J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y S c r e e n i n g a n d i s o l a t i o n o f p o t e n t b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g B a c i l l u s s u b t i l i s C S 1 4 f r o m c o n t a m i n a t e d s o i l s a m p l e s o f K a n c h i p u r a m , I n d i a K e y w o r d s : B i o s u r f a c t a n t , c o n t a m i n a t e d s o i l , B a c i l l u s s u b t i l i s C S 1 4 , 1 6 s r D N A s t u d i e s . A B S T R A C T : A g o o d b i o s u r f a c t a n t m u s t r e d u c e t h e s u r f a c e t e n s i o n o f t h e w a t e r f r o m 7 2 t o 3 5 m i l l i - N e u t o n / m e t e r ( m N / m ) a n d s h o u l d s h o w a s u r f a c e a c t i v i t y o f a t l e a s t 3 7 m N / m . A n e x t e n s i v e s c r e e n i n g w i t h 1 3 c o n t a m i n a t e d s o i l s a n d o n e o i l r e f i n e r y s l u d g e w a s c a r r i e d o u t t o i s o l a t e a p o t e n t i a l s t r a i n . . T o t a l l y 3 6 6 2 c o l o n i e s w e r e o b t a i n e d f r o m a l l 1 4 c o n t a m i n a t e d s o i l s a m p l e s o v e r a p e r i o d o f t h r e e m o n t h s f r o m w h i c h 2 1 2 m o r p h o l o g i c a l l y d i f f e r e n t c o l o n i e s w e r e t e s t e d f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c t i o n a n d 2 2 p o s i t i v e s t r a i n s w e r e i d e n t i f i e d . A l l t h e i s o l a t e s w e r e t e s t e d q u a n t i t a t i v e l y a n d t h e i s o l a t e C S 1 4 s h o w e d m a x i m u m s u r f a c e a c t i v i t y o f 5 1 . 3 8 m N / m . T a x o n o m i c i d e n t i f i c a t i o n o f t h e b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g s t r a i n C S 1 4 w a s p e r f o r m e d u s i n g 1 6 s r D N A s t u d i e s a n d w a s i d e n t i f i e d a s B a c i l l u s s u b t i l i s . 1 4 0 - 1 4 7 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 2 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : B a l a s u b r a m a n i a n R a m e s h 1 , 2 , G o p a l a k r i s h n a n S u r e s h 1 , N a g a i y a R a v i c h a n d r a n 1 , G a n e s a n V i j a i y a n s i v a 1 * I n s t i t u t i o n : 1 U n i t o f E n v i r o n m e n t a l B i o t e c h n o l o g y , D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , U n i v e r s i t y o f M a d r a s , M a r a i m a l a i C a m p u s , C h e n n a i , I n d i a 6 0 0 0 2 5 . 2 D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , S r i S a n k a r a A r t s a n d S c i e n c e C o l l e g e , E n a t h u r , K a n c h i p u r a m , I n d i a 6 3 1 5 6 1 . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : G a n e s a n V i j a i y a n s i v a E m a i l : g v s b i o @ g m a i l . c o m P h o n e N o : 9 8 4 0 3 0 4 8 8 8 W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 4 7 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 1 6 J u n 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 2 1 J u n 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 2 3 J u n 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : B a l a s u b r a m a n i a n R a m e s h , G o p a l a k r i s h n a n S u r e s h , N a g a i y a R a v i c h a n d r a n , G a n e s a n V i j a i y a n s i v a . S c r e e n i n g a n d i s o l a t i o n o f p o t e n t b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g B a c i l l u s s u b t i l i s C S 1 4 f r o m c o n t a m i n a t e d s o i l s a m p l e s o f K a n c h i p u r a m , I n d i a . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 2 : 1 4 0 - 1 4 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h p a p e r

I N T R O D U C T I O N B i o s u r f a c t a n t s a r e a m p h i p h i l i c c o m p o u n d s p r o d u c e d o n l i v i n g s u r f a c e s , m o s t l y o n m i c r o b i a l c e l l s u r f a c e s , o r e x c r e t e d e x t r a c e l l u l a r l y a n d c o n t a i n h y d r o p h o b i c a n d h y d r o p h i l i c m o i e t i e s t h a t c o n f e r t h e a b i l i t y t o a c c u m u l a t e b e t w e e n f l u i d p h a s e s , w h i c h a r e r e d u c i n g s u r f a c e a n d i n t e r f a c i a l t e n s i o n a t t h e s u r f a c e a n d i n t e r f a c e r e s p e c t i v e l y . T h e y a r e s t r u c t u r a l l y d i v e r s e g r o u p o f s u r f a c e a c t i v e m o l e c u l e s s y n t h e s i z e d b y m i c r o o r g a n i s m s ( M u t h u s a m y e t a l . , 2 0 0 8 ) . T h e B i o s u r f a c t a n t s a r e a d i v e r s e g r o u p o f b i o m o l e c u l e s , w h i c h s h a r e t h e s a m e p r o p e r t i e s a s s y n t h e t i c s u r f a c t a n t , a n d i n s o m e c a s e s , t h e y a r e s u p e r i o r i n c r e a t i n g w a t e r - i n - o i l o r o i l i n w a t e r e m u l s i o n s ( A s h t a p u t r e a n d s h a h , 1 9 9 5 ; J a c o b u c c i e t a l . , 2 0 0 9 ) . M i c r o b i a l d e r i v e d s u r f a c t a n t s h a v e s p e c i a l a d v a n t a g e s o v e r t h e i r c h e m i c a l l y m a n u f a c t u r e d c o u n t e r p a r t s b e c a u s e o f t h e i r l o w e r t o x i c i t y , b i o d e g r a d a b l e n a t u r e a n d e f f e c t i v e n e s s a t e x t r e m e t e m p e r a t u r e a n d p H v a l u e s ( J a c o b u c c i e t a l . , 2 0 0 9 ) . W h e n p r o p e r l y s t i m u l a t e d , B i o s u r f a c t a n t s p r o d u c i n g m i c r o o r g a n i s m s c a n a i d i n t h e b i o r e m e d i a t i o n o f o i l c o n t a m i n a t e d s o i l a n d h y d r o c a r b o n c o n t a m i n a n t i n t h e e n v i r o n m e n t ( C a r r i l l o e t a l . , 1 9 9 6 ; J a c o b u c c i e t a l . , 2 0 0 9 ) . A v a r i e t y o f m i c r o o r g a n i s m s , i n c l u d i n g b a c t e r i a , f u n g i , a n d y e a s t s , h a v e b e e n r e p o r t e d t o p r o d u c e b i o s u r f a c t a n t s . S e v e r a l o f t h e s e b i o s u r f a c t a n t s a r e w e l l d e s c r i b e d c h e m i c a l l y a d c a t e g o r i z e d i n t o h i g h - a n d l o w - m o l e c u l a r - m a s s c o m p o u n d s . T h e l o w - m o l e c u l a r - m a s s b i o s u r f a c t a n t s i n c l u d e g l y c o l i p i d s a n d l i p o p e p t i d e s , s u c h a s r h a m n o l i p i d s a n d s u r f a c t i n . T h e h i g h - m o l e c u l a r m a s s c o m p o u n d s i n c l u d e p r o t e i n s a n d l i p o p r o t e i n s , o r c o m p l e x m i x t u r e s o f t h e s e p o l y m e r s ( D e - s o u z a e t a l . , 2 0 0 3 ) . I n r e c e n t y e a r s , t h e r e h a s b e e n a g r o w i n g i n t e r e s t i n t h e i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f n e w m i c r o b i a l s u r f a c t a n t t h e m i g h t h a v e a p p l i c a t i o n i n e n h a n c e d o i l r e c o v e r y p r o c e s s e s . B i o s u r f a c t a n t s a r e o f i n t e r e s t b e c a u s e o f t h e i r b r o a d r a n g e o f p o t e n t i a l i n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n s , i n c l u d i n g e m u l s i f i c a t i o n , p h a s e s e p a r a t i o n , w e t t i n g , f o a m i n g , e m u l s i o n s t a b i l i z a t i o n a n d v i s c o s i t y r e d u c t i o n o f h e a v y c r u d e o i l s ( O c h s n e r e t a l . , 1 9 9 4 ) . P o t e n t i a l a p p l i c a t i o n e n v i s a g e d i n s e v e r a l i n d u s t r i e s s u c h a s a g r i c u l t u r e , f o o d , t e x t i l e s , c o s m e t i c s , p e t r o c h e m i c a l a n d p e t r o l e u m p r o d u c t i o n ( R e i l i n g e t a l . , 1 9 8 6 ) . B i o s u r f a c t a n t s a r e u s e d i n t h e r e m e d i a t i o n o f o r g a n i c a n d m e t a l c o n t a m i n a t e d s i t e s , e n h a n c e d o i l r e c o v e r y a n d a s c o s m e t i c a d d i t i v e s ( B o d o u r e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h e y a r e p o w e r f u l n a t u r a l e m u l s i f i e r s c a p a b l e o f r e d u c i n g t h e s u r f a c e t e n s i o n o f w a t e r f r o m r o u g h l y 7 6 m i l l i - N e w t o n / m e t e r ( m N / m ) t o 2 5 - 3 0 m N / m . T h i s b i o s u r f a c t a n t a c t i v i t y m a k e s t h e m e x c e l l e n t c a n d i d a t e s f o r a s s i s t i n g i n t h e b r e a k d o w n a n d r e m o v a l o f o i l s p i l l s . B i o s u r f a c t a n t s a l s o d e m o n s t r a t e a n t i b a c t e r i a l a n d a n t i f u n g a l a c t i v i t i e s , s u g g e s t i n g p o s s i b l e r o l e s i n t h e m e d i c a l a n d a g r i c u l t u r a l f i e l d s ( G u n t h e r e t a l . , 2 0 0 5 ) . T h e p r e s e n t s t u d y i s i n c o n t i n u a t i o n o f o u r p r e v i o u s f i n d i n g t h a t I n d i a n s o i l s a r e r i c h i n b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g b a c t e r i a a n d t h e i r p o p u l a t i o n i s h i g h e r i n c o n t a m i n a t e d s o i l s t h a n i n u n d i s t u r b e d s o i l s ( R a m e s h e t a l . , 2 0 1 0 ) . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S C o l l e c t i o n o f s o i l s a m p l e s : T h e s o i l s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f r o m d i f f e r e n t p l a c e s i n a n d a r o u n d K a n c h i p u r a m ( 1 2 ° 5 0 ' 2 3 " N 7 9 ° 4 2 ' 0 " E ) u s i n g t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d b y B o d o u r e t a l . , i n 2 0 0 3 a s s h o w n i n T a b l e 1 . T o t a l l y 1 3 s o i l s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f r o m m e t a l , o i l a n d p e t r o - p r o d u c t s c o n t a m i n a t e d s i t e s . O n e o i l r e f i n e r y s l u d g e s a m p l e w a s a l s o c o l l e c t e d f r o m C h e n n a i P e t r o l e u m C o r p o r a t i o n L i m i t e d r e f i n e r y ( C P C L ) , M a n a l i , C h e n n a i . T h e s e s a m p l e s w e r e d e s i g n a t e d a s S S 1 - S S 1 4 a n d s c r e e n e d f o r p o t e n t b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s . E n u m e r a t i o n o f s o i l m i c r o b i a l c o u n t s : T h e t o t a l n u m b e r o f c u l t u r a b l e , a e r o b i c , b a c t e r i a p e r g r a m o f s a m p l e w a s d e t e r m i n e d b y u s i n g n u t r i e n t a g a r p l a t e s ( H u a n g e t a l . , 2 0 0 8 ) . T h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s w e r e e n u m e r a t e d a s c o l o n y - f o r m i n g u n i t s ( C F U ) f r o m a s e r i a l d i l u t i o n o f t h e s o i l s u s p e n s i o n s . T h e c o l o n i e s w e r e c o u n t e d a f t e r i n c u b a t i o n f o r 3 d a y s a t 3 0 ° C . S c r e e n i n g f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s : S o i l s w e r e s c r e e n e d f o r b i o s u r f a c t a n t s p r o d u c i n g i s o l a t e s b y u s i n g t h e f o l l o w i n g p r o c e d u r e ( B o d o u r e t a l . , 2 0 0 3 ) . A 5 g s a m p l e o f e a c h s o i l w a s p l a c e d i n t o a 2 5 0 m l f l a s k c o n t a i n i n g 5 0 m l o f s t e r i l e t a p w a t e r a n d i n c u b a t e d a t 2 3 ° C o n a s h a k e r a t 2 0 0 r p m f o r 2 1 d a y s . O n d a y s 3 , 7 , 1 4 , a n d 2 1 , a s a m p l e o f e a c h s o i l s l u r r y w a s s e r i a l l y d i l u t e d , p l a t e d o n R 2 A a g a r ( H i m e d i a ) , a n d i n c u b a t e d f o r 1 w e e k . A f t e r i n c u b a t i o n , p l a t e s w e r e e n u m e r a t e d , a n d m o r p h o l o g i c a l l y d i f f e r e n t b a c t e r i a w e r e s e l e c t e d f o r q u a l i t a t i v e b i o s u r f a c t a n t s c r e e n i n g . I s o l a t e d c o l o n i e s w e r e i n o c u l a t e d i n t o 5 m l m i n e r a l s a l t s m e d i u m ( M S M ) c o n t a i n i n g 2 % g l u c o s e a s t h e s o l e c a r b o n a n d e n e r g y s o u r c e . T h e M S M w a s a m i x t u r e o f s o l u t i o n A a n d s o l u t i o n B . S o l u t i o n A c o n t a i n e d ( p e r l i t e r ) 2 . 5 g o f N a N O 3 , 0 . 4 g o f M g S O 4 · 7 H 2 O , 1 . 0 g o f N a C l , 1 . 0 g o f K C l , 0 . 0 5 g 1 4 1 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 2 : 1 4 0 - 1 4 7 V i j a i y a n s i v a e t a l . , 2 0 1 1

o f C a C l 2 · 2 H 2 O , a n d 1 0 m l o f c o n c e n t r a t e d p h o s p h o r i c a c i d ( 8 5 % ) . T h i s s o l u t i o n w a s a d j u s t e d t o p H 7 . 2 w i t h K O H p e l l e t s . S o l u t i o n B c o n t a i n e d ( p e r l i t e r ) 0 . 5 g o f F e S O 4 · 7 H 2 O , 1 . 5 g o f Z n S O 4 · 7 H 2 O , 1 . 5 g o f M n S O 4 · H 2 O , 0 . 3 g o f K 3 B O 3 , 0 . 1 5 g o f C u S O 4 · 5 H 2 O , a n d 0 . 1 g o f N a 2 M o O 4 · 2 H 2 O . O n e m i l l i l i t e r o f s o l u t i o n B w a s a d d e d t o 1 , 0 0 0 m l o f s o l u t i o n A t o f o r m t h e M S M . T h e b r o t h c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d w i t h s h a k i n g ( 2 0 0 r p m ) f o r 7 t o 9 d a y s a t 2 3 ° C . T h e c e l l f r e e s u p e r n a t a n t s w e r e t h e n t e s t e d f o r t h e p r e s e n c e o f s u r f a c t a n t b y u s i n g t h e q u a l i t a t i v e d r o p c o l l a p s e m e t h o d . Q u a l i t a t i v e d r o p c o l l a p s e t e s t s w e r e p e r f o r m e d i n t h e p o l y s t y r e n e l i d o f a 9 6 m i c r o w e l l 1 2 . 7 b y 8 . 5 c m p l a t e . T h e l i d s h a v e 9 6 c i r c u l a r w e l l s ( i n t e r n a l d i a m e t e r , 8 m m ) . A t h i n c o a t o f 2 0 W - 4 0 o i l w a s a p p l i e d t o e a c h w e l l . T h e c o a t e d w e l l s w e r e e q u i l i b r a t e d f o r 2 4 h o u r s a t 2 3 º C a n d t h e n 5 µ l o f e a c h s u p e r n a t a n t w a s d e l i v e r e d i n t o t h e c e n t e r o f e a c h w e l l . I f t h e d r o p r e m a i n e d b e a d e d a f t e r 2 m i n u t e s , t h e r e s u l t w a s s c o r e d a s n e g a t i v e . I f t h e d r o p s p r e a d a n d c o l l a p s e d t h e r e s u l t w a s s c o r e d a s p o s i t i v e f o r t h e p r e s e n c e o f b i o s u r f a c t a n t . A l l t h e p o s i t i v e i s o l a t e s i n d r o p c o l l a p s e t e s t w e r e f u r t h e r s u b j e c t e d t o s e c o n d a r y q u a l i t a t i v e s c r e e n i n g f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c t i o n b y b e t a - h a e m o l y t i c a c t i v i t y . Q u a l i t a t i v e s c r e e n i n g f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s b y b e t a - h a e m o l y t i c a c t i v i t y o n b l o o d a g a r p l a t e s : S i n c e t h e b e t a - h e m o l y t i c a c t i v i t y i s i n d i c a t i v e o f s u r f a c e a c t i v i t y , q u a l i t a t i v e s c r e e n i n g f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s w a s c a r r i e d o u t u s i n g t h e B l o o d a g a r p l a t e s . T h e s t r a i n s s u b j e c t e d t o d r o p c o l l a p s e t e s t w e r e s u b s e q u e n t l y i n o c u l a t e d o n b l o o d a g a r p l a t e s a n d w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 o C . A f t e r 2 4 h o u r s t h e p r e s e n c e o f h e m o l y t i c z o n e w a s o b s e r v e d ( Y o u s s e f e t a l . , 2 0 0 4 ; R o d r i g u e z e t a l . , 2 0 0 6 ) . Q u a n t i t a t i v e m e a s u r e m e n t o f s u r f a c e a c t i v i t y : A l l t h e i s o l a t e s t h a t t e s t e d p o s i t i v e i n t h e d r o p c o l l a p s e t e s t w e r e t h e n t e s t e d q u a n t i t a t i v e l y f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c t i o n w i t h t h e d r o p w e i g h t m e t h o d d e s c r i b e d b y S a b e s a n e t a l . , i n 2 0 0 2 . T h e i s o l a t e s w e r e g r o w n i n 5 m l o f m i n e r a l s a l t m e d i u m a m e n d e d w i t h 2 % g l u c o s e . C e l l s u s p e n s i o n s w e r e c e n t r i f u g e d a t 5 0 0 0 r p m f o r 1 5 m i n u t e s a n d t h e c e l l f r e e s u p e r n a t a n t w a s p o u r e d i n t o a b u r e t t e . T h e b o t t o m o f t h e b u r e t t e c o n s i s t s o f a r u b b e r t u b e a t t a c h e d w i t h g l a s s t u b e o f 3 m m d i a m e t e r . A n e m p t y p r e - w e i g h e d b e a k e r w a s p l a c e d u n d e r t h e b u r e t t e a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s r e l e a s e d s l o w l y d r o p b y d r o p . 5 0 d r o p s w e r e p o u r e d i n t o t h e b e a k e r a n d i t w a s w e i g h e d t o d e t e r m i n e t h e w e i g h t o f 5 0 d r o p s . T h e m a s s o f o n e d r o p w a s c a l c u l a t e d b y u s i n g t h e f o r m u l a M a s s o f o n e d r o p ( M ) = B e a k e r + S a m p l e w e i g h t B e a k e r W e i g h t N u m b e r o f d r o p s T h e n t h e s u r f a c e t e n s i o n o f t h e s u p e r n a t a n t w a s c a l c u l a t e d b y u s i n g t h e f o r m u l a S u r f a c e t e n s i o n ( T ) = M g x 1 0 - 3 x n m - 1 π r W h e r e M = M a s s o f o n e d r o p g = G r a v i t y r = R a d i u s o f g l a s s t u b e S u r f a c e a c t i v i t y o f e a c h i s o l a t e w a s c a l c u l a t e d b y t h e f o l l o w i n g f o r m u l a : S u r f a c e a c t i v i t y = S u r f a c e t e n s i o n o f u n i n o c u l a t e d m e d i u m s u r f a c e t e n s i o n o f s u p e r n a t a n t . G e n u s l e v e l i d e n t i f i c a t i o n o f a l l t h e b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s : T h e b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s d e t e r m i n e d b y q u a n t i t a t i v e s t u d i e s w e r e i d e n t i f i e d u p t o g e n u s l e v e l b y s t u d y i n g p h e n o t y p i c c h a r a c t e r s l i k e g r a m s t a i n i n g , m o t i l i t y a n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s l i k e o x i d a s e , c a t a l a s e , I M V I C , u r e a s e , n i t r a t e r e d u c t i o n a n d s u g a r f e r m e n t a t i o n t e s t s . T h e m e t h o d s d e s c r i b e d b y C a p p u c c i n o ( 1 9 9 9 ) w a s f o l l o w e d f o r a l l t h e p r o c e d u r e s . A l l t h e s e r e s u l t s w e r e c o m p a r e d w i t h B e r g e y ' s M a n u a l o f D e t e r m i n a t i v e B a c t e r i o l o g y t o d e t e r m i n e t h e g e n u s ( H o l t e t a l . , 1 9 9 4 ) . T a x o n o m i c i d e n t i f i c a t i o n o f t h e p o t e n t b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g s t r a i n C S 1 4 u s i n g 1 6 s r D N A s t u d i e s : T a x o n o m i c i d e n t i f i c a t i o n o f t h e b e s t b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g s t r a i n C S 1 4 w a s p e r f o r m e d u s i n g 1 6 s r D N A s t u d i e s ( H e u e r e t a l . , 1 9 9 7 ; M i s h r a a n d D o b l e , 2 0 0 8 ) . U n i v e r s a l e u b a c t e r i a l 1 6 s r D N A P C R p r i m e r s , 2 7 f - f o r w a r d p r i m e r a n d 1 4 9 2 r r e v e r s e p r i m e r w e r e s y n t h e s i z e d ( X u e t a l . , 2 0 0 3 ; B e n t o e t a l . , 2 0 0 5 ) . T h e b a c t e r i a l p e l l e t o b t a i n e d a f t e r c e n t r i f u g a t i o n o f t h e o v e r n i g h t c u l t u r e g r o w n i n L u r i a B e r t a n i B r o t h m e d i u m w e r e b o i l e d a t 9 8 o C f o r 1 0 m i n u t e s i n t h e b o i l i n g w a t e r b a t h a n d k e p t o n i c e i m m e d i a t e l y , w h i c h w a s t h e n u s e d a s D N A t e m p l a t e 2 μ l o f f o r w a r d a n d r e v e r s e p r i m e r s w e r e a d d e d a l o n g w i t h 2 5 μ l o f 2 x P C R M a s t e r M i x ( B a n g a l o r e G e n i e , I n d i a ) a n d m a d e u p t o 5 0 μ l w i t h J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 2 : 1 4 0 - 1 4 7 1 4 2 V i j a i y a n s i v a e t a l . , 2 0 1 1

P C R g r a d e w a t e r . A P r o g r a m o f 9 4 o C f o r 1 m i n u t e f o r d e n a t u r i n g , 4 2 o C f o r 5 0 s e c o n d s f o r a n n e a l i n g a n d 7 2 o C f o r 1 m i n u t e f o r e x t e n s i o n w e r e u s e d E p p e n d o r f P C R M a s t e r c y c l e r u p t o 2 5 c y c l e s . T h e c o n f i r m a t i o n s o f t h e a m p l i c o n s w e r e d o n e b y r u n n i n g t h e s a m p l e s i n 1 % a g a r o s e g e l a l o n g w i t h D N A l a d d e r m a r k e r . T h e s a m p l e w a s s e q u e n c e d a t O c i m u m B i o s o l u t i o n s L t d . , H y d e r a b a d , A n d h r a P r a d e s h , I n d i a a n d w a s s u b m i t t e d t o G e n B a n k o f N a t i o n a l C e n t r e f o r B i o t e c h n o l o g y I n f o r m a t i o n a n d a c c e s s i o n n u m b e r s w a s o b t a i n e d . A n a l y s i s o f t h e s e q u e n c e d b a s e s w i t h t h e h e l p o f N C B I - B L A S T : T h e p a r t i a l 1 6 s r R N A g e n e s e q u e n c e i n F A S T A f o r m a t w a s u s e d f o r s i m i l a r i t y s e a r c h a g a i n s t n o n - r e d u n d a n t ( n r ) d a t a b a s e b y B a s i c L o c a l A l i g n m e n t S e a r c h T o o l ( b l a s t n ) a t N a t i o n a l C e n t r e f o r B i o t e c h n o l o g y I n f o r m a t i o n s e r v e r ( A l t s c h u l e t a l . , 1 9 9 7 ) . P h y l o g e n e t i c t r e e c o n s t r u c t i o n : P h y l o g e n e t i c t r e e w a s c o n s t r u c t e d u s i n g 1 6 s r R N A g e n e s e q u e n c e o b t a i n e d , 8 h i g h l y h o m o l o g o u s s e q u e n c e s i d e n t i f i e d b y b l a s t n r e s u l t a n d o n e u n r e l a t e d s e q u e n c e w a s a l s o s e l e c t e d a s o u t g r o u p . T o t a l l y , 1 0 1 6 s r R N A s e q u e n c e i n c l u d i n g o u t g r o u p w e r e s e l e c t e d f o r p h y l o g e n e t i c t r e e c o n s t r u c t i o n . S i m i l a r i t y m a t r i x w a s p r e p a r e d u s i n g D n a d i s t p r o g r a m i n P H Y L I P a n a l y s i s p a c k a g e ( J i a n g e t a l . , 2 0 0 9 ) u s i n g j u k e s c a n t o r c o r r e c t i o n s . P h y l o g e n e t i c t r e e w a s c o n s t r u c t e d b y t h e n e i g h b o r - j o i n i n g m e t h o d u s i n g t h e M o l e c u l a r E v o l u t i o n a r y G e n e t i c s A n a l y s i s ( M E G A ) s o f t w a r e p a c k a g e v e r s i o n 5 ( T a m u r a e t a l . , 2 0 1 1 ) . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N C o l l e c t i o n o f c o n t a m i n a t e d s o i l s a m p l e s : T h e s o i l s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f r o m d i f f e r e n t p l a c e s i n a n d a r o u n d K a n c h i p u r a m u s i n g t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d b y B o d o u r e t a l . , i n 2 0 0 3 . T h e r e s u l t s a r e s h o w n i n T a b l e 1 . E n u m e r a t i o n o f s o i l m i c r o b i a l c o u n t s : T h e a v e r a g e S t a n d a r d P l a t e C o u n t w a s 2 . 8 1 x 1 0 8 C F U / g o f c o n t a m i n a t e d s o i l s a m p l e s ( T a b l e 2 ) . Q u a l i t a t i v e s c r e e n i n g f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s b y d r o p c o l l a p s e t e s t : T o t a l l y 3 6 6 2 c o l o n i e s w e r e o b t a i n e d f r o m 3 , 7 , 1 4 a n d 2 1 d a y s r e t r i e v a l o f a l l 1 4 c o n t a m i n a t e d s o i l s a m p l e s o v e r a p e r i o d o f 3 m o n t h s f r o m w h i c h 2 1 2 m o r p h o l o g i c a l l y d i f f e r e n t c o l o n i e s w e r e t e s t e d f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c t i o n e m p l o y i n g 9 6 w e l l m i c r o p l a t e l i d a n d 2 2 p o s i t i v e s t r a i n s w e r e i d e n t i f i e d . A l l t h e 2 2 p o s i t i v e s t r a i n s w e r e f u r t h e r a s s e s s e d f o r b e t a - h a e m o l y t i c a c t i v i t y o n b l o o d a g a r p l a t e s a s s e c o n d a r y c o n f i r m a t i o n a n d s e c r e t a r y n a t u r e o f b i o s u r f a c a n t s ( T a b l e 2 ) . Q u a l i t a t i v e s c r e e n i n g f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s b y b e t a - h a e m o l y t i c a c t i v i t y o n b l o o d a g a r p l a t e s : S i n c e t h e b e t a - h e m o l y t i c a c t i v i t y i s i n d i c a t i v e o f s u r f a c e a c t i v i t y , q u a l i t a t i v e s c r e e n i n g f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s w a s c a r r i e d o u t u s i n g t h e B l o o d a g a r p l a t e s . T h e 2 2 p o s i t i v e s t r a i n s f r o m d r o p c o l l a p s e t e s t w e r e s u b s e q u e n t l y i n o c u l a t e d o n b l o o d a g a r p l a t e s a n d w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 o C . T o t a l l y , 1 5 p o s i t i v e s t r a i n s s h o w e d g o o d b e t a - h a e m o l y t i c a c t i v i t y o n b l o o d a g a r p l a t e s . T h e s u r f a c e a c t i v e i s o l a t e s o b t a i n e d i n t h i s s t u d y w e r e d e s i g n a t e d a s I s o l a t e C S 1 C S 1 5 . 1 4 3 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 2 : 1 4 0 - 1 4 7 V i j a i y a n s i v a e t a l . , 2 0 1 1 S . N o S o i l S a m p l e n a m e L o c a t i o n C o n t a m i n a t i o n G e o g r a p h i c a l c o o r d i n a t e s 0 1 S S - 1 P e t r o l b u n k P e t r o l a n d D i e s e l 1 2 ° 5 0 4 7 . 0 0 N ; 7 9 ° 4 1 4 4 . 6 2 E 0 2 S S - 2 W e l d i n g s h o p M e t a l a n d w a s t e o i l 1 2 ° 5 0 1 1 . 0 7 N ; 7 9 ° 4 2 2 1 . 6 6 E 0 3 S S - 3 R a t i o n s h o p K e r o s e n e 1 2 ° 4 9 0 5 . 4 8 N ; 7 9 ° 4 1 3 2 . 6 3 E 0 4 S S - 4 M e c h a n i c s h o p M o t o r o i l 1 2 ° 5 0 1 1 . 2 4 N ; 7 9 ° 4 2 2 2 . 4 6 E 0 5 S S - 5 M o t o r c y c l e S h e d M o t o r o i l 1 2 ° 5 0 0 9 . 5 0 N ; 7 9 ° 4 2 2 2 . 1 1 E 0 6 S S - 6 W e l d i n g s h o p M e t a l a n d w a s t e o i l 1 2 ° 4 9 0 5 . 6 8 N ; 7 9 ° 4 1 3 6 . 7 2 E 0 7 S S - 7 O l d b u s s h e d M o t o r o i l , 1 2 ° 5 1 2 5 . 3 4 N ; 7 9 ° 3 1 4 7 . 8 0 E 0 8 S S - 8 P e t r o l b u n k P e t r o l a n d D i e s e l 1 2 ° 4 9 5 8 . 5 4 N ; 7 9 ° 4 2 1 3 . 3 8 E 0 9 S S - 9 M e c h a n i c s h o p M o t o r o i l 1 2 ° 4 9 1 7 . 1 9 N ; 7 9 ° 4 1 5 3 . 7 8 E 1 0 S S - 1 0 G e n e r a t o r e n g i n e r o o m M o t o r o i l , D i e s e l 1 2 ° 5 1 3 1 . 4 8 N ; 7 9 ° 4 3 5 2 . 7 1 E 1 1 S S - 1 1 B u s s h e d M o t o r o i l , D i e s e l 1 2 ° 5 0 0 4 . 5 7 N ; 7 9 ° 4 2 1 8 . 0 1 E 1 2 S S - 1 2 M e c h a n i c s h o p M o t o r o i l 1 2 ° 5 0 2 0 . 4 0 N ; 7 9 ° 4 2 3 2 . 7 0 E 1 3 S S - 1 3 P e t r o l b u n k P e t r o l a n d D i e s e l 1 2 ° 4 9 0 3 . 3 4 N ; 7 9 ° 4 1 3 4 . 4 5 E 1 4 S S - 1 4 C P C L , C h e n n a i C r u d e o i l 1 3 ° 0 9 4 7 . 4 5 N ; 8 0 ° 1 6 4 6 . 3 7 E T a b l e 1 : C o l l e c t i o n o f c o n t a m i n a t e d s o i l s a m p l e s

J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 2 : 1 4 0 - 1 4 7 1 4 4 V i j a i y a n s i v a e t a l . , 2 0 1 1 S a m p l e N o . L o c a t i o n S P C x 1 0 8 C F U / m l N o . o f c o l o n i e s i n R 2 A a g a r N o . o f P o s i t i v e s i n Q u a l i t a t i v e S c r e e n i n g D a y s o f i n c u b a t i o n i n w a t e r T o t a l N o . o f c o l o n i e s C o l o n i e s s e l e c t e d f o r s c r e e n i n g S S - 1 P e t r o l b u n k 0 . 0 3 3 3 1 5 4 7 0 7 2 1 5 1 1 4 2 3 5 1 2 1 9 3 0 S S - 2 W e l d i n g s h o p 0 . 0 4 7 3 9 2 5 0 7 1 8 4 0 1 4 1 6 5 0 2 1 1 1 2 0 S S - 3 R a t i o n s h o p 0 . 0 5 0 3 3 2 4 0 7 7 2 0 1 4 1 7 3 0 2 1 9 3 1 S S - 4 M e c h a n i c s h o p 6 . 4 3 3 1 3 4 5 2 7 5 6 3 0 1 4 2 4 3 0 2 1 1 4 2 0 S S - 5 M o t o r c y c l e S h e d 7 . 1 3 3 1 9 8 6 0 7 1 1 2 7 0 1 4 7 3 3 0 2 1 3 4 2 0 S S - 6 W e l d i n g s h o p 0 . 0 4 5 3 1 1 4 4 0 7 1 3 2 0 1 4 8 2 0 2 1 1 4 3 1 S S - 7 O l d b u s s h e d 3 . 1 4 3 1 5 7 6 2 7 7 6 4 1 1 4 3 9 3 0 2 1 1 8 3 0 S S - 8 P e t r o l b u n k 3 . 0 6 3 1 5 8 4 0 7 8 9 6 2 1 4 5 6 4 0 2 1 2 8 2 0 S S - 9 M e c h a n i c s h o p 0 . 8 0 3 1 3 4 5 0 7 8 0 3 0 1 4 6 5 2 0 2 1 2 7 3 0 S S - 1 0 G e n e r a t o r e n g i n e r o o m 1 . 1 0 3 1 1 2 3 0 7 7 1 3 0 1 4 4 8 2 0 2 1 1 4 3 0 S S - 1 1 B u s s h e d 4 . 3 3 1 5 8 6 0 7 8 3 5 0 1 4 3 4 3 1 2 1 1 3 3 0 S S - 1 2 M e c h a n i c s h o p 0 . 9 3 3 1 4 9 7 0 7 9 3 4 0 1 4 4 8 5 1 2 1 1 9 4 1 S S - 1 3 P e t r o l b u n k 7 . 9 3 3 1 9 8 5 0 7 8 7 3 0 1 4 4 6 3 0 2 1 1 7 2 0 S S - 1 4 S l u d g e s a m p l e 4 . 3 4 3 1 5 6 6 1 7 8 6 4 0 1 4 7 4 3 0 2 1 2 0 3 0 T o t a l n u m b e r o f c o l o n i e s 3 6 6 2 2 1 2 1 5 T a b l e 2 : E n u m e r a t i o n o f s o i l m i c r o b i a l c o u n t a n d Q u a l i t a t i v e s c r e e n i n g f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s

Q u a n t i t a t i v e m e a s u r e m e n t o f s u r f a c e a c t i v i t y o f b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s u s i n g d r o p w e i g h t m e t h o d : A l l t h e i s o l a t e s t h a t t e s t e d p o s i t i v e i n b o t h d r o p c o l l a p s e t e s t a s w e l l a s b y b e t a - h a e m o l y t i c a c t i v i t y a s s a y w e r e t h e n t e s t e d q u a n t i t a t i v e l y f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c t i o n w i t h t h e d r o p w e i g h t m e t h o d . T h e r e s u l t s a r e s h o w n i n T a b l e 3 . T h e I s o l a t e C S 1 4 s h o w e d m a x i m u m s u r f a c e a c t i v i t y o f 5 1 . 3 8 x 1 0 - 3 n m - 1 . I t w a s a b l e t o r e d u c e t h e s u r f a c e t e n s i o n o f m i n e r a l s a l t m e d i a f r o m 8 8 . 8 x 1 0 - 3 n m - 1 t o 3 7 . 4 2 x 1 0 - 3 n m - 1 . A s o b s e r v e d b y M u l l i g a n , i n 2 0 0 4 a n d G n a n a m a n i e t a l . , i n 2 0 1 0 , a g o o d b i o s u r f a c t a n t m u s t r e d u c e t h e s u r f a c e t e n s i o n o f t h e w a t e r f r o m 7 2 t o 3 5 m N / m a n d s h o u l d s h o w a s u r f a c e a c t i v i t y o f a t l e a s t 3 7 m N / m . I s o l a t e C S 1 4 s h o w e d a s u r f a c e a c t i v i t y o f 5 1 . 3 8 m N / m a n d c a n b e c a t e g o r i z e d a s v e r y g o o d b i o s u r f a c t a n t p r o d u c e r . G e n u s l e v e l i d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a l l t h e b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s : A l l t h e b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s C S 1 C S 1 5 w e r e i d e n t i f i e d u p t o g e n u s l e v e l b y s t u d y i n g p h e n o t y p i c c h a r a c t e r s l i k e g r a m s t a i n i n g , m o t i l i t y a n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s l i k e o x i d a s e , c a t a l a s e , I M V I C , u r e a s e , n i t r a t e r e d u c t i o n a n d s u g a r f e r m e n t a t i o n t e s t s . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t e d t h a t t h e I s o l a t e s C S 1 - C S 1 5 b e l o n g t o t h e g e n u s o f P r o v i d e n c i a s p . , P s e u d o m o n a s s p . , P r o v i d e n c i a s p . , B a c i l l u s s p . , P s e u d o m o n a s s p . , B a c i l l u s s p . , B a c i l l u s s p . , P s e u d o m o n a s s p . , M i c r o c o c c u s s p . , B a c i l l u s s p . , P s e u d o m o n a s s p . , P s e u d o m o n a s s p . , R h o d o c o c c u s s p . , B a c i l l u s s p . a n d A e r o m o n a s s p . , r e s p e c t i v e l y . M u k h e r j e e e t a l . , i n 2 0 0 6 , o b s e r v e d t h a t m o s t o f t h e b i o s u r f a c t a n t r e s e a r c h r e l a t e d t o p r o d u c t i o n t r i a l s h a s b e e n m a i n l y c o n f i n e d t o m i c r o o r g a n i s m s , s u c h a s P s e u d o m o n a s s p . , B a c i l l u s s p . a n d C a n d i d a s p . I t m a y b e d u e t o t h e f a c t t h a t t h e s e s p e c i e s p r o d u c e b i o s u r f a c t a n t s i n h i g h a m o u n t s a n d g e t s e l e c t e d i n q u a n t i t a t i v e s c r e e n i n g p r o c e d u r e s . I n t h e p r e s e n t s t u d y a l s o B a c i l l u s s p . C S 1 4 w a s s e l e c t e d b a s e d o n t h e h i g h s u r f a c e a c t i v i t y o f 5 1 . 3 8 1 0 - 3 n m - 1 , d u r i n g t h e q u a n t i t a t i v e s c r e e n i n g . T a x o n o m i c i d e n t i f i c a t i o n o f t h e p o t e n t b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g s t r a i n C S 1 4 u s i n g 1 6 s r D N A s t u d i e s : A p p r o x i m a t e l y 1 . 5 k b D N A f r a g m e n t w a s a m p l i f i e d ( F i g u r e 1 ) a n d w a s s e q u e n c e d . T h e s e q u e n c e w a s s u b m i t t e d t o G e n B a n k o f N a t i o n a l C e n t r e f o r B i o t e c h n o l o g y I n f o r m a t i o n a n d a c c e s s i o n n u m b e r H Q 9 0 2 8 9 5 w a s o b t a i n e d . P h y l o g e n e t i c t r e e c o n s t r u c t i o n : F o r t h e 1 6 s r R N A g e n e s e q u e n c e , 8 h i g h l y h o m o l o g o u s s e q u e n c e s w e r e i d e n t i f i e d b y b l a s t n r e s u l t s a n d w e r e d o w n l o a d e d a n d o n e u n r e l a t e d s e q u e n c e w a s a l s o s e l e c t e d a s o u t g r o u p a n d p h y l o g e n e t i c t r e e w a s c o n s t r u c t e d ( F i g u r e 2 ) . T h e p h y l o g e n e t i c t r e e r e v e a l e d t h a t t h e b e s t b i o s u r f a c t a n t p r o d u c e r I s o l a t e C S 1 4 i s B a c i l l u s s u b t i l i s . 1 4 5 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 2 : 1 4 0 - 1 4 7 V i j a i y a n s i v a e t a l . , 2 0 1 1 S . N o I s o l a t e S u r f a c e t e n s i o n x 1 0 - 3 n m - 1 S u r f a c e a c t i v i t y x 1 0 - 3 n m - 1 1 U n i n o c u l a t e d M S M 8 8 . 8 0 ( C o n t r o l ) 2 C S 1 4 9 . 1 1 3 9 . 6 9 3 C S 2 5 8 . 4 3 0 . 4 0 4 C S 3 6 6 . 2 9 1 1 . 0 4 5 C S 4 5 0 . 2 0 3 8 . 6 0 6 C S 5 7 9 . 5 2 0 9 . 2 8 7 C S 6 8 6 . 5 3 0 2 . 2 7 8 C S 7 5 5 . 2 4 1 9 . 6 7 9 C S 8 8 6 . 5 0 2 . 3 0 1 0 C S 9 7 9 . 5 2 0 9 . 2 8 1 1 C S 1 0 8 6 . 5 0 2 . 3 0 1 2 C S 1 1 6 7 . 8 2 1 . 0 0 1 3 C S 1 2 4 5 . 9 7 1 5 . 7 6 1 4 C S 1 3 5 6 . 9 8 2 2 . 2 4 1 5 C S 1 4 3 7 . 4 2 5 1 . 3 8 1 6 C S 1 5 4 2 . 3 2 4 6 . 4 8 T a b l e 3 : Q u a n t i t a t i v e m e a s u r e m e n t o f s u r f a c e a c t i v i t y o f b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g i s o l a t e s u s i n g d r o p w e i g h t m e t h o d a n d s e l e c t i o n b e s t o f b i o s u r f a c t a n t p r o d u c e r . L a n e 3 : 1 k b D N A L a d d e r m a r k e r , L a n e 5 , 6 : P C R a m p l i f i e d p r o d u c t ~ 1 . 5 k b F i g u r e 1 : P C R a m p l i f i c a t i o n o f 1 6 s r R N A g e n e

C O N C L U S I O N T h e p r e s e n t s t u d y i s t h e f i r s t p r e l i m i n a r y a s s e s s m e n t o n t h e p r e s e n c e o f b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g b a c t e r i a l p o p u l a t i o n i n K a n c h i p u r a m c o n t a m i n a t e d s o i l s . A p o t e n t b i o s u r f a c t a n t - p r o d u c i n g b a c t e r i a l i s o l a t e s B a c i l l u s s u b t i l i s C S 1 4 w i t h a s u r f a c e a c t i v i t y o f 5 1 . 3 8 1 0 - 3 n m - 1 w a s i s o l a t e d a n d c h o s e n a s r e s e a r c h t a r g e t f o r b i o s u r f a c t a n t p r o d u c t i o n , t o b e d e s c r i b e d i n a f u r t h e r w o r k . A C K N O W L E D G E M E N T O n e o f t h e a u t h o r s , B . R a m e s h s i n c e r e l y t h a n k s D r . K . R . V e n k a t e s a n , P r i n c i p a l , S r i S a n k a r a A r t s a n d S c i e n c e C o l l e g e f o r a l l t h e s u p p o r t p r o v i d e d t o c o n d u c t t h i s r e s e a r c h w o r k . R E F E R E N C E S A l t s c h u l F . S t e p h e n , T h o m a s L . M a d d e n , A l e j a n d r o A . S c h ä f f e r , J i n g h u i Z h a n g , Z h e n g Z h a n g , W e b b M i l l e r a n d D a v i d J . L i p m a n , 1 9 9 7 . G a p p e d B L A S T a n d P S I - B L A S T : a n e w g e n e r a t i o n o f p r o t e i n d a t a b a s e s e a r c h p r o g r a m s . N u c l e i c A c i d s R e s . , 2 5 ( 1 7 ) : 3 3 8 9 - 3 4 0 2 . A s h t a p u t r e A A , S h a h A K . 1 9 9 5 . E m u l s i f y i n g p r o p e r t y o f a v i s c o u s e x o p o l y s a c c h a r i d e f r o m S p h i n g o m o n a s p a u c i m o b i l i s . W o r l d J . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . , 1 1 ( 2 ) : 2 1 9 - 2 2 2 . B e n t o F a t i m a M e n e z e s , F l a v i o A . d e O l i v e i r a C a m a r g o , B e n e d i c t C . O k e k e a n d W i l l i a m T . F r a n k e n b e r g e r J r . 2 0 0 5 . D i v e r s i t y o f b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g m i c r o o r g a n i s m s i s o l a t e d f r o m s o i l s c o n t a m i n a t e d w i t h d i e s e l o i l . J . M i c r o b i o l . R e s . , 1 6 0 : 2 4 9 - 2 5 5 . B o d o u r A . A d r i a , K e v i n P . D r e s s a n d R a i n a M . M a i e r . 2 0 0 3 . D i s t r i b u t i o n o f b i o s u r f a c t a n t - p r o d u c i n g b a c t e r i a i n u n d i s t u r b e d a n d c o n t a m i n a t e d a r i d s o u t h w e s t e r n s o i l s . J . A p p l . E n v . M i c r o b i o l . , 6 9 ( 6 ) : 3 2 8 0 - 3 2 8 7 . C a p p u c c i n o J G a n d S h e r m a n N . 1 9 9 9 . M i c r o b i o l o g y : A L a b o r a t o r y M a n u a l ( 6 t h E d ) P e a r s o n E d u c a t i o n p u b l i c a t i o n , S i n g a p o r e . C a r i l l o P G , M a r d a r a z S I , P i t t a - A l v a r e z a n d G i u l i e t t i A M . 1 9 9 6 . I s o l a t i o n a n d s e c t i o n o f b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g b a c t e r i a . W o r l d J . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . , 8 2 - 9 4 . D e - S o u z a T . J o r g e , M a r j a n D e B o e r , P i e t e r D e W a a r d , T e r i s A . v a n B e e k a n d J o s M . R a a i j m a k e r s . 2 0 0 3 . B i o c h e m i c a l , g e n e t i c , a n d z o o s p o r i c i d a l p r o p e r t i e s o f c y c l i c l i p o p e p t i d e s u r f a c t a n t s p r o d u c e d b y P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s . A p p l . E n v . M i c r o b i o l . , 6 9 ( 1 2 ) : 7 1 6 1 - 7 1 7 2 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 2 : 1 4 0 - 1 4 7 1 4 6 V i j a i y a n s i v a e t a l . , 2 0 1 1 F i g u r e 2 : P h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s o f b i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g b a c t e r i a l i s o l a t e C S 1 4 d e r i v e d f r o m 1 6 S r R N A g e n e s e q u e n c e h o m o l o g y B a c i l l u s s u b t i l i s s t r a i n S A Z 2 - 7 ( H Q 2 3 6 0 2 6 ) B a c i l l u s s p . R T 1 0 7 ( A B 3 7 4 3 0 8 ) B a c i l l u s s u b t i l i s s t r a i n M O 2 ( A Y 5 5 3 0 9 5 ) B a c i l l u s s u b t i l i s s t r a i n K J B 0 6 - 3 5 ( H Q 6 8 7 5 0 1 ) C S 1 4 ( H Q 9 0 2 8 9 5 ) B a c i l l u s s u b t i l i s s t r a i n B - 7 6 2 ( H Q 6 0 5 9 1 6 ) B a c i l l u s s p . I T P 0 4 ( F R 6 6 7 1 6 7 ) B a c i l l u s s p . P 2 0 9 ( A B 4 2 5 3 5 8 ) E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n I B B C t 1 ( J F 7 1 4 9 9 2 ) 9 4 5 1 0 . 0 0 0 . 0 2 0 . 0 4 0 . 0 6 0 . 0 8 0 . 1 0

G n a n a m a n i A , K a v i t h a V , R a d h a k r i s h n a n N , M a n d a l A B . 2 0 1 0 . B i o r e m e d i a t i o n o f C r u d e O i l C o n t a m i n a t i o n U s i n g M i c r o b i a l S u r f a c e - A c t i v e A g e n t s : I s o l a t i o n , P r o d u c t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n . J . B i o r e m e d . B i o d e g r a d . , 1 : 1 0 7 - 1 1 5 . G u n t h e r W . N e r e u s , A l b e r t o N u n e z , W i l l i a m F e t t a n d D a n i e l K Y , S o l a i m a n , 2 0 0 5 . P r o d u c t i o n o f r h a m n o l i p i d s b y P s e u d o m o n a s c h l o r o r a p h i s , a n o n p a t h o g e n i c b a c t e r i u m . A p p l . E n v . M i c r o b i o l . , 7 1 ( 5 ) : 2 2 8 8 - 2 2 9 3 . H e u e r H , K r s e k M , B a k e r P , S m a l l a K , W e l l i n g t o n H M E . 1 9 9 7 . A n a l y s i s o f a c t i n o m y c e t e c o m m u n i t i e s b y s p e c i f i c a m p l i f i c a t i o n o f g e n e s e n c o d i n g 1 6 S r R N A a n d g e l e l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n i n d e n a t u r i n g g r a d i e n t s . A p p l . E n v . M i c r o b i o l . , 6 3 : 3 2 3 3 - 3 2 4 1 . H o l t J G N R , K r i e g P H A , S n e a t h J T , S t a l e y a n d W i l l i a m s S T . 1 9 9 4 . B e r g e y s m a n u a l o f d e t e r m i n a t i v e b a c t e r i o l o g y . W i l l i a m s a n d W i l k i n s . B a l t i m o r e , U S A . 1 - 4 . H u a n g S H , B i n g P , Z h i h u i Y , L i y u a n C a n d L i c h e n g Z . 2 0 0 8 . C h r o m i u m A c c u m u l a t i o n , M i c r o o r g a n i s m P o p u l a t i o n a n d E n z y m e A c t i v i t i e s i n S o i l s a r o u n d C h r o m i u m - C o n t a i n i n g S l a g H e a p o f S t e e l A l l o y F a c t o r y , T r a n s a c t i o n s O f N o n f e r r o u s M e t a l S o c i e t y O f C h i n a . 1 9 : 2 4 1 - 2 4 8 . J a c o b u c c i D F C , O r i a n i M R G , D u r r a n t L R . 2 0 0 9 . R e d u c i n g C O D l e v e l o n o i l y e f f l u e n t b y u t i l i z i n g b i o s u r f a c t a n t - p r o d u c i n g b a c t e r i a . B r a z . A r c h . B i o l . T e c h n o l . , 5 2 : 1 0 3 7 - 1 0 4 2 . J i a n g R , H u a n g S , C h o w T A a n d Y a n g J . 2 0 0 9 . N i t r i c o x i d e r e m o v a l f r o m f l u e g a s w i t h a b i o t r i c k l i n g f i l t e r u s i n g P s e u d o m o n a s p u t i d a . J . H a z a r d . M a t e r . , 1 6 4 : 4 3 2 - 4 4 1 . M i s h r a S , D o b l e M . 2 0 0 8 . N o v a l c h r o m i u m t o l e r a n t m i c r o o r g a n i s m s : i s o l a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n a n d t h e i r b i o r e d u c t i o n c a p a c i t y , E c o t o x i c o l . E n v . S a f e t y 7 1 : 8 7 4 - 8 7 9 . M u k h e r j e e S , D a s P a n d S e n R . 2 0 0 6 . T o w a r d s c o m m e r c i a l p r o d u c t i o n o f m i c r o b i a l s u r f a c t a n t s . T r e n d s B i o t e c h n o l . , 2 4 : 5 0 9 - 5 1 5 . M u l l i g a n C N . 2 0 0 4 . E n v i r o n m e n t a l a p p l i c a t i o n s f o r b i o s u r f a c t a n t s . E n v i r o n . P o l l . , 7 : 3 6 2 - 3 6 6 . M u t h u s a m y K r i s h n a s w a m y , S u b b u c h e t t i a r G o p a l a k r i s h n a n , T h i e n g u n g a l K o c h u p a p p y R a v i a n d P a n c h a k s h a r a m S i v a c h i d a m b a r a m , 2 0 0 8 . B i o s u r f a c t a n t s : P r o p e r t i e s , c o m m e r c i a l p r o d u c t i o n a n d a p p l i c a t i o n . C u r r . S c i . , 9 4 ( 6 ) : 7 3 6 - 7 4 7 . O c h s n e r A . U r s , A n d r e a s K . K o c h , A r m i n F i e c h t e r a n d J a k o b R e i s e r . 1 9 9 4 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a r e g u l a t o r y g e n e a f f e c t i n g r h a m o n o l i p i d b i o s u r f a c t a n t s y n t h e s i s i n P s e u d o m o n o s a e r u g i n o s a . J . B a c t e r i o l . , 1 7 6 ( 7 ) : 2 0 0 4 - 2 0 5 4 . R a m e s h B a l a s u b r a m a n i a n , K u p p u s w a m y K a v i t h a , G o p a l a k r i s h n a n S u r e s h , B a l a k r i s h n a n U s h a r a n i , N a g a i y a R a v i c h a n d r a n a n d G a n e s a n V i j a i y a n s i v a . 2 0 1 0 . S t u d i e s o n D i s t r i b u t i o n o f B i o s u r f a c t a n t P r o d u c i n g B a c t e r i a i n C o n t a m i n a t e d a n d U n d i s t u r b e d S o i l s o f K a n c h i p u r a m . A u s t r a l i a n J . B a s i c A p p l . S c i . , 4 ( 9 ) : 4 4 2 9 - 4 4 3 4 . R e i l i n g H E , T h a n e i - w y s s U , G u e r r a - s a n t o s L H , H i r t R , K a p p e l O a n d F i e c h t e r A . 1 9 8 6 . P i l o t p l a n t p r o d u c t i o n o f r h a m n o l i p i d b i o s u r f a c t n t b y P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a . A p p l . E n v . M i c r o b i o l . , 5 1 ( 5 ) : 9 8 5 - 9 8 9 . R o d r i g u e s L R , T e i x e r i a J A , M e i H C . 2 0 0 6 . O l i v e r i a P h y s i c o c h e m i c a l a n d F u n c t i o n a l C h a r a c t e r i z a t i o n o f a B i o s u r f a c t a n t P r o d u c e d b y L a c t o c o c c u s l a c t i s 5 3 . C o l l o i d s a n d S u r f a c e s B : B i o i n t e r f a c e s 4 9 : 7 9 - 8 6 . S a b e s a n R , D h a n a l a k s h m i A , W i l l i a m A a n d T h a n g a r a j K . 2 0 0 2 . T e x t b o o k o f a l l i e d P h y s i c s . P o p u l a r B o o k D e p o t . S e c o n d R e p r i n t . 6 5 - 6 8 . T a m u r a K , P e t e r s o n D , P e t e r s o n N , S t e c h e r G , N e i M a n d K u m a r S . 2 0 1 1 . M E G A 5 : M o l e c u l a r E v o l u t i o n a r y G e n e t i c s A n a l y s i s u s i n g M a x i m u m L i k e l i h o o d , E v o l u t i o n a r y D i s t a n c e , a n d M a x i m u m P a r s i m o n y M e t h o d s . M o l e c u l a r B i o l . E v o l . ( I n P r e s s ) . X u J , M i l l a r B C , M o o r e J E , M u r p h y K , W e b b H , F o x A J , C a f f e r k e y M a n d C r o w e M J . 2 0 0 3 . E m p l o y m e n t o f b r o a d - r a n g e 1 6 S r R N A P C R t o d e t e c t a e t i o l o g i c a l a g e n t s o f i n f e c t i o n f r o m c l i n i c a l s p e c i m e n s i n p a t i e n t s w i t h a c u t e m e n i n g i t i s r a p i d s e p a r a t i o n o f 1 6 S r R N A P C R a m p l i c o n s w i t h o u t t h e n e e d f o r c l o n i n g . J . A p p l . M i c r o b i o l . , 9 4 : 1 9 7 - 2 0 6 . Y o u s s e f N o h a H , K a t h l e e n E . D u n c a n , D a v i d P . N a g l e , K r i s t e n N . S a v a g e , R o y M . K n a p p a n d M i c h a e l J . M c I n e r n e y , 2 0 0 4 . C o m p a r i s o n o f m e t h o d s t o d e t e c t b i o s u r f a c t a n t p r o d u c t i o n b y d i v e r s e m i c r o o r g a n i s m s . J . M i c r o b i o l . M e t h . , 5 6 ( 3 ) : 3 3 9 - 3 4 7 . 1 4 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 2 : 1 4 0 - 1 4 7 V i j a i y a n s i v a e t a l . , 2 0 1 1