J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A s s e s s m e n t o f t h e i n v i t r o a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f h o n e y o n s o m e c o m m o n h u m a n p a t h o g e n s K e y w o r d s : H o n e y , a n t i b a c t e r i a , a n t i b i o t i c s , m i n i m u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n . A B S T R A C T : T h e a i m o f t h e p r e s e n t s t u d y w a s t o a s s e s s t h e i n v i t r o a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f b e e h o n e y o n c e r t a i n p o t e n t i a l l y p a t h o g e n i c b a c t e r i a l i s o l a t e s . D i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s ( 1 0 . 0 , 2 0 . 0 , 4 0 . 0 , 6 0 . 0 , 8 0 . 0 a n d 1 0 0 . 0 % ) o f h o n e y s a m p l e w e r e c h e c k e d f o r t h e i r a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t i e s , u s i n g d i s c d i f f u s i o n a s s a y , o n s o m e m e d i c a l l y i m p o r t a n t b a c t e r i a i n c l u d i n g E s c h e r i c h i a c o l i , K l e b s i e l l a s p . , S a l m o n e l l a s p . , P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a , E n t e r o b a c t e r s p . , S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s , a n d P r o t e u s s p . T h e m i n i m u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n s ( M I C ) o f t h e h o n e y s a m p l e w e r e d e t e r m i n e d o n t h e s e l e c t e d b a c t e r i a u s i n g a g a r d i l u t i o n t e c h n i q u e . T h e s a m p l e o f h o n e y s h o w e d p r o n o u n c e d b a c t e r i a l i n h i b i t o r y e f f e c t i n v i t r o a t h o n e y c o n c e n t r a t i o n s o f 4 0 % a n d a b o v e o n t h e v a r i o u s t e s t e d b a c t e r i a . N o g r o w t h i n h i b i t i o n e f f e c t w a s o b s e r v e d a t 1 0 % c o n c e n t r a t i o n o f h o n e y . T h e M I C f o r t h e t e s t e d b a c t e r i a r a n g e d b e t w e e n 1 2 . 5 a n d 2 5 . 0 % . T h e M I C f o r K l e b s i e l l a s p . a n d S . a u r e u s w a s 1 2 . 5 % w h i l e f o r P r o t e u s s p . , t h e M I C w a s 2 5 . 0 % . A l l t h e o t h e r t e s t e d b a c t e r i a l i s o l a t e s s h o w e d M I C v a l u e o f 1 5 % . T h e s t u d y s h o w s t h a t h o n e y , l i k e a n t i b i o t i c s , h a s c e r t a i n o r g a n i s m s s e n s i t i v e t o i t , a n d p r o v i d e s a l t e r n a t i v e t h e r a p y a g a i n s t c e r t a i n b a c t e r i a a n d i s a l s o s h o w n t o h a v e a n t i b a c t e r i a l a c t i o n a g a i n s t a b r o a d s p e c t r u m o f b a c t e r i a , b o t h g r a m - p o s i t i v e a n d g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . 1 1 6 - 1 2 1 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 2 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : A n y a n w u C U . I n s t i t u t i o n : D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y U n i v e r s i t y o f N i g e r i a N s u k k a , N i g e r i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : A n y a n w u C U . E m a i l : c h u d i z o m a @ y a h o o . c o m P h o n e N o : 2 3 4 8 0 3 7 7 4 0 1 0 4 W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 2 8 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 1 7 M a y 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 2 6 M a y 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 1 4 J u n 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : A n y a n w u C U . A s s e s s m e n t o f t h e i n v i t r o a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f h o n e y o n s o m e c o m m o n h u m a n p a t h o g e n s . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 2 : 1 1 6 - 1 2 1 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h p a p e r

I N T R O D U C T I O N H o n e y i s a t h i c k s w e e t l i q u i d m a d e b y b e e s f r o m t h e n e c t a r o f f l o w e r s . H o n e y i s e s s e n t i a l l y a h i g h l y c o n c e n t r a t e d w a t e r s o l u t i o n o f t w o s u g a r s , d e x t r o s e a n d l e v u l o s e , w i t h s m a l l a m o u n t s o f a t l e a s t 2 2 o t h e r m o r e c o m p l e x s u g a r s . M a n y o t h e r s u b s t a n c e s a l s o o c c u r i n h o n e y , b u t t h e s u g a r s a r e b y f a r t h e m a j o r c o m p o n e n t s . T h e p r i n c i p a l p h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d b e h a v i o r o f h o n e y a r e d u e t o i t s s u g a r s , b u t t h e m i n o r c o n s t i t u e n t s – s u c h a s f l a v o u r i n g m a t e r i a l s , p i g m e n t s , a c i d s , a n d m i n e r a l s – a r e l a r g e l y r e s p o n s i b l e f o r t h e d i f f e r e n c e s a m o n g i n d i v i d u a l h o n e y t y p e s ( M o l a n , 1 9 9 2 a ) . H o n e y p r o d u c e d b y h o n e y b e e s ( A p i s m e l l i f e r a ) i s o n e o f t h e o l d e s t t r a d i t i o n a l m e d i c i n e s c o n s i d e r e d t o b e i m p o r t a n t i n t h e t r e a t m e n t o f v a r i o u s d i s e a s e s a n d a i l m e n t s i n c l u d i n g g a s t r o i n t e s t i n a l i n f e c t i o n , r e s p i r a t o r y a i l m e n t , w o u n d i n f e c t i o n s a n d o t h e r s . T w o m i l l e n n i a b e f o r e b a c t e r i a w e r e i d e n t i f i e d a s t h e c a u s e o f d i s e a s e , p h y s i c i a n s a t t h e t i m e w e r e a w a r e t h a t c e r t a i n t y p e s o f h o n e y a r e t h e b e s t t h e r a p y f o r p a r t i c u l a r a i l m e n t s a n d i n f e c t i o n s . T h e a b i l i t y o f h o n e y t o k i l l m i c r o o r g a n i s m s h a s b e e n a t t r i b u t e d t o i t s h i g h o s m o t i c e f f e c t , h i g h a c i d i c n a t u r e , h y d r o g e n p e r o x i d e c o n c e n t r a t i o n a n d i t s p h y t o c h e m i c a l n a t u r e , w h i c h i n c l u d e i t s c o n t e n t o f t e t r a c y c l i n e d e r i v a t i v e s , p e r o x i d e s , a m y l o s e , f a t t y a c i d s , p h e n o l s , a s c o r b i c a c i d , t e r p e n e s , b e n z y l a l c o h o l a n d b e n z o i c a c i d ( B o g d a n o v , 1 9 8 9 ; M o l a n , 1 9 9 2 a ) . H o w e v e r , l a r g e v a r i a t i o n s i n t h e i n v i t r o a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f v a r i o u s t y p e s o f h o n e y h a v e b e e n r e p o r t e d a n d t h u s h a m p e r e d i t s a c c e p t a n c e i n m o d e r n m e d i c i n e ( K w a k m a n n , 2 0 0 8 ) . T h e p r o d u c t i o n a n d t y p e o f h o n e y p r o d u c e d b y h o n e y b e e s i s d e p e n d e n t o n t h e n a t u r a l v e g e t a t i v e f l o w e r s b l o o m i n g i n d i f f e r e n t s e a s o n s . T h u s t h e f l o w e r s f r o m w h i c h b e e s g a t h e r n e c t a r t o p r o d u c e h o n e y m a y c o n t r i b u t e t o t h e d i f f e r e n c e i n t h e a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t i e s . M o l a n ( 1 9 9 2 a ) h a d r e p o r t e d t h a t h o n e y f r o m c e r t a i n s p e c i e s o f L e p t o s p e r m u m f l o r a n a t i v e t o A u s t r a l i a a n d N e w Z e a l a n d c o n t a i n s a d d i t i o n a l p h y t o c h e m i c a l c o m p o n e n t s t h a t f u r t h e r e n h a n c e i t s a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y . I t h a s f u r t h e r b e e n r e p o r t e d t h a t p h y s i c a l p r o p e r t y a l o n g w i t h g e o g r a p h i c a l d i s t r i b u t i o n a n d d i f f e r e n t f l o r a l s o u r c e s m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y o f h o n e y ( T a o r m i n a e t a l . , 2 0 0 1 ) . L a b o r a t o r y s t u d i e s a n d c l i n i c a l t r i a l s h a v e s h o w n t h a t h o n e y i s a n e f f e c t i v e b r o a d - s p e c t r u m a n t i m i c r o b i a l a g e n t . H o n e y h a s b e e n r e p o r t e d t o h a v e i n h i b i t o r y e f f e c t o n s e v e r a l b a c t e r i a i n c l u d i n g a e r o b e s a n d a n a e r o b e s , G r a m - p o s i t i v e a n d G r a m - n e g a t i v e a n d i s e f f e c t i v e a g a i n s t m e t h i c i l l i n r e s i s t a n t S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ( M R S A ) , β - h e m o l y t i c s t r e p t o c o c c i a n d v a n c o m y c i n - r e s i s t a n t e n t e r o c o c c i ( V R E ) a s r e p o r t e d b y A l l e n e t a l . ( 2 0 0 0 ) a n d K i n g s l e y ( 2 0 0 1 ) . C l i n i c a l s t u d i e s i n s e v e r a l c o u n t r i e s s h o w e d t h a t t h e r e a r e d i f f e r e n c e s i n t h e s p e c t r u m o f a n t i m i c r o b i a l a c t i o n o f h o n e y ( E f e m , 1 9 8 8 ; C o o p e r a n d M o l a n , 1 9 9 9 ; O b i e t a l . , 1 9 9 4 ) . I t w o u l d b e i m p o r t a n t t o n o t e t h e s e n s i t i v i t y i n d i f f e r e n t p l a c e s , a n d f o r d i f f e r i n g s a m p l e s o f h o n e y . T h i s s h o u l d s e r v e a s a g u i d e t o i t s c l i n i c a l u s e . T h e p r e s e n t s t u d y a i m s t o e v a l u a t e t h e i n v i t r o a n t i m i c r o b i a l e f f e c t o f b e e h o n e y c o l l e c t e d i n N s u k k a , N i g e r i a o n c e r t a i n b a c t e r i a l s p e c i e s i n v o l v e d i n c a u s i n g i n f e c t i o n s i n h u m a n s c o m p a r e d w i t h t h a t o f c e r t a i n a n t i b i o t i c s t h a t a r e c o m m o n l y u s e d i n t h e t r e a t m e n t o f i n f e c t i o n s . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S C o l l e c t i o n o f s a m p l e s o f h o n e y T h e h o n e y s a m p l e u s e d i n t h i s s t u d y w a s c o l l e c t e d f r o m N s u k k a t o w n i n S o u t h e a s t , N i g e r i a . S e v e r a l s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d i n s t e r i l e s c r e w - c a p c o n t a i n e r s a n d i m m e d i a t e l y t r a n s p o r t e d t o t h e l a b o r a t o r y f o r p r o c e s s i n g . P r o c e s s i n g o f s a m p l e s E a c h s a m p l e w a s f i r s t f i l t e r e d w i t h a s t e r i l e m e s h t o r e m o v e d e b r i s . T h e s a m p l e s w e r e c h e c k e d f o r p u r i t y b y s t r e a k i n g o n b l o o d a g a r p l a t e s , a n d i n c u b a t e d o v e r n i g h t . S a m p l e t h a t s h o w e d u n c o n t a m i n a t i o n w a s s t o r e d a t r e f r i g e r a t i o n t e m p e r a t u r e o f a b o u t 4 o C u n t i l u s e d . T h e h o n e y s a m p l e w a s d i l u t e d w i t h s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r t o 1 0 , 2 0 , 4 0 , 6 0 a n d 8 0 % , a n d t h e u n d i l u t e d h o n e y ( 1 0 0 . 0 % ) r e f e r r e d t o a s n e t . B a c t e r i a u s e d T h e b a c t e r i a l s p e c i e s u s e d i n t h i s s t u d y a n d k n o w n t o b e p o t e n t i a l l y p a t h o g e n i c t o h u m a n w e r e o b t a i n e d f r o m t h e c l i n i c a l l a b o r a t o r y o f t h e D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , U n i v e r s i t y o f N i g e r i a , N s u k k a , N i g e r i a . T h e b a c t e r i a l s p e c i e s i n c l u d e E s c h e r i c h i a c o l i , S a l m o n e l l a s p . , P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a , S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s , K l e b s i e l l a s p . , E n t e r o b a c t e r s p . a n d P r o t e u s s p . T w o r e f e r e n c e s t r a i n s , E . c o l i ( A T C C 2 5 9 2 2 ) a n d P . a e r u g i n o s a ( A T C C 2 7 8 5 3 ) w e r e u s e d f o r c o m p a r i s o n . A n t i b a c t e r i a l e v a l u a t i o n T h e i n v i t r o a n t i b a c t e r i a l e v a l u a t i o n o f t h e h o n e y w a s c a r r i e d o u t u s i n g t h e d i s c d i f f u s i o n m e t h o d o f B a u e r e t a l . ( 1 9 6 6 ) . I n t h e d i s c d i f f u s i o n a p p r o a c h , s u r f a c e o f n u t r i e n t a g a r ( L a b M ) p l a t e w a s u n i f o r m l y i n o c u l a t e d i n i n d i v i d u a l P e t r i d i s h e s 1 1 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 2 : 1 1 6 - 1 2 1 A n y a n w u . , 2 0 1 1

w i t h o v e r n i g h t s t o c k c u l t u r e o f e a c h o f t h e b a c t e r i a l s p e c i e s p r e p a r e d i n n u t r i e n t b r o t h . T h e u s e d b a c t e r i a w e r e a d j u s t e d t o 1 0 5 c f u / m l w i t h s t e r i l e s a l i n e a n d i n o c u l a t e d o n t o t h e a g a r m e d i u m . S t e r i l e W h a t m a n N o 1 f i l t e r p a p e r d i s c s ( W h a t m a n I n t e r n a t i o n a l L t d . , U K ) , 6 m m i n d i a m e t e r w e r e u s e d . T h e f i l t e r p a p e r d i s c s w e r e s o a k e d i n t h e d i f f e r e n t h o n e y d i l u t i o n s o r n e t h o n e y , d r i e d a t r o o m t e m p e r a t u r e , c a r e f u l l y a n d a s e p t i c a l l y p l a c e d i n t o t h e P e t r i d i s h e s s e e d e d w i t h i n o c u l a . S t a n d a r d a n t i b i o t i c d i s c s o f c h l o r a m p h e n i c o l a n d t e t r a c y c l i n e w e r e u s e d o n t h e i n o c u l a t e d p l a t e s f o r c o m p a r i s o n . T h e a n t i b i o t i c d i s c s u s e d w e r e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e d i s c s . A d i s c w i t h o u t h o n e y i m p r e g n a t i o n w a s u s e d a s c o n t r o l . P l a t e s w e r e k e p t a t 4 o C f o r f o u r h o u r s t o p r o v i d e s u f f i c i e n t t i m e f o r t h e t e s t m a t e r i a l t o d i f f u s e i n t o t h e m e d i u m a n d f i n a l l y i n c u b a t e d a t 3 7 o C f o r 2 4 h o u r s . T h e d i a m e t e r o f t h e z o n e o f i n h i b i t i o n p r o d u c e d a r o u n d t h e d i s c s w a s m e a s u r e d w i t h t r a n s p a r e n t r u l e r a s i n d e x o f a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f h o n e y o r s t a n d a r d a n t i b i o t i c . T h e s i z e o f t h e i n h i b i t i o n z o n e f u r t h e r r e p r e s e n t e d a q u a n t i t a t i v e m e a s u r e o f a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f t h e t e s t m a t e r i a l . A l l e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n d u p l i c a t e a n d t h e z o n e o f i n h i b i t i o n w a s m e a s u r e d t w i c e f o r e a c h h o n e y d i l u t i o n a n d n e t p r e p a r a t i o n . D e t e r m i n a t i o n o f m i n i m u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n ( M I C ) o f h o n e y T h e M I C o f t h e h o n e y w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e a g a r d i l u t i o n t e c h n i q u e ( G a i l l a n d W a s h i n g t o n , 1 9 9 5 ) w h i c h w a s d o n e b y m i x i n g m o l t e n n u t r i e n t a g a r w i t h h o n e y . K n o w n v o l u m e s ( m l ) o f h o n e y , n a m e l y , 2 . 0 , 2 . 5 , 3 . 0 , 4 . 0 a n d 5 . 0 p e r 2 0 m l o f t h e m i x t u r e w e r e u s e d . T h e s e w e r e e q u i v a l e n t t o h o n e y c o n c e n t r a t i o n s ( % , v / v ) o f 1 0 . 0 , 1 2 . 5 , 1 5 . 0 , 2 0 . 0 a n d 2 5 . 0 , r e s p e c t i v e l y . T h e M I C v a l u e s w e r e d e t e r m i n e d f o r t h e h o n e y a g a i n s t t h e d i f f e r e n t b a c t e r i a l i s o l a t e s , n a m e l y , E n t e r o b a c t e r s p . , E s c h e r i c h i a c o l i , S a l m o n e l l a s p . , P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a , S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s , P r o t e u s s p . , K l e b s i e l l a s p . a n d t h e c o n t r o l s t r a i n s . O v e r n i g h t b r o t h c u l t u r e o f e a c h b a c t e r i a l s t r a i n i n n u t r i e n t b r o t h w a s p r e p a r e d . T h e t u r b i d i t y , w h i c h w a s v i s u a l l y c o m p a r e d w i t h M c F a r l a n d 0 . 5 s t a n d a r d w h i c h c o r r e s p o n d s a p p r o x i m a t e l y t o a h o m o g e n e o u s c e l l s u s p e n s i o n o f 1 . 5 × 1 0 8 c f u / m l , w a s a d j u s t e d t o 1 0 4 c f u / m l . T h e t e s t p l a t e s w h i c h c o n t a i n e d m e d i a m i x e d w i t h h o n e y w e r e i n o c l a t e d w i t h t h e a d j u s t e d c u l t u r e b r o t h a n d i n c u b a t e d a t 3 7 o C f o r 2 4 h r s . A g a r p l a t e s w i t h o u t h o n e y w e r e s i m i l a r l y i n o c u l a t e d t o s e r v e a s c o n t r o l . T h e l o w e s t c o n c e n t r a t i o n o f h o n e y t h a t c o m p l e t e l y i n h i b i t e d v i s i b l e b a c t e r i a l g r o w t h w a s t a k e n a s t h e m i n i m u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n o f t h e h o n e y . R E S U L T S T h e r e s u l t s o f t h e i n v i t r o a n t i b a c t e r i a l e f f e c t s o f h o n e y a g a i n s t t h e d i f f e r e n t b a c t e r i a t e s t e d a r e s h o w n i n T a b l e I . T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t h o n e y e x h i b i t e d a f a i r l y g o o d a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y a g a i n s t b o t h G r a m - n e g a t i v e a n d G r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a . T h e h o n e y s h o w e d g r e a t e r a n t i b a c t e r i a l e f f e c t a g a i n s t E . c o l i , P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a a n d S a l m o n e l l a s p . , t h a n t h e o t h e r t e s t e d b a c t e r i a . P r o t e u s s p . w a s t h e m o s t r e s i s t a n t i s o l a t e t e s t e d a s J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 2 : 1 1 6 - 1 2 1 1 1 8 A n y a n w u . , 2 0 1 1 T a b l e I . A n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f h o n e y C h l – c h l o r a m p h e n i c o l ; T e t - t e t r a c y c l i n e