J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y C o m p a r i s o n o f d i f f e r e n t p a r a m e t e r s o f i n v a s i v e a n d n o n i n v a s i v e s a m p l i n g m e t h o d s f o r m i c r o s a t e l l i t e g e n o t y p i n g : a c a s e s t u d y f r o m R e d J u n g l e f o w l a n d i t s a p p l i c a t i o n f o r o t h e r G a l l i f o r m e s K e y w o r d s : I n v a s i v e a n d n o n - i n v a s i v e s a m p l i n g , f e a t h e r s , g e n o t y p i n g a n d R e d J u n g l e f o w l . A B S T R A C T : I n s t u d i e s d e a l i n g w i t h g e n e t i c a n d d i s e a s e p r o g n o s i s , b i o l o g i c a l s a m p l i n g i s a p r e r e q u i s i t e . E a r l i e r , b l o o d a n d m u s c l e s a m p l e s w e r e t a k e n a f t e r l i v e c a p t u r e s . T h e s e i n v a s i v e p r o c e d u r e s a r e o f c o n s i d e r a b l e r i s k w h e n s a m p l i n g e n d a n g e r e d s p e c i e s . T h e r e f o r e , n o n i n v a s i v e s a m p l e s l i k e s h e d f e a t h e r s / h a i r s , f a e c e s a n d h a t c h e d o r p r e d a t e d e g g s h e l l s a r e t h e a l t e r n a t i v e s o u r c e f o r g e n e t i c s t u d y . W e c o l l e c t e d 1 8 R e d J u n g l e f o w l f e a t h e r s a m p l e s ( p l u c k e d f e a t h e r s n = 6 ; s h e d f e a t h e r s n = 1 2 ) a c r o s s i t s n o r t h w e s t e r n d i s t r i b u t i o n r a n g e i n I n d i a . T h e D N A y i e l d w a s c o m p a r e d w i t h o t h e r s a m p l e t y p e s i . e . b l o o d , e g g s h e l l a n d f a e c e s ( n = 6 f o r e a c h s a m p l e t y p e ) . W e f o u n d a g r a d i e n t i n D N A y i e l d a s b l o o d ( 7 7 0 µ g / m l ) > p l u c k e d f e a t h e r s > s h e d f e a t h e r s > e g g s h e l l = f a e c e s ( 3 0 µ g / m l ) . D N A e x t r a c t s f r o m f e a t h e r s w e r e a m p l i f i e d f o r f o u r m i c r o s a t e l l i t e l o c i . T h r e e s a m p l e s ( 1 7 % ) f o r a l l 4 m i c r o s a t e l l i t e l o c i , f o u r s a m p l e s ( 2 2 % ) f o r 3 a n d 2 l o c i e a c h , a n d s e v e n s a m p l e s ( 3 9 % ) f o r 1 l o c u s w e r e s u c c e s s f u l l y g e n o t y p e d . W e f o u n d t h a t t h e s u c c e s s f u l a m p l i f i c a t i o n o f m u l t i l o c u s g e n o t y p e s w e r e d e p e n d a n t o n t h e c o n d i t i o n o f t h e s t a r t i n g m a t e r i a l a n d t h e t y p e o f s a m p l e . T h e r e a r e f e w s t u d i e s t h a t h a v e c o m p a r e d t h e q u a l i t y a n d q u a n t i t y o f D N A b e i n g p r o d u c e d t h r o u g h v a r y i n g d e g r e e o f i n v a s i v e n e s s . N o n e h a v e c o n s i d e r e d e f f o r t ( t i m e ) a n d t h e c o s t i n v o l v e d i n p r o c u r i n g t h e s a m p l e s f r o m f i e l d a n d p r o c e s s i n g s a m p l e s i n l a b . W e s c a l e d a l l t h e a s p e c t s o f c o s t a n d e f f o r t s f r o m 1 ( l o w ) t o 1 0 ( h i g h ) a n d h e r e p r e s e n t i n g a c o m p a r a t i v e a n a l y s i s f o r t h e e f f i c a c y o f i n v a s i v e a n d n o n - i n v a s i v e s a m p l i n g m e t h o d s . 3 8 - 4 3 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 1 © F i c u s P r e s s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p r e s s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : M u k e s h 1 , 2 , M e r w y n F e r n a n d e s 1 , M a n d h a n R P 2 a n d S a t h y a k u m a r S 1 . I n s t i t u t i o n : 1 . W i l d l i f e I n s t i t u t e o f I n d i a , P . O . B o x 1 8 , C h a n d r a b a n i , D e h r a d u n - 2 4 8 0 0 1 , U t t a r a k h a n d , I n d i a . 2 . D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , K u r u k s h e t r a U n i v e r s i t y , K u r u k s h e t r a - 1 3 6 1 1 9 , H a r y a n a , I n d i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : S a t h y a k u m a r S E m a i l : s s k @ w i i . g o v . i n W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 1 7 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 6 M a y 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 1 1 M a y 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 1 8 M a y 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : M u k e s h , M e r w y n F e r n a n d e s , M a n d h a n R P a n d S a t h y a k u m a r S . C o m p a r i s o n o f d i f f e r e n t p a r a m e t e r s o f i n v a s i v e a n d n o n i n v a s i v e s a m p l i n g m e t h o d s f o r m i c r o s a t e l l i t e g e n o t y p i n g : a c a s e s t u d y f r o m R e d J u n g l e f o w l a n d i t s a p p l i c a t i o n f o r o t h e r G a l l i f o r m e s . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 1 : 3 8 - 4 3 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h p a p e r

J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y I N T R O D U C T I O N R e d J u n g l e f o w l ( R J F ) [ G a l l u s g a l l u s ] i s a c o m m o n p h e a s a n t s p e c i e s w i d e l y d i s t r i b u t e d i n a v a r i e t y o f h a b i t a t s w i t h i n I n d i a ( A l i a n d R i p l e y , 1 9 8 3 ) . T h e y a r e g r o u n d d w e l l i n g a n d n e s t i n g b i r d s p r e f e r r i n g a m o s a i c o f h a b i t a t s w i t h g o o d u n d e r c o v e r , w h e r e t h e y p r e f e r t o b r e e d d u r i n g t h e s u m m e r m o n t h s f r o m M a r c h t o J u n e ( J o h n s g a r d , 1 9 8 6 ) . T h e R J F i s w i d e l y d i s t r i b u t e d a n d i t s f i v e s u b s p e c i e s a r e s p r e a d f r o m t h e I n d i a n s u b c o n t i n e n t e a s t w a r d s a c r o s s M y a n m a r , S o u t h C h i n a , I n d o n e s i a t o J a v a . I n I n d i a , t w o s u b - s p e c i e s o c c u r , t h e t y p e s p e c i m e n a r e G a l l u s g a l l u s m u r g h i i a n d G a l l u s g a l l u s s p a d i c e u s ( A l i a n d R i p l e y , 1 9 8 3 ; F e r n a n d e s e t a l . , 2 0 0 8 a n d 2 0 0 9 ) . W h i l e t h e f o r m e r i s f o u n d i n t h e n o r t h a n d c e n t r a l p a r t o f I n d i a , e x t e n d i n g e a s t w a r d s t o O r i s s a a n d W e s t B e n g a l , t h e l a t t e r i s c o n f i n e d t o t h e n o r t h e a s t e r n p a r t s o f I n d i a . T h e s p e c i e s i s p r e s e n t i n 2 0 5 D i s t r i c t s i n 2 1 r a n g e s t a t e s i n I n d i a . O f t h e 2 5 5 P A s t h a t o c c u r w i t h i n t h e R J F d i s t r i b u t i o n r a n g e i n I n d i a , 1 9 0 P A s ( 3 1 N P s a n d 1 5 9 W S s ) h a v e r e p o r t e d p r e s e n c e i n t h e i r a r e a . T h e r e w e r e c o n c e r n s r e g a r d i n g i s s u e s o f h y b r i d i s a t i o n o f w i l d R J F w i t h d o m e s t i c c h i c k e n , l e a d i n g t o g e n e t i c e n d a n g e r m e n t o f t h e s p e c i e s ( B r i s b i n , 1 9 9 5 ) . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e s e c o n c e r n s , w e h a v e b e e n c o l l e c t i n g d i f f e r e n t s a m p l e t y p e s t h r o u g h v a r i o u s m e t h o d s a n d e x t r a c t i n g g e n o m i c D N A ( g D N A ) . L e s s i n v a s i v e m e t h o d s s u c h a s p l u c k e d f e a t h e r ( T a b e r l e t a n d B o u v e t , 1 9 9 1 a n d F i o n a e t a l . , 2 0 0 8 ) a n d n o n i n v a s i v e m e t h o d s w h i c h u s e f a e c a l d r o p p i n g s a n d e g g s h e l l s h a v e i n c r e a s e d o v e r t i m e ( S e g e l b a c h e r e t a l . , 2 0 0 1 a n d B u s h e t a l . , 2 0 0 5 ) . T h o u g h , t h e r e i s c o n s t a n t l i m i t a t i o n w i t h t h e D N A y i e l d w i t h t h e s e s a m p l e t y p e s b u t a r e i m p o r t a n c e a s b e i n g a v i t a l s o u r c e o f g e n o m i c D N A . E a r l i e r , B u s h e t a l . , ( 2 0 0 5 ) h a s i n v e s t i g a t e d t h e q u a l i t y a n d q u a n t i t y o f D N A b e i n g e x t r a c t e d t h r o u g h v a r i o u s d e g r e e o f i n v a s i v e n e s s i n t e m p e r a t e r e g i o n b u t t h e r e a r e n o s t u d i e s w i t h i n t h e t r o p i c a l s y s t e m . T h e r e f o r e , w e h a d c o l l e c t e d d i f f e r e n t s a m p l e t y p e s u s i n g v a r i o u s m e t h o d s o f i n v a s i v e a n d n o n - i n v a s i v e s a m p l i n g t e c h n i q u e s a n d c o m p a r e d t h e m f o r s o m e e s s e n t i a l p a r a m e t e r s v i z . e f f o r t a n d c o s t i n v o l v e d i n g e t t i n g s a m p l e s f r o m f i e l d a n d p r o c e s s i n g t h e m i n l a b a n d y i e l d o f D N A f r o m e a c h s a m p l e t y p e . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S S a m p l e c o l l e c t i o n a n d D N A e x t r a c t i o n W e s a m p l e d s i x s i t e s w i t h i n t h e n o r t h w e s t e r n d i s t r i b u t i o n r a n g e o f R J F f r o m F e b r u a r y t o M a y 2 0 0 8 i n t h e S t a t e s o f J a m m u a n d K a s h m i r ( n = 2 ) , H i m a c h a l P r a d e s h ( n = 1 ) , H a r y a n a ( n = 1 ) a n d U t t a r a k h a n d ( n = 2 ) . L i v e t r a p p i n g w a s a t t e m p t e d u s i n g l e g - h o l d n o o s e ( n = 1 0 ) ( B u b , 1 9 9 1 a n d R a m e s h e t a l . , 2 0 0 8 ) i n c o m b i n a t i o n w i t h f a l l n e t ( n = 2 ) . F r o m t h e l i v e t r a p p e d b i r d , b l o o d w a s d r a w n f r o m b r a c h i a l v e i n ( n = 6 ) a n d s t o r e d i n D N A z o l B D ( M a c k e y e t a l . , 1 9 9 6 ) . A s i n g l e f e a t h e r w a s p l u c k e d ( n = 6 ) a n d p r e s e r v e d i n 7 0 % e t h a n o l ( w w w . g a l l u s . f o r e s t r y . u g a . e d u ) . S h e d f e a t h e r s ( n = 1 2 ) o f R J F t h a t w e r e c o l l e c t e d d u r i n g f i e l d s u r v e y s w e r e s t o r e d i n p l a s t i c z i p l o c k b a g s . I n c i d e n t a l c o l l e c t i o n s o f h a t c h e d e g g s h e l l s ( n = 2 ) a n d f a e c a l d r o p p i n g s ( n = 3 ) w e r e m a d e . A t i s s u e s a m p l e t h a t w a s c o l l e c t e d f r o m a p r e d a t e d R J F s p e c i m e n o u t s i d e t h e s t u d y a r e a w a s u s e d a s a c o m p a r a t i v e r e f e r e n c e s a m p l e d u r i n g t h e a n a l y s i s . T h e g D N A w a s e x t r a c t e d f r o m i n d i v i d u a l f e a t h e r u s i n g Q i a g e n D N e a s y t i s s u e k i t ( Q i a g e n , G e r m a n y ) f o l l o w i n g m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l w i t h t h e f o l l o w i n g a l t e r a t i o n s : ( i ) a d d i t i o n o f 1 0 0 m g / m l D T T s o l u t i o n i n t h e l y s i s b u f f e r , ( i i ) d i g e s t i o n w a s p e r f o r m e d o v e r n i g h t a t 5 5 0 C i n a s h a k i n g w a t e r b a t h a n d a d d i t i o n o f i c e c h i l l e d e t h a n o l f o r b e t t e r p r e c i p i t a t i o n , a n d ( i i i ) D N A w a s f i n a l l y r e c o v e r e d i n 3 0 - 4 0 μ l o f e l u t i o n b u f f e r a n d s t o r e d a t - 2 0 0 C . D N A z o l B D b a s e d e x t r a c t i o n p r o t o c o l w a s u s e d t o e x t r a c t D N A f r o m b l o o d w h i l e f o r t i s s u e a n d e g g s h e l l s t h e Q i a g e n D N e a s y t i s s u e k i t ( Q i a g e n , G e r m a n y ) w a s u s e d f o l l o w i n g m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l . T h e D N A i s o l a t e d f r o m a l l t h e a b o v e s o u r c e s w e r e q u a n t i f i e d u s i n g U V - V i s i b l e s p e c t r o p h o t o m e t e r ( G e n e Q u a n t P r o , A m e r s h a m B i o s c i e n c e s ) a n d c o m p a r e d a c r o s s d i f f e r e n t s o u r c e s . M i c r o s a t e l l i t e G e n o t y p i n g I n d i v i d u a l s a m p l e s e x t r a c t e d f r o m f e a t h e r s w e r e g e n o t y p e d t w i c e f o r i n c r e a s i n g t h e e f f i c i e n c y o f t h e r e s u l t s w i t h f o u r ( C A ) n d i n u c l e o t i d e m i c r o s a t e l l i t e l o c i v i z . , M C W - 0 2 9 5 , M C W - 0 3 4 , L E I - 1 1 1 a n d L E I 1 9 2 ( S h a r m a . , 2 0 0 6 ) . P C R w a s c a r r i e d o u t i n a 1 0 μ l r e a c t i o n v o l u m e i n a n A p p l i e d b i o s y s t e m t h e r m a l c y c l e r ( 2 7 0 0 a n d 2 7 2 0 ) a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n s i s t e d 1 X P C R B u f f e r ( 5 0 m M K C l , 1 0 m M T r i s - H C l ) , 1 . 5 m M M g C l 2 , 2 0 0 µ M o f e a c h d - N T P , 1 . 2 5 µ g B S A , 4 p - m o l e o f e a c h p r i m e r , 0 . 5 u n i t o f T a q D N A p o l y m e r a s e , 5 0 t o 8 0 n g o f g D N A . P C R p r o f i l e s c o n s i s t e d o f 2 m i n i n i t i a l d e n a t u r a t i o n a t 9 4 0 C , f o l l o w e d b y 3 5 c y c l e s o f d e n a t u r a t i o n a t 9 4 0 C f o r 4 5 s e c , a n n e a l i n g a t s p e c i f i c t e m p e r a t u r e ( M C W 2 9 5 - 5 5 0 . 0 C , M C W - 1 1 1 - 6 4 . 9 0 C , L E I - 1 9 2 - 6 2 0 . 0 C , M C W - 0 3 4 - 6 4 . 9 0 C ) f o r 4 5 s e c a n d e x t e n s i o n a t 7 2 0 C f o r 2 m i n w i t h a f i n a l e x t e n s i o n f o r 1 0 m i n a t 7 2 0 C . P C R p r o d u c t s w e r e r e s o l v e d o n 2 % a g a r o s e g e l c o n t a i n i n g 3 9 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 1 : 3 8 - 4 3 M u k e s h e t a l . , 2 0 1 1

J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y M u k e s h e t a l . , 2 0 1 1 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 1 : 3 8 - 4 3 4 0 e t h i d i u m b r o m i d e ( 4 µ l / 1 0 0 m l ) . T o a v o i d c r o s s c o n t a m i n a t i o n d u r i n g p r e a n d p o s t P C R s , a l l p i p e t t i n g w e r e c a r r i e d o u t u s i n g a e r o s o l r e s i s t a n t f i l t e r p i p e t t e t i p s i n s e p a r a t e r o o m s . P a r a m e t e r s s e t f o r A n a l y s i s F o r a n a l y s i s , w e c o m p a r e d a c r o s s s a m p l i n g m e t h o d s w i t h t i m e ( e f f o r t t o o b t a i n a n d t o p r o c e s s a s a m p l e ) a n d c o s t s i n v o l v e d i n f i e l d a n d l a b . A l l t h e a s p e c t s o f c o s t a n d e f f o r t w e r e s c a l e d f r o m 1 ( l o w ) t o 1 0 ( h i g h ) . F o r t h e e f f o r t i n t h e f i e l d , t h e m i n i m u m a n d m a x i m u m t i m e t a k e n f o r a s u c c e s s f u l s a m p l e , i . e . , l i v e - t r a p p e d ( b l o o d / p l u c k e d f e a t h e r ) , s h e d f e a t h e r , f a e c a l d r o p p i n g s a n d c o l l e c t i o n o f h a t c h e d e g g s h e l l s w h i l e o p e r a t i o n a l c o s t s t h a t i n c l u d e p e r s o n n e l a n d f i e l d e x p e n d i t u r e w e r e s u m m e d a n d t h e n s c a l e d . T h i s a l s o i n c l u d e s c o l l e c t i o n o f f a e c e s w h e n t h e t r a p p e d b i r d d e f e c a t e d a n d o p p o r t u n i s t i c c o l l e c t i o n o f h a t c h e d e g g s h e l l s . T r a v e l c o s t s t o d i f f e r e n t f i e l d s i t e s w e r e n o t i n c l u d e d i n t h e a n a l y s i s . W e a v e r a g e d e f f o r t a n d c o s t s a c r o s s s i t e s f o r c o l l e c t i o n o f f i e l d s a m p l e s . S i m i l a r l y l a b o r a t o r y e f f o r t s i n c l u d e d p r o c e s s i n g o f a s a m p l e f o r m i c r o s a t e l l i t e g e n o t y p i n g ( D N A e x t r a c t i o n , g e l e l e c t r o p h o r e s i s , P C R a m p l i f i c a t i o n a n d g e n o t y p i n g ) a n d t h e c o s t i n c l u d e d p e r s o n n e l a n d t h e a p p r o x i m a t e e x p e n d i t u r e f o r p r o c e s s i n g o n e s a m p l e f o r g e n o t y p i n g b u t n o t i n c l u d i n g i n f r a s t r u c t u r e a n d e q u i p m e n t c o s t s o f t h e l a b . F i g u r e 1 G e l E l e c t r o p h o r e s i s o f e x t r a c t e d D N A a n d a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s A - G e l E l e c t r o p h o r e s i s ( 0 . 8 % a g a r o s e ) o f e x t r a c t e d D N A ( L - 1 K b D N A l a d d e r , L a n e - 1 D N A f r o m b l o o d s a m p l e , L a n e - 2 , 3 D N A f r o m t i s s u e , L a n e - 4 D N A f r o m p l u c k e d f e a t h e r , L a n e - 5 D N A f r o m s h e d f e a t h e r , L a n e - 6 D N A f r o m e g g s h e l l m e m b r a n e ) B - G e l E l e c t r o p h o r e s i s ( 2 % a g a r o s e ) o f a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s f r o m F e a t h e r s s a m p l e s ( I P C R ) ( L - 1 0 0 b p D N A l a d d e r , L a n e 1 - 1 0 P l u c k e d f e a t h e r s , L a n e 1 1 - 1 4 S h e d f e a t h e r s ) C - G e l E l e c t r o p h o r e s i s ( 2 % a g a r o s e ) o f a m p l i f i e d P C R p r o d u c t s f r o m F e a t h e r s s a m p l e s ( I I P C R ) ( L - 1 0 0 b p D N A l a d d e r , L a n e 1 - 1 0 P l u c k e d f e a t h e r s , L a n e 1 1 - 1 4 S h e d f e a t h e r s ) .