J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y E x p l o r a t i o n o f n e w e r s u b s t r a t e f o r f i b r i n o l y t i c e n z y m e p r o d u c t i o n b y s o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o n u s i n g P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m S G A D 1 2 K e y w o r d s : R i c e c h a f f , F i b r i n o l y t i c e n z y m e , S o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o n , P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m S G A D 1 2 . A B S T R A C T : R i c e c h a f f - a p o l i s h e d s u b s t a n c e e x t r a c t e d f r o m O r y z a s a t i v a L . c v . D e v a m a l l i g e w a s u s e d a s a n o v e l s u b s t r a t e f o r t h e p r o d u c t i o n o f t h e f i b r i n o l y t i c e n z y m e . T h i s v i t a l e n z y m e i s u s e d i n t h r o m b o l y t i c t h e r a p y , a s a c l o t b u s t e r . T h e p r o d u c t i o n w a s d o n e b y s o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o n o f r i c e c h a f f b y P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m S G A D 1 2 , l o c a l l y i s o l a t e d f r o m v e g e t a b l e m a r k e t s . O f t h e 2 8 s t r a i n s i s o l a t e d a n d s c r e e n e d , P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m S G A D 1 2 w a s f o u n d t o g i v e a n i n h i b i t i o n z o n e g r e a t e r t h a n 2 m m . H e n c e i t w a s i d e n t i f i e d a s t h e p o t e n t i a l o r g a n i s m s h o w i n g m a x i m u m f i b r i n o l y t i c a c t i v i t y u n d e r s p e c i f i e d c u l t u r e c o n d i t i o n s . A c t i v i t y o p t i m i z a t i o n w a s d o n e u n d e r t h e p a r a m e t e r s : T i m e , I n o c u l u m r a t i o , M o i s t u r e , p a r t i c l e s i z e . T h e f i b r i n o l y t i c a c t i v i t y w a s f a v o u r a b l y m a x i m i z e d a t 1 0 4 h r s , 7 % ( v / v ) i n o c u l u m r a t i o , 3 5 - 4 5 % ( v / w ) m o i s t u r e c o n t e n t a n d 5 0 0 µ m p a r t i c l e s i z e . 2 4 2 - 2 4 5 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 4 © F i c u s P r e s s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p r e s s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : G o p i n a t h S M , S u n e e t h a T B , A s h w i n i p a t i l G M . I n s t i t u t i o n : D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , A c h a r y a I n s t i t u t e o f T e c h n o l o g y , S o l d e v a n h a l l i , B e n g a l u r u - 5 6 0 0 9 0 , K a r n a t a k a , I n d i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : G o p i n a t h S M E m a i l : g o p i n a t h @ a c h a r y a . a c . i n W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 2 3 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 9 M a y 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 1 3 M a y 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 0 3 A u g 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : G o p i n a t h S M , S u n e e t h a T B , A s h w i n i p a t i l G M . E x p l o r a t i o n o f n e w e r s u b s t r a t e f o r f i b r i n o l y t i c e n z y m e p r o d u c t i o n b y s o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o n u s i n g P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m S G A D 1 2 . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 4 2 - 2 4 5 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h p a p e r

I N T R O D U C T I O N N o w - a - d a y s t h r o m b o l y t i c d i s e a s e s a r e r e s p o n s i b l e f o r s i g n i f i c a n t i n c a p a c i t a t i o n a n d m o r b i d i t y . F i b r i n o l y t i c e n z y m e s h a v e a p p a r e n t s i g n i f i c a n c e i n t h r o m b o l y t i c t h e r a p y i n h u m a n b e i n g ( H a b e r e t a l , 1 9 8 9 ) . D e s p i t e m o s t o f t h e i r w i d e s p r e a d u s e , t h e c u r r e n t l y a v a i l a b l e f i b r i n o l y t i c e n z y m e s h a v e a n u m b e r o f s i g n i f i c a n t l i m i t a t i o n s ( C o l l e n a n d L i j n e n , 1 9 9 1 ) . T h e r e f o r e g r e a t a t t e n t i o n h a s b e e n d i r e c t e d t o w a r d s a s e a r c h o f t h r o m b o l y t i c a g e n t s o f v a r i o u s o r g i n s , p a r t i c u l a r l y t h r o u g h m i c r o b i a l a c t i v i t y . F i b r i n o l y t i c e n z y m e s o c c u r i n b a c t e r i a , e a r t h w o r m , a n d s n a k e v e n o m , f r o m f e r m e n t e d f o o d s ( C o l l e n a n d L e j n i n , 1 9 9 3 ) ( S u m i e t a l , 1 9 8 7 ) , b u t u p t o n o w t h e r e h a v e b e e n v e r y f e w e v i d e n c e s f o r p r o d u c t i o n o f f i b r i n o l y t i c e n z y m e f r o m f u n g i ( S . A . E l - A a s s a r e t a l , 1 9 9 0 ) ( S u n T a o e t a l , 1 9 9 7 ) . S o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o n ( S S F ) p r o c e s s i n d i c a t e s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n c o m p a r i s i o n w i t h s u b m e r g e d s t a t e f e r m e n t a t i o n ( S M F ) . I t s m a i n a d v a n t a g e i s t h a t i t i s a s i m p l e t e c h n i q u e , i t u t i l i z e s l e s s a m o u n t o f w a t e r , a n d i t h a s a l o w o p e r a t i n g c o s t a n d h i g h p r o d u c t i v i t y . F u n g i h a v e b e e n w i d e l y u t i l i z e d b y S S F i n t h e p r o d u c t i o n o f e n z y m e ( L o n s a n e e t a l , 1 9 9 2 ) ( P a n d e y , 1 9 9 2 ) . T h i s s t u d y r e p o r t s t h e p r o d u c t i o n o f f i b r i n o l y t i c e n z y m e b y P e n i c i l l i n c h r y s o g e n u m S G A D 1 2 , l o c a l l y i s o l a t e d f r o m v e g e t a b l e m a r k e t s a n d n e w s u b s t r a t e r i c e c h a f f e x t r a c t e d f r o m O r y z a s a t i v a L . c v . D e v a m a l l i g e c o l l e c t e d f r o m l o c a l r e g i o n s o f K a r n a t a k a , I n d i a . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m S G A D 1 2 , a f i b r i n o l y t i c e n z y m e p r o d u c e r w a s i s o l a t e d f r o m s o i l o f v e g e t a b l e m a r k e t a n d w a s i d e n t i f i e d . I t w a s f o u n d t o p r o d u c e f i b r i n o l y t i c e n z y m e o n f i b r i n p l a t e . T h i s p o t e n t i a l t r a i t w a s u s e d f o r f u r t h e r p r o d u c t i o n o n s o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o n . C u l t u r e w a s m a i n t a i n e d o n C z e p e k D o x A g a r a t 4 ° C a n d s u b c u l t u r e d f o r t n i g h t l y . T h e b a s i c m e d i u m c o n t a i n e d r i c e c h a f f ( v a r i e t y : D e v a m a l l i g e ) ( 2 0 g ) , K H 2 P O 4 ( 0 . 5 g ) , M g S O 4 . 7 H 2 O ( 0 . 5 g ) , M n S O 4 . 7 H 2 O ( 0 . 0 0 1 g ) , Z n S O 4 . 7 H 2 O ( 0 . 0 0 2 g ) , F e S O 4 . 7 H 2 O ( 0 . 0 0 0 5 g ) a n d 9 m l w a t e r . A f t e r a u t o c l a v i n g a t 1 2 1 ˚ C f o r 3 0 m i n u t e s , t h e m e d i u m w a s a d j u s t e d t o a m o i s t u r e c o n t e n t o f 4 5 % ( v / w ) a n d i n o c u l u m s i z e o f 7 % ( v / v ) . I t w a s t h e n i n o c u l a t e d w i t h s p o r e s u s p e n s i o n o f 1 0 6 s p o r e s / m l a n d i n c u b a t e d a t 2 8 ˚ C . E n z y m e E x t r a c t i o n T h e f r e s h m o l d y p i t h i n e a c h f l a s k w a s s o a k e d i n d i s t i l l e d w a t e r a n d i n c u b a t e d i n a r o t a r y s h a k e r a t 1 3 0 r . p . m a t 2 8 ˚ C f o r 1 h o u r . T h e e x t r a c t s w e r e o b t a i n e d b y f i l t e r i n g t h r o u g h f i l t e r p a p e r . F o r 1 g o f d r y s u b s t r a t e t a k e n 2 . 8 m l o f f i l t r a t e w a s r e c o v e r e d . A s s a y m e t h o d F i b r i n p l a t e a n a l y s i s m e t h o d T h e o r i g i n a l f i b r i n p l a t e m e t h o d ( A s t r u p a n d M u l l e r t z , 1 9 5 2 ) w i t h s l i g h t m o d i f i c a t i o n w a s u s e d f o r m e a s u r e m e n t o f t h e f i b r i n o l y t i c a c t i v i t y o f t h e t e s t p r e p a r a t i o n a l o n g w i t h s t r e p t o k i n a s e . P e t r i d i s h e s c o n t a i n i n g 9 m l o f 0 . 2 % f i b r i n o g e n s o l u t i o n ( p H 7 . 8 ) w e r e p l a c e d o n a h o r i z o n t a l g l a s s p l a t e . T o e a c h o f t h e s e P e t r i d i s h e s , 0 . 2 m l o f p l a s m i n o g e n ( 1 0 u n i t s ) w a s a l s o a d d e d a n d m i x e d w e l l . C l o t t i n g w a s i n d u c e d b y t h e a d d i t i o n o f 0 . 2 m l o f t h r o m b i n s o l u t i o n ( 2 0 u n i t s ) . I n o r d e r t o s p e e d u p t h e c l o t t i n g p r o c e s s , t h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 2 8 ˚ C f o r 2 0 m i n s . P l a t e s w e r e p r e p a r e d a f r e s h e v e r y t i m e . K n o w n q u a n t i t i e s o f t h e e n z y m e s o l u t i o n a n d s t a n d a r d s w e r e p l a c e d a s s m a l l d r o p l e t s o n t h e s u r f a c e o f t h e f i b r i n c l o t . T h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 2 8 ˚ C f o r 2 h a n d v i s u a l l y i n s p e c t e d f o r l i q u e f a c t i o n . T h e a r e a o f t h e d i g e s t e d f i b r i n w a s c o n s i d e r e d a s a q u a n t i t a t i v e m e a s u r e o f t h e f i b r i n o l y t i c a c t i v i t y o f t h e e n z y m e . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N E n z y m e p r o d u c t i o n p r o f i l e T i m e c o u r s e G o o d f u n g a l g r o w t h w a s s u p p o r t e d b y r i c e c h a f f . T h e s p o r e s g e r m i n a t e d w i t h i n 2 0 h , g i v i n g r i s e t o m y c e l i u m f o r m a t i o n , w h o s e d e n s i t y w a s s e e n t o i n c r e a s e w i t h t i m e . V i s u a l e x a m i n a t i o n s h o w e d t h a t t h e s u b s t r a t e w a s f u l l y i m p r e g n a t e d 2 4 3 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 4 2 - 2 4 5 G o p i n a t h e t a l . , 2 0 1 1 - 1 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 0 1 6 3 2 4 8 6 4 8 0 9 6 1 1 2 T i m e ( h o u r s ) F i r i n o l y t i c a c t i v i t y ( I U / m l ) F i g . 1 . T i m e c o u r s e o f e n z y m e p r o d u c t i o n b y P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m S G A D 1 2 o n r i c e c h a f f ( v a r i e t y : D e v a m a l l i g e ) . W i t h f e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r e 2 8 ˚ C , I n o c u l u m s s i z e : 7 % v / v . M o i s t u r e l e v e l : 4 5 % , P a r t i c l e s i z e : m i x t u r e o f s i z e s

w i t h m y c e l i u m i n a b o u t 4 0 h w h i l e t h e u n i n n o c u l a t e d c o n t r o l p l a t e s h o w e d n o d e t e c t a b l e c h a n g e . D u r i n g i n i t i a l 2 4 h n o f i b r i n o l y t i c a c t i v i t y w a s s e e n , t h e r e a f t e r t h e e n z y m e a c t i v i t y i n c r e a s e d r e a c h i n g a m a x i m u m a t 1 0 4 h . W i t h f u r t h e r i n c u b a t i o n t h e e n z y m e a c t i v i t y d e c r e a s e d . E f f e c t o f I n o c u l u m R a t i o : W h i l e o p t i m i z a t i o n f o r i n o c u l u m r a t i o i t w a s f o u n d t h a t 7 % t o 1 4 % ( v / v ) ( b a s e d o n t h e v o l u m e o f m i n e r a l s o l u t i o n ) e l i c i t e d t h e b e s t e n z y m e a c t i v i t y , w i t h 7 % ( v / v ) , a s a d o p t e d f o r t h i s e x p e r i m e n t , g i v i n g t h e m a x i m u m r e s u l t ( f i g 2 ) . A n y i n o c u l u m s i z e b e y o n d t h e o p t i m a l r a n g e s h o w e d l o w e r a c t i v i t y . A n i n f e r e n c e c a n b e d r a w n t h a t l a r g e r i n o c u l u m s i z e s c o n t a i n i n g m o r e a m o u n t o f w a t e r l e d t o d e c r e a s e i n t h e e n z y m e a c t i v i t y . E f f e c t o f m o i s t u r e l e v e l : W a t e r h a s a p r o f o u n d e f f e c t o n p r o d u c t i v i t y a n d h e n c e u s e d i n l i m i t e d a m o u n t i n s o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o n ( L o n s a n e e t a l , 1 9 9 2 ) . M o i s t u r e l e v e l b e t w e e n 3 5 % - 4 5 % ( v / w ) ( f i g 3 ) r e s u l t s i n t h e m a x i m u m e n z y m e p r o d u c t i o n . A n y v a l u e b e y o n d t h i s w a s u n a b l e t o g i v e i n c r e a s e i n p r o d u c t i o n . A c o n c l u s i o n c a n b e d r a w n t h a t l o w e r m o i s t u r e l e v e l l e a d s t o d r y c u l t u r e , s p a r s e g r o w t h a n d h e n c e r e d u c e d p r o d u c t i o n . H i g h e r m o i s t u r e c o n c e n t r a t i o n a l s o c r e a t e s a n u n s u i t a b l e e n v i r o n m e n t f o r s o l i d m y c e l i u m g r o w t h a n d h y p h a l d i f f u s i o n , l e a d i n g t o l e s s p r o d u c t i o n o f e n z y m e . E f f e c t o f s u b s t r a t e p a r t i c l e s i z e : T h e e f f e c t o f s p e c i f i c s u r f a c e a r e a i s o f h i g h i m p o r t a n c e i n s o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o n . M a x i m u m p r o d u c t i o n w a s o b t a i n e d a t a p a r t i c l e s i z e o f 5 0 0 µ m ( f i g 4 ) . T h r o u g h v i s u a l o b s e r v a t i o n i t w a s i n f e r r e d t h a t l a r g e r p a r t i c l e s i z e p r o v i d e d l e s s s u r f a c e a r e a h e n c e p r o d u c t i v i t y w a s l e s s . W h e r e a s s i g n i f i c a n t l y s m a l l e r p a r t i c l e s t h o u g h g a v e l a r g e s u r f a c e a r e a b u t t h e p o r o s i t y w a s d e c r e a s e d t o a n e x t e n t t h a t t h e f i l a m e n t o u s f u n g i c o u l d n o t r e a c h d e e p i n s i d e t o t h e s u b s t r a t e p a r t i c l e s l e a d i n g t o d e c r e a s e i n p r o d u c t i o n . C O N C L U S I O N T h e a b o v e w o r k i n d i c a t e s t h a t R i c e c h a f f ( v a r i e t y : D e v a m a l l i g e ) c a n b e u s e d a s a p o t e n t i a l s u b s t r a t e f o r p r o d u c t i o n o f e c o n o m i c a l l y i m p o r t a n t f i b r i n o l y t i c e n z y m e w i t h P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m S G A D 1 2 . T h i s s u b s t r a t e i s e a s i l y a v a i l a b l e a n d e c o n o m i c a l l y f e a s i b l e . P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m S G A D 1 2 w a s i d e n t i f i e d a s t h e p o t e n t i a l o r g a n i s m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 4 : 2 4 2 - 2 4 5 2 4 4 G o p i n a t h e t a l . , 2 0 1 1 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 2 7 1 2 1 6 2 0 2 4 2 8 I n o c u l u m r a t i o ( % v / v ) F i b r i n o l y t i c a c t i v i t y ( I U / m l ) F i g . 2 . E f f e c t o f i n o c u l u m s i z e o n p r o d u c t i o n b y P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m S G A D 1 2 o n r i c e c h a f f . ( v a r i e t y : D e v a m a l l i g e ) F e r m e n t a t i o n t i m e : 1 0 4 h o u r s . T e m p e r a t u r e : 2 8 ˚ C . P a r t i c l e s i z e : M i x t u r e o f d i f f e r e n t s i z e s . - 1 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 2 0 2 2 2 4 2 8 3 0 3 4 3 8 4 2 4 5 5 0 5 4 5 8 M i o s t u r e C o n t e n t ( % v / w ) F i b r i n o l y t i c A c t i v i t y ( I U / m l ) F i g . 3 . E f f e c t o f m o i s t u r e l e v e l o n t h e p r o d u c t i v i t y b y P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m S G A D 1 2 o n R i c e c h a f f ( v a r i e t y : D e v a m a l l i g e ) . F e r m e n t a t i o n t i m e : 1 0 4 h o u r s . T e m p e r a t u r e : 2 8 ˚ C . P a r t i c l e s i z e : M i x t u r e o f a l l s i z e s . 0 2 0 4 0 6 0 8 0 7 5 1 0 0 1 5 0 5 0 0 1 0 0 0 > 1 0 0 0 P a r t i c l e s i z e ( µ m ) F i b r i n o l y t i c a c t i v i t y ( I U / m l ) F i g . 4 . E f f e c t o f s u b s t r a t e p a r t i c l e s i z e o n p r o d u c t i o n b y P e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m S G A D 1 2 . F e r m e n t a t i o n t i m e : 1 0 4 h o u r s , t e m p e r a t u r e : i n o c u l u m s i z e - 7 % ( v / v ) , m o i s t u r e c o n t e n t 4 5 % ( v / w ) .