a t e d e f f l u e n t s a m p l e s . C o n t r a r y t o t h a t , B o o m i n a t h a n e t a l . ( 2 0 0 7 ) i s o l a t e d n i n e d i f f e r e n t s p e c i e s o f b a c t e r i a w e r e r e p o r t e d . J a i n e t a l . ( 2 0 0 1 ) i s o l a t e d t h r e e d i f f e r e n t b a c t e r i a l s t r a i n s f r o m t h e d i s t i l l e r y s l u d g e t o t r e a t t h e p r e d i g e s t e d d i s t i l l e r y w a s t e w a t e r . B i o r e m e d i a t i o n o f d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t N o w - a - d a y s t h e u s e o f a l g a e , p a r t i c u l a r l y c y a n o b a c t e r i a f o r b i o m o n i t o r i n g o f p o l l u t i o n i s b e i n g s t r e s s e d . T h e i s o l a t e d d o m i n a n t t a x a , e n c o u n t e d i n t h e p r e s e n t s t u d y , N o s t o c m u s c o r u m w a s s e l e c t e d f o r t h e t r e a t m e n t o f d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t ( F i g - 2 ) . M a n y o f t h e s t u d i e s c o n d u c t e d i n v a r i o u s l a b o r a t o r i e s h a v e s h o w n t h a t u n d e r d e f i n e d c o n d i t i o n s i n d i c a t o r s p e c i e s a c t i v i t y t a k e p a r t i n t h e d e g r a d a t i o n o f o r g a n i c m a t t e r ( G u p t a a n d R a o , 1 9 8 0 ; a n d V i j a y a k u m a r e t a l . , 2 0 0 5 ) . M a n o h a r a n a n d S u b r a m a n i a n ( 1 9 9 2 a n d 1 9 9 3 ) f o u n d a r i s e i n p H v a l u e u p t o 1 0 t h d a y i n v a r i o u s e f f l u e n t s i n o c u l a t e d w i t h f r e e B G A a n d a f t e r t h a t i t w a s d e c l i n e d . S i m i l a r l y , T a n g e t a l . ( 1 9 9 7 ) r e p o r t e d a r i s e i n p H w h i l e t e r t i a r y w a s t e w a t e r w a s t r e a t e d w i t h c y a n o b a c t e r i a . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e i n i t i a l p H o f t h e e f f l u e n t w a s 3 . 7 a n d i t r o s e t i l l 6 . 7 a f t e r t h e e f f l u e n t i n o c u l a t e d w i t h N o s t o c m u s c o r u m w a s o b s e r v e d f o r a p e r i o d o f 3 0 d a y s ( T a b l e - 4 ) . T h e r e w a s n o c a r b o n a t e i n t h e e f f l u e n t , b u t , f a i r l y h i g h l e v e l o f f r e e C o 2 a n d b i c a r b o n a t e w a s r e c o r d e d . G r a d u a l r e m o v a l o f b o t h C O 2 a n d b i c a r b o n a t e w a s o b s e r v e d f r o m 5 t h d a y o n w a r d s . O n 3 0 t h d a y C O 2 a n d b i c a r b o n a t e w a s r e s p e c t i v e l y 8 0 a n d 7 4 p e r c e n t r e m o v a l o f C O 2 a n d b i c a r b o n a t e w a s n o t i c e d . T h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n o f C O 2 a n d H C O 3 d e p e n d s o n t h e p H o f t h e m e d i u m . I t w a s f o u n d t h a t H C O 3 w i t h 6 t o 7 p H i s p r e d o m i n a n t . T h u s c y a n o b a c t e r i a m a y h a v e c o m p e t i t i v e a d v a n t a g e o v e r c h l o r o p h y t e s s i n c e t h e f o r m e r a r e c a p a b l e o f a s s i m i l a t i n g H C O 3 a s s o u r c e o f i n o r g a n i c c a r b o n f o r p h o t o s y n t h e s i s ( C o l m a n , 1 9 8 9 ) . I n g e n e r a l , t h e r e m o v a l o f t h e s e c a r b o n s o u r c e s e f f e c t i v e l y b y c y a n o b a c t e r i a , a s e x p e c t e d , w a s o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n . C h e m i c a l o x y g e n d e m a n d i s g e n e r a l l y c o n s i d e r e d a s a m a j o r i n d i c a t o r o f o r g a n i c p o l l u t i o n i n w a t e r ( D a s h a n d M i s h r a , 1 9 9 9 ) . T h e s t r e n g t h o f t h e w a s t e w a t e r i s d e t e r m i n e d b y t h e l e v e l o f B O D a n d C O D . I n o c u l a t i o n s o f c y a n o b a c t e r i a r e d u c e d t h e B O D a n d C O D l e v e l s c o n s i d e r a b l y w h e n c o m p a r e d t o c o n t r o l ( T a b l e - 4 ) . M o r e t h a n 5 3 p e r 1 5 6 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 5 3 - 1 6 2 G a n a p a t h y S e l v a m e t a l . , 2 0 1 1 F i g - 2 . G r o w t h o f N o s t o c m u s c o r u m t r e a t e d a n d c o n t r o l T a b l e 1 C y a n o b a c t e r i a f r o m d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t S l . N o . N a m e o f c y a n o b a c t e r i a s p e c i e s C H R O O C O C C A C E A E 1 . M i c r o c y s t i s a e r u g i n o s a K t z O S C I L L A T O R I A C E A E 2 . O s c i l l a t o r i a a c u t a B r u h l e t B i s w a s , O r t h . M u t . G e i t l e r 3 . O s c i l l a t o r i a e a r l e i G a r d n e r 4 . O s c i l l a t o r i a l a t e - v i r e n s ( C r o v a n ) G o m o n t 5 . O s c i l l a t o r i a p r i n c e p s V a u c h e r e x G o m o n t 6 . O s c i l l a t o r i a t e r e b r i f o r m i s A g e x G o m o n t 7 . O s c i l l a t o r i a w i l l e i G a r d n e r e m . D r o u e t 8 . P h o r m i d i u m f r a g i l e ( M e n e g h i n i ) G o m o n t 9 . P h o r m i d i u m t e n u e ( M e n e g h ) G o m o n t 1 0 . L y n g b y a m a j u s c u l a H a r v e y e x G o m o n t N O S T O C A C E A E 1 1 . N o s t o c m u s c o r u m A g e x B o r n . e t F l a h . S C Y T O N E M A T A C E A E 1 2 . P l e c t o n e m a n o t a t u m S c h m i d l e T a b l e 2 C y a n o b a c t e r i a f r o m d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t S l . N o . N a m e o f f u n g a l o r g a n i s m s 1 . A s p e r g i l l u s f l a v u s L i n k 2 . A s p e r g i l l u s l u c h u e n s i s I n u i 3 . A s p e r g i l l u s n i g e r V a n t i e g h e m 4 . A s p e r g i l l u s t e r r e u s T h o m 5 . F u s a r i u m o x y s p o r u m S c h l e c t e n n d h a l 6 . P e n i c i l l i u m j a n t h i n e l l u m B i o u r g e

c e n t r e d u c t i o n o f B O D a n d 6 8 p e r c e n t r e d u c t i o n o f C O D w e r e o b s e r v e d w i t h b o t h c y a n o b a c t e r i a . U s e o f a c c l i m a t i z e d a l g a l c u l t u r e s i n c o n s i d e r a b l y r e d u c i n g B O D a n d C O D w i t h d i f f e r e n t e f f l u e n t s h a s b e e n r e p o r t e d ( S h a r m a e t a l . , 2 0 0 3 a n d V i j a y a k u m a r e t a l . , 2 0 0 5 ) . D e t e r m i n a t i o n o f t h e a m o u n t s o f O 2 d i s s o l v e d i n w a t e r a t s t u d y s i t e s i s u n d o u b t e d l y o f t r e a t m e n t i m p o r t a n c e s i n c e i t i s c o n s i d e r e d a s o n e o f t h e b e s t p a r a m e t e r s i n e v a l u a t i n g p o l l u t i o n s t r e s s o f a q u a t i c h a b i t a t s , u n l e s s i t c o n t a i n s t o x i c s u b s t a n c e s ( L e s t e r , 1 9 7 5 ) . A s r e v e a l e d f r o m t h e r e s u l t s o b t a i n e d i n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n , t h e i n i t i a l D O c o n t e n t o f d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t w a s v e r y l o w ( 1 . 2 m g 1 - 1 ) . F r o m 5 t h 1 0 t h d a y o n w a r d s a g r a d u a l i n c r e a s e i n D O w a s n o t i c e d a n d i t w a s 1 . 2 a n d 2 . 1 e f f l u e n t w i t h N o s t o c m u s c o r u m r e s p e c t i v e l y ( T a b l e - 4 ) . I n c r e a s e i n D O l e v e l w h e n t r e a t e d w i t h J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 5 3 - 1 6 2 1 5 7 G a n a p a t h y S e l v a m e t a l . , 2 0 1 1 S l . N o . N a m e o f t h e t e s t E . c o l i E . a e r o g e n e s L a c t o b a c i l l u s s p . P . a e r u g i n o s a P . v u l g a r i s S . s o n n e i 1 . G r a m s t a i n i n g G r a m v e R o d s G r a m v e R o d s G r a m v e R o d s G r a m v e R o d s G r a m v e R o r d s G r a m v e R o d s 2 . M o t i l i t y + + - + + - 3 . S p o r e s t a i n i n g - - - - - - 4 . I n d o l e + - + - + - 5 . M e t h y l r e d + - + - + + 6 . V o g e s P r o s k a u e r - + - - - - 7 . C i t r a t e u t i l i z a t i o n - + + + + - 8 . T r i p l e s u g a r i r o n + + + - + - 9 . G a s p r o d u c t i o n + + + - + - 1 0 . H 2 S p r o d u c t i o n - - - - + - 1 1 . C a t a l a s e + + - + + + 1 2 . O x i d a s e - - + + - - 1 3 . U r e a s e - - - - + - 1 4 . L y s i n e + + - - - - 1 5 . P h e n y l a l a n i n e - - + - + - 1 6 . N i t r a t e r e d u c t i o n + + - + + - 1 7 . C a r b o h y d r a t e u t i l i z a t i o n t e s t 1 8 . G l u c o s e + + + + + + 1 9 . M a l t o s e + + + - + + 2 0 . L a c t o s e + + + - - - 2 1 . M a n n o s e + + - - - + 2 2 . S u c r o s e + + + - - T a b l e 3 . B i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f i s o l a t e d b a c t e r i a f r o m d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t F i g - 3 . T o t a l c a r b o h y d r a t e , p r o t e i n , a m i n o a c i d a n d l i p i d c o n t e n t i n N o s t o c m u s c o r u m

d i f f e r e n t c y a n o b a c t e r i a w i t h d i f f e r e n t e f f l u e n t s h a s a l r e a d y b e e n r e p o r t e d b y V i j a y a k u m a r e t a l . 2 0 0 5 a n d B o o m i n a t h a n e t a l . , 2 0 0 7 . T h i s r a i s e i n D O l e v e l i n e f f l u e n t s w i t h c y a n o b a c t e r i a m i g h t b e d u e t o o x y g e n i c p h o t o s y n t h e t i c n a t u r e o f c y a n o b a c t e r i a . T h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n i n c r e a s e i n D O a n d r e m o v a l o f B O D a n d C O D o b s e r v e d i n t h i s s t u d y a g r e e w i t h o b s e r v a t i o n s o f K a n k a l e t a l . , ( 1 9 8 7 ) ; a n d V i j a y a k u m a r e t a l . , ( 2 0 0 5 ) . S u s p e n d e d c u l t i v a t i o n o f m i c r o a l g a e i s o n e o f t h e b i o l o g i c a l p r o c e s s e s w h i c h h a v e b e e n e m p l o y e d t o e l i m i n a t e r e s i d u a l i n o r g a n i c n u t r i e n t s a s a t e r t i a r y t r e a t m e n t s t e p f r o m s e c o n d a r y t r e a t e d e f f l u e n t s ( P r a k a s h a m a n d R a m a k r i s h n a n , 1 9 9 8 ) . I n o r g o r n i c c o m p o u n d s s u c h a s n i t r i t e , n i t r a t e , a m m o n i a a n d p h o s p h a t e a r e t h e e s s e n t i a l r e q u i r e m e n t s f o r t h e g r o w t h o f c y a n o b a c t e r i a . T h e y h a v e h i g h n u t r i e n t c a p a b i l i t i e s a s t h e y c a n a c c u m u l a t e i n o r g a n i c p h o s p h a t e a n d c y n o p h y c i n r e s p e c t i v e l y ( F a y , 1 9 8 3 ) . I n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n , i n d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t , a l l f o r m o f n i t r o g e n w e r e o b s e r v e d i n a p p r e c i a b l e q u a n t i t i e s ( T a b l e - 4 ) a n d c y a n a b a c t e r i a r e m o v e d m o r e t h a n 5 5 p e r c e n t o f i n o r g a n i c n i t r o g e n f r o m t h e e f f l u e n t . H o w e v e r , N o s t o c m u s c o r u m w a s m a r g i n a l l y b e t t e r i n r e m o v i n g a l l f o r m o f n i t r o g e n . S u s p e n d e d , c u l t i v a t i o n o f m i c r o a l g a e i s o n e o f t h e b i o l o g i c a l p r o c e s s h a s b e e n e m p l o y e d t o e l i m i n a t e r e s i d u a l i n o r g a n i c n u t r i e n t s a s a t e r t i a r y t r e a t m e n t s t e p f r o m s e c o n d a r y t r e a t e d e f f l u e n t s ( O s w a l d , 1 9 7 8 ) . S t u d i e s w i t h S p i r u l i n a ( B o o m i n a t h a n e t a l . , 2 0 0 7 ) , A n a b a e n a ( M a l l i c k a n d R a i , 1 9 9 4 ) , O s c i l l a t o r i a ( M a n o h a r a n a n d S u b r a m a n i a n , 1 9 9 2 a n d 1 9 9 3 ) c o n c l u d e d t h a t c y a n o b a c t e r i a c a n e f f i c i e n t l y e l i m i n a t e i n o r g a n i c n i t r o g e n c o m p o u n d s f r o m w a s t e w a t e r s . I n g e n e r a l , t h e r e m o v a l o f i n o r g a n i c n i t r o g e n c o m p o u n d s b y c y a n b a c t e r i a i s g o v e r n e d b y g r o w t h c o n d i t i o n s a n d p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s o f t h e s t a t e o f t h e o r g a n i s m l i k e p H , l i g h t , t e m p e r a t u r e , i n o c u l u m s i z e a n d s u b t r a c t e d c o n c e n t r a t i o n . T h e c a p a c i t y o f c y a n o b a c t e r i a t o r e m o v e l a r g e a m o u n t o f p h o s p h o r u s f r o m i n d u s t r i a l w a s t e w a t e r h a s b e e n d e m o n s t r a t e d b y s e v e r a l w o r k e r s ( M o n o h a r a n a n d S u b r a m a n i a n ( 1 9 9 2 a n d 1 9 9 3 ) , B o o m i n a t h a n e t a l . ( 2 0 0 7 ) a n d V i j a y a k u m a r ( 2 0 0 5 ) f o u n d a t o t a l o r n e a r t o t a l r e m o v a l o f a l l f o r m s o f p h o s p h a t e b y O s c i l l a t o r i a a n d A p h a n o c a p s a f r o m d i f f e r e n t e f f l u e n t s . T a n g e t a l . , ( 1 9 9 7 ) a l s o r e p o r t e d 1 5 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 5 3 - 1 6 2 G a n a p a t h y S e l v a m e t a l . , 2 0 1 1 T a b l e 4 . C h a r a c t e r i s t i c s o f t r e a t e d a n d n o n t r e a t e d d i s t i l l e r i e s e f f l u e n t S l . N o . P a r a m e t e r s N o n T r e a t e d e f f l u e n t ( m g / m l ) A f t e r 3 0 d a y T r e a t e d e f f l u e n t ( % ) 1 . C o l o u r D a r k B r o w n - 2 . p H 6 . 7 6 . 7 3 . T e m p e r a t u r e 2 9 ° C 2 9 ° C 4 . F r e e C O 2 1 0 0 8 0 5 . C a r b o n a t e N i l N i l 6 . B i c a r b o n a t e 1 5 8 7 4 . 6 8 7 . B O D 3 2 7 5 3 . 5 1 8 . C O D 2 3 2 6 8 . 5 3 9 . N i t r a t e 5 8 3 5 2 . 8 3 1 0 . N i t r i t e 1 1 5 6 6 . 0 8 1 1 . A m m o n i a 4 2 3 5 8 . 8 6 1 2 . T o t a l p h o s p h o r u s 5 9 5 5 . 9 3 1 3 . I n o r g a n i c p h o s p h o r u s 3 6 3 6 . 1 1 1 4 . O r g a n i c p h o s p h o r u s 2 3 8 6 . 9 3 1 5 . C a l c i u m 8 4 . 1 0 7 3 . 7 8 1 6 . M a g n e s i u m 6 2 . 4 2 6 9 . 9 1 1 7 . C h l o r i d e 1 7 9 . 9 4 8 . 3 6 E x c e p t p H a n d t e m p e r a t u r e a l l o t h e r p a r a m e t e r s a r e i n m g / l .

a h i g h e r p h o s p h a t e u p t a k e , d e s p i t e l o w b i o m a s s o f c y a n o b a c t e r i a . D a s h a n d M i s h r a ( 1 9 9 9 ) o b s e r v e d 1 0 0 p e r c e n t r e m o v a l o f p h o s p h a t e f r o m p a p e r m i l l e f f l u e n t w h i l e t e s t i n g w i t h W e s t i e l l o p s i s p r o l i f i c a . H o w e v e r i n t h e p r e s e n t s t u d y m o r e t h a n 5 5 p e r c e n t r e m o v a l o f t o t a l p h o s p h o r o u s a n d 3 6 p e r c e n t r e m o v a l i n o r g a n i c p h o s p h a t e w e r e o b s e r v e d i n e f f l u e n t w i t h N o s t o c m u s c o r u m . T h e m a j o r p h o s p h a t e r e s e r v e o f c y a n o b a c t e r i a i s p o l y p h o s p h a t e , w h i c h a c c u m u l a t e s a s d i s c r e t e g r a n u l e s i n t h e c y t o p l a s m o f t h e c e l l w a l l w h e n p h o s p h a t e i s i n e x c e s s ( F a y , 1 9 8 3 ) . T h e i n t r a c e l l u l a r a c c u m u l a t i o n o f p h o s p h a t e i s e n e r g y d e p e n d e n t , b e i n g h i g h e r i n t h e l i g h t t h a n i n t h e d a r k a n d d e p e n d s s t r i c t l y o n t h e p H o f t h e c y t o p l a s m . A l l t h e a b o v e f i n d i n g s c o n f i r m t h a t c y a n o b a c t e r i a c a n a b s o r b p h o s p h a t e i n e x c e s s a m o u n t a s i t i s r e q u i r e d a n d t h i s c o u l d b e t h e r e a s o n f o r m a x i m u m r e m o v a l o f a l l f o r m s o f p h o s p h a t e f r o m t h e e f f l u e n t . T h e t o t a l h a r d n e s s i s c o n s t i t u t e d b y c a l c i u m a n d m a g n e s i u m . I n t h e p r e s e n t s t u d y m o r e t h a n 6 8 p e r c e n t r e m o v a l o f c a l c i u m a n d m a g n e s i u m w e r e o b s e r v e d i n e f f l u e n t w i t h N o s t o c . U m a a n d S u b r a m a n i a m ( 1 9 9 0 ) s t u d i e d t h e e f f e c t i v e u s e o f c y a n o b a c t e r i a i n o s s e i n e f f l u e n t w h i c h h a s h i g h l e v e l s o f c a l c i u m . T h e y f o u n d m o r e t h a n 5 0 p e r c e n t r e d u c t i o n o f c a l c i u m w i t h i n 4 d a y s w h e n t h e e f f l u e n t w a s t r e a t e d s e p a r a t e l y w i t h O s c i l l a t o r i a a n d A p h a n o c a p s a . S i m i l a r l y , M a n o h a r a n a n d S u b r a m a n i a n ( 1 9 9 2 a n d 1 9 9 3 ) r e p o r t e d t h e r e d u c t i o n o f c a l c i u m a n d m a g n e s i u m i n d o m e s t i c s e w a g e , o s s e i n a n d p a p e r m i l l e f f l u e n t s b y O . p s e u d o g e m i n a t a v a r . u n i g r a n u l a t a . T h e y o b s e r v e d m o r e t h a n 7 0 p e r c e n t r e d u c t i o n o f c a l c i u m a n d m a g n e s i u m w i t h r e t e n t i o n t i m e o f 1 5 d a y s . D a s h a n d M i s h r a ( 1 9 9 9 ) o b s e r v e d 5 0 p e r c e n t r e d u c t i o n o f c a l c i u m i n p a p e r m i l l e f f l u e n t b y W e s t i e l l o p s i s ( r e t e n t i o n t i m e o f 1 5 d a y s ) . O n t h e o t h e r h a n d V i j a y a k u m a r e t a l . ( 2 0 0 5 ) r e p o r t e d m o r e t h a n 9 0 p e r c e n t r e m o v a l o f c a l c i u m a n d m a g n e s i u m f r o m d y e e f f l u e n t w h e n t r e a t e d w i t h O s c i l l a t o r i a s p . A l t h o u g h , c a l c i u m i s u n d o u b t e d l y r e q u i r e d f o r c y a n o b a c t e r i a l g r o w t h s u b s t a n t i a l r e d u c t i o n i n c a l c i u m a n d m a g n e s i u m a r e k n o w n t o b e e s s e n t i a l f o r f l o c c u l a t i o n a n d w o u l d c o f l o c c u l a t e ( R i c h m o n d a n d B e c k e r , 1 9 8 6 ) . ) o b s e r v e d t h e e x c r e t i o n o f o r g a n i c a c i d s b y m i c r o b e s a n d e s p e c i a l l y c y a n o b a c t e r i a a n d t h e i r c a p a c i t y t o s o l u b i l i z e m a g n e s i u m i n t h e w a s t e w a t e r , w h i c h c o u l d e x p l a i n o b s e r v e d r e d u c t i o n . C h l o r i d e s a r e g e n e r a l l y c o n s i d e r e d a s o n e o f t h e m a j o r p o l l u t a n t s i n t h e e f f l u e n t w h i c h a r e d i f f i c u l t t o b e r e m o v e d b y c o n v e n t i o n a l b i o l o g i c a l t r e a t m e n t m e t h o d s . H o w e v e r , i n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n N o s t o c w a s e f f i c i e n t b y r e m o v i n g c h l o r i d e f r o m t h e s a m p l e ( T a b l e - 4 ) . U m a a n d S u b r a m a n i a n ( 1 9 9 0 ) o b s e r v e d n e a r l y 5 0 a n d 2 5 p e r c e n t r e m o v a l w h e n o s s e i n e f f l u e n t w h i c h h a s v e r y h i g h l e v e l o f c h l o r i d e w a s t r e a t e d w i t h O s c i l l a t o r i a a n d A p h a n o c a p s a r e s p e c t i v e l y . M a n o h a r a n a n d S u b r a m a n i a m ( 1 9 9 2 a n d 1 9 9 3 ) a l s o o b s e r v e d m o r e t h a n 4 0 p e r c e n t r e m o v a l o f c h l o r i d e f r o m v a r i o u s e f f l u e n t s b y O s c i l l a t o r i a s p . A s i m i l a r o b s e r v a t i o n a t t r i b u t i n g 5 0 p e r c e n t c h l o r i d e r e d u c t i o n u n d e r l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s b y O . b r e v i s w a s a l s o r e p o r t e d i n d y e e f f l u e n t ( V i j a y a k u m a r e t a l . , 2 0 0 5 ) , o i l r e f i n e r y e f f l u e n t ( B o o m i n a t h a n e t a l . , 2 0 0 7 ) a n d s u g a r m i l l e f f l u e n t ( G o p a l a k r i s h n a n , 2 0 0 7 ) . B i o c h e m i c a l s t u d i e s o n N o s t o c m u s c o r u m G r o w t h w a s m e a s u r e d i n t e r m s o f c h l o r o p h y l l a a s a b i o m a s s c o m p o n e n t . T h i s w a s e s t i m a t e d b o t h i n B G 1 1 m e d i u m ( c o n t r o l ) a n d e f f l u e n t . M a x i m u m g r o w t h o f N o s t o c w a s r e c o r d e d i n t h e c o n t r o l t h a n i n e f f l u e n t i n o c u l a t e d ( F i g . 2 ) . I n r e c e n t y e a r s , s c i e n t i s t s h a v e b e e n i n c r e a s i n g l y c o n c e n t r a t e d m o r e o n t h e i n f l u e n c e o f t h e s e s y s t e m s o n t h e r e m o v a l o f n u t r i e n t s f r o m t h e e f f l u e n t b u t o n l y a f e w h a v e i n v e s t i g a t e d t h e e f f e c t o f e f f l u e n t s o n t h e b i o c h e m i s t r y o f t h e c y a n o b a c t e r i a l s y s t e m s . T o d e v e l o p s u i t a b l e a n d e f f i c i e n t t r e a t m e n t s y s t e m , i t i s o b l i g a t o r y t o u n d e r s t a n d t h e m u t u a l i n f l u e n c e a n d i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e e f f l u e n t s a n d t h e o r g a n i s m s , s o t h a t m a n i p u l a t i o n t o i m p r o v e t h e t r e a t m e n t s y s t e m b e c o m e s f e a s i b l e a n d h e n c e t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n o n t h e b i o c h e m i s t r y o f e f f l u e n t g r o w n c y a n o b a c t e r i a w a s c a r r i e d o u t . D i s t i l l e r i e s e f f l u e n t h a s d e c r e a s e d t h e t o t a l c a r b o h y d r a t e c o n t e n t o f N o s t o c m u s c o r u m t o a c o n s i d e r a b l e l e v e l ( F i g . 3 ) w h e n c o m p a r e d t o B G 1 1 m e d i u m ( c o n t r o l ) . T h e r e d u c t i o n w a s a r o u n d 1 6 p e r c e n t . C o n t r a r y t o t h e p r e s e n t o b s e r v a t i o n , i n c r e a s e i n t h e c a r b o h y d r a t e l e v e l o f c y a n o b a c t e r i a w i t h v a r i o u s e f f l u e n t s h a s b e e n r e p o r t e d b y m a n y w o r k e r s ( R e d d y e t a l . , 1 9 8 3 a n d V i j a y a k u m a r , 2 0 0 5 , 2 0 0 7 ) . N i t r o g e n l i m i t a t i o n c a u s e d p h o t o a s s i m i l a t e d c a r b o n t o b e d i r e c t e d t o w a r d s t h e s y n t h e s i s o f c a r b o h y d r a t e i n s t e a d o f p r o t e i n s a n d c h l o r o p h y l l . T h i s r e s p o n s e i s w i d e l y o b s e r v e d i n m a n y a l g a l s p e c i e s ( T u r p i n , 1 9 9 1 ) . P r o t e i n a n d c h l o r o p h y l l d e c r e a s e s a n d c a r b o h y d r a t e i n c r e a s e s b y C O 2 e n r i c h m e n t h a v e b e e n o b s e r v e d p r e v i o u s l y i n a n u m b e r o f s p e c i e s ( L o e h l e , 1 9 9 5 ) . B u t i n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n , c o n s i d e r a b l e l e v e l s o f a l l f o r m s o f i n o r g a n i c n i t r o g e n w e r e o b s e r v e d ; m o r e o v e r t h e c a r b o h y d r a t e c o n t e n t w a s a l s o r e d u c e d b y t h e e f f l u e n t . T h e r e w e r e n o C O 2 r e c o r d e d i n t h e J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 5 3 - 1 6 2 1 5 9 G a n a p a t h y S e l v a m e t a l . , 2 0 1 1

e f f l u e n t t h r o u g h o u t t h e s t u d y p e r i o d a n d h e n c e t h i s c o u l d n o t e x p l a i n t h e o b s e r v e d v a r i a t i o n i n c a r b o h y d r a t e c o n t e n t . S i m i l a r l y c a r b o h y d r a t e , m o r e t h a n 1 9 p e r c e n t r e d u c t i o n o f p r o t e i n a n d 2 1 p e r c e n t r e d u c t i o n o f a m i n o a c i d w e r e a l s o r e c o r d e d i n c y a n o b a c t e r i a g r o w n i n e f f l u e n t ( F i g . 3 ) . S i m i l a r o b s e r v a t i o n s w i t h d e c r e a s e p r o t e i n l e v e l i n c y a n o b a c t e r i a w i t h d i f f e r e n t e f f l u e n t s f r o m p a p e r m i l l h a v e a l r e a d y b e e n e s t a b l i s h e d . ( V i j a y a k u m a r e t a l , 2 0 0 5 , 2 0 0 7 ) . R e d d y e t a l . ( 1 9 8 3 ) a l s o o b s e r v e d t h a t i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n o f o i l r e f i n e r y e f f l u e n t s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d t h e b i o c h e m i c a l c o n s t i t u e n t s i n c l u d i n g p r o t e i n s a n d a m i n o a c i d . S i m i l a r l y , o b s e r v e d a n i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n o f t a n n e r y e f f l u e n t ( l e s s d i l u t e d ) d e c r e a s e d t h e b i o c h e m i c a l c o n t e n t s s u c h a s p r o t e i n s a n d c a r b o h y d r a t e i n b l u e g r e e n a l g a e a s c o m p a r e d t o c o n t r o l . I n t h e p r e s e n t s t u d y , 1 0 0 p e r c e n t e f f l u e n t ( w i t h o u t d i l u t i o n ) w a s u s e d t o g r o w c y a n o b a c t e r i u m . T h i s c o u l d b e t h e r e a s o n f o r t h e r e d u c e d b i o c h e m i c a l c o m p o n e n t s o f t e s t o r g a n i s m . T h e s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n o f t h e a b o v e b i o c h e m i c a l m e t a b o l i t e s s u g g e s t e d t h a t t h e e f f l u e n t a f f e c t s a l g a l m e t a b o l i s m a t m u l t i p l e s i t e s ( R e d d y e t a l . , 1 9 8 3 ) . F r o m t h e d i s t i l l e r i e s , t h e t o t a l l i p i d s e x c e p t o t h e r c o n s t i t u e n t s i n c y a n o b a c t e r i a s h o w e d a n i n c r e a s e w i t h t h e e f f l u e n t . I n c r e a s e w a s m o r e t h a n 2 0 p e r c e n t o v e r c o n t r o l ( F i g . 3 ) . C o n t r a r y t o t h i s , M a n o h a r a n a n d S u b r a m a n i a n ( 1 9 9 2 a n d 1 9 9 6 ) , r e p o r t e d a d e c r e a s e i n t h e l e v e l o f l i p i d c o n t e n t o f c y a n o b a c t e r i a w i t h d i f f e r e n t e f f l u e n t s . A l t e r a t i o n i n t h e l i p i d c o n t e n t o f a n o r g a n i s m i s m o r e i m p o r t a n t i n r e s p o n s e t o e n v i r o n m e n t a l s t r e s s ( V i j a y a k u m a r e t a l , 2 0 0 7 ) . V a r i a t i o n i n l i p i d c o n t e n t s a n d c o m p o s i t i o n u n d e r d i f f e r e n t e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s i n c l u d i n g l i g h t a n d d a r k h a s b e e n o b s e r v e d i n a n u m b e r o f c y a n o b a c t e r i a ( A l - H a s a n e t a l . , 1 9 8 9 ) . A s a l r e a d y p o i n t e d o u t t h a t t h e c h a n g e s i n b i o c h e m i c a l c o n t e n t s o f c y a n o b a c t e r i a m i g h t b e d u e t o t h e e f f l u e n t w h i c h a f f e c t s t h e a l g a l m e t a b o l i s m a t m u l t i p l e s i t e s ( R e d d y e t a l . , 1 9 8 3 ) . R E F E R E N C E S A l - H a s a n R H , A l i A M a n d R a d w a n S S . 1 9 8 9 . E f f e c t o f l i g h t a n d d a r k i n c u b a t i o n o n t h e l i p i d a n d f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n o f m a r i n e c y a n o b a c t e r i u m . J . G e n . M i c r o b i o l . , 1 3 5 : 8 6 5 - 8 7 2 . A P H A , A W W A a n d W P C F . 1 9 7 5 . S t a n d a r d m e t h o d s f o r t h e e x a m i n a t i o n o f w a t e r a n d w a s t e w a t e r . 1 4 t h e d . N e w Y o r k . B a k a r e A A , L a t e e f A , A m u d a O S a n d A f o l a b i R O . 2 0 0 3 . T h e a q u a t i c t o x i c i t y i n c h a r a c t e r i z a t i o n o f c h e m i c a l a n d m i c r o b i o l o g i c a l c o n s t i t u e n t s o f w a t e r s a m p l e s f r o m O b a r i v e r , O d o - O b a , N i g e r i a . A s i a n J . M i c r o b i a . B i o t e c h . E n v . S c i . , 5 ( 1 ) : 1 1 - 1 7 . B e r g e y D H a n d B u c h a n a n R E . B e r g e y ' s m a n u a l o f d e t e r m i n a t i v e b a c t e r i o l o g y . A m e r i c a n s o c i e t y f o r m i c r o b i o l o g y 1 9 7 4 . P u b . B a l t i m o r e , W i l l i a m s & W i l k i n s C o . 8 t h e d i t i o n B o o m i n a t h a n M , S u n d a r a r a m a n M a n d M a n o h a r a n C . 2 0 0 7 . B i o d i v e r s i t y o f m i c r o b e s i n d a i r y e f f l u e n t . P o l l . R e s . , 2 6 ( 2 ) : 2 7 1 - 2 7 6 . C o l m a n B . 1 9 8 9 . P h o t o s y n t h e t i c c a r b o n a s s i m i l a t i o n a n d t h e s u p p r e s s i o n o f p h o t o r e s p i r a t i o n i n t h e c y a n o b a c t e r i a . A q u a t . B o t . , 3 4 : 2 1 1 - 2 3 1 . D a s h A K a n d M i s h r a P C . 1 9 9 9 . R o l e o f t h e b l u e - g r e e n a l g a W e s t i e l l o p s i s p r o l i f i c a i n r e d u c i n g p o l l u t i o n l o a d f r o m p a p e r m i l l w a s t e w a t e r . I n d i a n J . E n v i r o n . P r o t e c t . , 1 9 : 1 - 5 . D e s i k a c h a r y T V . 1 9 5 9 . C y a n o p h y t a , I . C . A . R . N e w D e l h i . D i f c o M a n u a l , 1 9 5 3 . D i f x o L a b o r a t o r i e s I n c . , D e t r i o i t , M i c h 9 t h e d i t i o n . D u b o i s M , G i l l e s K A , H a m i l t o n J K a n d S i m i t l e F . 1 9 5 6 . C o l o r i m e t r i c m e t h o d f o r d e t e r m i n a t i n g s u g a r a n d r e l a t e d s u b s t a n c e s . A n a l . C h e m . 2 8 ( 3 ) : 3 5 0 - 3 5 6 . E l l i s M B . 1 9 7 1 . D e m a t i a c e o u s H y p o m y c e t e s , C o m m o n w e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e P u b . K e w S u r r e y , E n g l a n d . E l l i s M B . 1 9 7 6 . M o r e D e m a t i a c e o u s H y p o m y c e t e s , C o m m o n w e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e P u b . K e w S u r r e y , E n g l a n d . F a y P . 1 9 8 3 . T h e B l u e - G r e e n s , A r n o l d P u b l i s h e r s L t d . , L o n d o n . V o l . 1 4 . G e i t l e r L . 1 9 3 2 . C y a n o p h y c e a e , I n R a b e n h o r t s K r y p t o g a m e n f l o r a , A k a d e m i s c h e V e r l a g s g e l l - S c h a f t L e p z i g . 1 1 9 6 . G i l l m a n J C . 1 9 5 7 . A M a n u a l o f S o i l F u n g i , R e v i s e d 2 n d e d n , O x f o r d a n d I . B . H . P u b l i s h i n g C o m p a n y ( I n d i a n r e p r i n t ) , C a l c u t t a , B o m b a y , N e w D e l h i . 2 5 0 . 1 6 0 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 5 3 - 1 6 2 G a n a p a t h y S e l v a m e t a l . , 2 0 1 1

G o p a l a k r i s h n a n T . 2 0 0 7 . R o l e o f c y a n o b a c t e r i a i n s u g a r m i l l e f f l u e n t , M . P h i l . D i s s e r t a t i o n , B h a r a t h i d a s a n U n i v e r s i t y , T i r u c h i r a p a l l i , I n d i a . G u p t a S K a n d R a o A V S . 1 9 8 0 ; T r e a t m e n t o f u r e a b y a l g a e , a c t i v a t e d s l u d g e a n d f l o c c u l a t i n g a l g a l b a c t e r i a l s y s t e m . A c o m p a r a t i v e S t u d y . I n d i a n J . E n v i o n . H l t h . , 2 2 : 1 0 3 - 1 1 2 . J a i n N , N a n j u n d a s w a m y C , M i n o c h a A K a n d V e r m a C L . 2 0 0 1 . I s o l a t i o n , s c r e e n i n g a n d i d e n t i f i c a t i o n o f b a c t e r i a l s t r a i n s f o r d e g r a d a t i o n o f p r e d i g e s t e d d i s t i l l e r y w a s t e w a t e r . I n d i a n J . E x p . B i o l . , 3 9 : 4 9 0 - 4 9 2 . J a g a n a t h a n K . 2 0 0 6 . B i o r e m e d i a t i o n s t u d i e s o n o i l r e f i n e r y i n d u s t r y e f f l u e n t u s i n g O s c i l l a t o r i a e a r l i G a r t n e r . M . P h i l . D i s s e r t a t i o n , B h a r a t h i d a s a n U n i v e r s i t y , T i r u c h i r a p a l l i , I n d i a . J a y a r a m a n J . 1 9 8 1 . C o l o r i m e t r i c e s t i m a t i o n o f a m i n o a c i d s , I n L a b o r a t o r y M a n u a l i n B i o c h e m i s t r y , W i l e y E a s t e r n L t d . , N e w D e l h i . 6 4 . K a n k a l N C , N e m a P , G o k h e B H a n d M e h a t a C G . 1 9 8 7 . D i s s o l v e d o x y g e n a n d d e t e n t i o n t i m e a s p r o c e s s p a r a m e t e r s i n s e w a g e t r e a t m e n t b y a e r a t e d l a g o o n , I A C P W T e c h . A n n u a l 1 4 : 6 1 - 6 6 . L a n g H E , H a D , X i e Q a n d C h e X . 1 9 9 9 . A n a p p r o a c h t o s t u d y i n g h e a v y m e t a l p o l l u t i o n c a u s e d b y m o d e r n c i t y d e v e l o p m e n t i n N a n j i n g , C h i n a . E n v i r o n . G e o l o g y 3 8 : 2 2 3 - 2 2 8 . L e s t e r W F . 1 9 7 5 . P o l l u t e d r i v e r : R i v e r t e r n t E n g l a n d . I n R i v e r E c o l o g y [ W h i t t o n , B . A . ( e d . ) ] , O x f o r d . 7 2 5 . L o e h l e C . 1 9 9 5 . A n a m a l o u s r e s p o n s e o f p l a n t s t o C O 2 e n r i c h m e n t . O i k o s . 7 3 : 1 8 1 - 1 8 7 . L o w r y O H , R o s e b r o u g h N J , F a r r A L a n d R a n d a l i R J . 1 9 5 1 . P r o t e i n m e a s u r e m e n t w i t h t h e f o l i n - p h e n o l r e a g e n t . J . B i o l . C h e m . 1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 . M a n o h a r a n C a n d S u b r a m a n i a n G . 1 9 9 2 . S e w a g e - c y a n o b a c t e r i a l i n t e r a c t i o n A c a s e s t u d y , I J E P . 1 2 ( 4 ) : 2 5 4 - 2 5 8 . M a n o h a r a n C a n d S u b r a m a n i a n . 1 9 9 3 . F e a s i b i l i t y s t u d i e s o n u s i n g c y a n o b a c t e r i a i n O s s e i n e f f l u e n t t r e a t m e n t . I n d i a n J . E n v i r o n . H l t h . 3 5 ( 2 ) : 8 8 - 9 6 . M a n o h a r a n C a n d S u b r a m a n i a n G . 1 9 9 6 . E f f e c t o f O s s e i n e f f l u e n t o n t h e b i o c h e m i s t r y o f O s c i l l a t o r i a p s e u d o g e m i n a v a r . u n i g r a n u l a t a B i s w a s , J . E n v i r o n . B i o l . 1 7 ( 2 ) : 1 5 7 - 1 6 1 . M a l l i c k N a n d R a i L C . 1 9 9 4 . R e m o v a l o f i n o r g a n i c i o n s f r o m w a s t e w a t e r s b y i m m o b i l i z e d m i c r o a l g a e . W o r l d J . M i c r o b i o l . B i o t e c h . , 1 0 ( 4 ) : 4 3 9 - 4 4 3 . O s w a l d W J , L e e E W , A d a n B a n d Y a o K H . 1 9 7 8 . N e w w a s t e w a t e r t r e a t m e n t m e t h o d y i e l d s a h a r v e s t o f s a l e a b l e a l g a e , W . H . O . C h r o n i c l e 3 2 : 3 4 8 - 3 5 0 . P r a k a s h a m R S a n d R a m a k r i s h n a S V . 1 9 9 8 . T h e r o l e o f c y a n o b a c t e r i a i n e f f l u e n t t r e a t m e n t . J . S c i . I n d u s t . R e s . , 2 5 8 - 2 6 5 . R e d d y T R K , R a o J C S a n d R a d h a k r i s h n a n T M . 1 9 8 3 . T o x i c i t y o f o i l r e f i n e r y e f f l u e n t o n p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s o f a l g a e . P h y k o s . , 2 2 : 8 6 - 9 3 . R i c h m o n d A a n d B e c k e r E W . 1 9 8 6 . T e c h n o l o g i c a l a s p e c t s o f m a s s c u l t i v a t i o n - A g e n e r a l o u t l i n e . I n C R C H a n d B o o k o f M i c r o a l g a l M a s s C u l t u r e [ R i c h m o n d ( e d . ) ] . 2 4 5 - 2 6 3 . R i p p k a R , D e r u e l l e s J , W a t e r b u r y J B , H e r d m a n M a n d S t a n i e r R Y . 1 9 7 9 . G e n e r i c a s s i g n m e n t s , s t r a i n h i s t o r i e s a n d p r o p e r t i e s , p u r e c u l t u r e s o f c y a n o b a c t e r i a , J . G e n . M i c r o b i o l . , 1 1 1 : 1 - 6 1 . S a t o N a n d M u r a t a N . 1 9 8 8 . M e m b r a n e l i p i d s . I n M e t h o d s i n E n z y m o l o g y [ P a c k e r , L . a n d G l a z e r , A . N . ( e d s . ) ] , A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . 1 6 7 : 2 5 1 - 2 5 9 . S a t y a w a l i Y a n d B a l a k r i s h n a n M . 2 0 0 8 ; W a s t e w a t e r t r e a t m e n t i n m o l a s s e s - b a s e d a l c o h o l d i s t i l l e r i e s f o r C O D a n d c o l o u r r e m o v a l : A R e v i e w , J . E n v i r o n . M a n a g e . , 8 6 ( 3 ) : 4 8 1 - 4 9 7 . S h a r m a K , L a k s h m i N , V e n u g o p a l a n K , M e h t a P , M a h e s h w a r i A a n d B a p u r a S . 2 0 0 3 . X - r a y d i f f r a c t i o n b e t w e e n c y a n o b a c t e r i a a n d d a i r y e f f l u e n t , C u r r . S c i . , 8 5 ( 9 ) : 1 3 3 0 - 1 3 3 4 . S u b r a m a n i a n G a n d S h a n m u g a s u n d a r a m S . 1 9 8 6 . F l o w o f c a r b o n t h r o u g h t h e N i t r o g e n - f i x i n g c y a n o b a c t e r i u m A n a b a e n a , P h y t o s y n t h e t i c a 2 0 : 4 4 2 - 4 4 6 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 5 3 - 1 6 2 1 6 1 G a n a p a t h y S e l v a m e t a l . , 2 0 1 1

S u b r a m a n i a n C V . 1 9 7 1 . H y p o m y c e t e s , I . C . A . R . , P u b l i c a t i o n s , N e w D e l h i . T a n g E P Y , V i n c e n t W F , P r o u l x D , L e s s a r d P a n d N o u e J . 1 9 9 7 . P o l a r c y a n o b a c t e r i a v e r s u s g r e e n a l g a e f o r t e r t i a r y w a s t e - w a t e r t r e a t m e n t i n c o o l c l i m a t e s , J . A p p l . P h y c o l . , 9 : 3 7 1 - 3 8 1 . s T u r p i n D H . 1 9 9 1 . E f f e c t s o f i n o r g a n i c N - a v a i l a b i l i t y o n a l g a l p h o t o s y n t h e s i s a n d c a r b o n m e t a b o l i s m , J . P h y c o l . , 2 7 : 1 4 - 2 0 . U m a L a n d S u b r a m a n i a n G . 1 9 9 0 . E f f e c t i v e u s e o f c y a n o b a c t e r i a i n e f f l u e n t t r e a t m e n t , N a t l . S y m p . C y a n o b a c t e r i a l N i t r o g e n - F i x a t i o n , I A R I , N e w D e l h i . 4 3 7 - 4 4 4 . V i j a y a k u m a r S . T h a j u d d i n N a n d M a n o h a r a n C . 2 0 0 5 . R o l e o f c y a n o b a c t e r i a i n t h e t r e a t m e n t o f d y e i n d u s t r y e f f l u e n t . P o l l . R e s . , 2 4 ( 1 ) : 7 9 - 8 4 . V i j a y a k u m a r S T h a j u d d i n N a n d M a n o h a r a n C . 2 0 0 7 . B i o d i v e r s i t y o f c y a n o b a c t e r i a i n i n d u s t r i a l e f f l u e n t . A c t a B o t a n i c a M a l a c i t a n a 3 2 : 2 7 - 3 4 . V e n k a t e s w a r l u V . 1 9 6 9 . A n e c o l o g i c a l s t u d y o f t h e a l g a e o f t h e M o o s i r i v e r , H y d e r a b a d ( I n d i a ) w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o W a t e r P o l l u t i o n P a r t I P h y s i c o - c h e m i c a l C o m p l e x e s , H y d r o b i o l . , 3 3 ( 1 ) : 1 1 7 - 1 4 3 . 1 6 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 1 5 3 - 1 6 2 G a n a p a t h y S e l v a m e t a l . , 2 0 1 1