J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A l l e l o p a t h i c e f f e c t o f a q u e o u s l e a f e x t r a c t o f P a r t h e n i u m h y s t e r o p h o r u s o n g e r m i n a t i o n a n d s e e d l i n g g r o w t h o f t h e G o s s y p i u m h i r s u t u m A B S T R A C T : W e e d s a r e s o m e t i m e s c o n s i d e r e d a s u n w a n t e d p l a n t s . S o m e w e e d s r e d u c e h u m a n e f f i c i e n c y t h r o u g h p h y s i c a l d i s c o m f o r t c a u s e d b y a l l e r g i e s a n d p o i s o n i n g . W e e d s s u c h a s p a r t h e n i u m ( P a r t h e n i u m h y s t e r o p h o r u s ) a n d r a g w e e d ( L i m b r o s i a s p e c i e s ) c a u s e s e t c h i n g , h a y f e v e r a n d o t h e r d e b i l i t a t i n g a l l e r g i e s , w h i c h c o n t r i b u t e m a r k e d l y t o c h r o n i c h u m a n i l l n e s s a n d s u f f e r i n g . C o t t o n s e e d s w e r e t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f l e a f e x u d a t e s o f p a r t h e n i u m h y s t e r o p h o r u s a n d t h e b i o c h e m i c a l c o n s t i t u e n t s o f t r e a t e d c o t t o n p l a n t s w e r e a n a l y s e d . T h e p r o t e i n a n d p h e n o l w e r e f o u n d t o i n c r e a s e i n t r e a t e d p l a n t s d u e t o t h e r e l e a s e o f p r o t e a s e i n h i b i t o r s . I n a d d i t i o n t o t h i s , i n c r e a s e i n t h e a c t i v i t y o f N i t r a t e r e d u c t a s e a n d p e r o x i d a s e w e r e o b s e r v e d f o l l o w e d b y d t h e e c r e a s e d a c t i v i t y o f c a t a l a s e . T h e p l a n t s w i t h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f p h e n o l s h o w e d r e s i s t a n c e t o p e s t a n d t h e y w e r e h e a l t h y c o m p o u n d t o t h a t o f c o n t r o l l e d p l a n t s . T h e t r e a t e d p l a n t s a l s o s h o w e d s o m e m o r p h o l o g i c a l v a r i a t i o n s . I n c r e a s e i n h e i g h t w a s n o t e d i n 8 0 % t r e a t e d p l a n t s a n d t h e r e w e r e n o g r o w t h a n d d e c r e a s e i n 1 0 0 % t r e a t e d . T h i s i n h i b i t o r y e f f e c t w a s d u e t o h i g h c o n c e n t r a t i o n o f f i r s t n o t e d i n 8 0 % t r e a t e d p l a n t s . T h u s 8 0 % t r e a t m e n t w a s f o u n d t o h a v e o p t i m a l a c t i v i t y . 5 6 - 6 1 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 1 © F i c u s P r e s s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p r e s s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : * G a n g a s u r e s h P 1 , A j i t h a l B e g a m A 4 , S a r a n y a A 4 , S e n t h i l k u m a r P 2 , R a j k u m a r b h a r a t h i M 3 . I n s t i t u t i o n : * H e a d , 1 P . G . D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , S r i R a m N a l l a m a n i Y a d a v a C o l l e g e o f A r t s & S c i e n c e s , K o d i k u r i c h i , T e n k a s i – 6 2 7 8 1 1 . 2 P . G . D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , K a r p a g a m U n i v e r s i t y , C o i m b a t o r e . 3 S r i P a r a m a k a l y a n i C e n t r e f o r E n v i r o n m e n t a l S t u d i e s , M a n o n m a n i a m S u n d a r a n a r U n i v e r s i t y , A l w a r k u r i c h i – 6 2 7 4 1 2 . 4 P . G . D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , J J C o l l e g e o f A r t s & S c i e n c e s , P u d h u k o t t a i . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : G a n g a s u r e s h P E m a i l : g n g . s u r e s h @ g m a i l . c o m . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 1 3 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 0 1 M a y 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 0 4 M a y 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 1 9 M a y 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : G a n g a s u r e s h P , A j i t h a l B e g a m A , S a r a n y a A , S e n t h i l k u m a r P , R a j k u m a r b h a r a t h i M . A l l e l o p a t h i c e f f e c t o f a q u e o u s l e a f e x t r a c t o f “ P a r t h e n i u m h y s t e r o p h o r u s ” o n g e r m i n a t i o n a n d s e e d l i n g g r o w t h o f t h e “ G o s s y p i u m h i r s u t u m ” . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 1 : 5 6 - 6 1 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h p a p e r

J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y I N T R O D U C T I O N A l l e l o p a t h y r e f e r s t o t h e b e n e f i c i a l o r h a r m f u l e f f e c t s o f o n e p l a n t o n a n o t h e r , b o t h c r o p a n d w e e d s p e c i e s , r e l e a s e c h e m i c a l s f r o m p l a n t p a r t s b y l e a c h i n g , r o o t e x u d a t i o n , v o l a t i l i z a t i o n , r e s i d u e d e c o m p o s i t i o n a n d o t h e r p r o c e s s e s i n b o t h n a t u r a l a n d a g r i c u l t u r a l s y s t e m s . I t i s t h e s c i e n c e t h a t s t u d i e s a n y p r o c e s s i n v o l v i n g s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s p r o d u c e d b y p l a n t s , a l g a e , b a c t e r i a , c o r a l a n d f u n g i t h a t i n f l u e n c e s t h e g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o f a g r i c u l t u r a l a n d b i o l o g i c a l s y s t e m s . ( I A S , 1 9 6 6 ) . T h e b i o m o l e c u l e s a r e c a l l e d a l l e l o c h e m i c a l s a n d a r e p r o d u c e d b y s o m e p l a n t s a s s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s . W h e n t h e a l l e l o c h e m i c a l s a r e r e l e a s e d i n t o t h e e n v i r o n m e n t , t h e y i n h i b i t t h e d e v e l o p m e n t o f n e i g h b o u r i n g p l a n t s . A l l e l o p a t h i c p l a n t s r e l e a s e c o m p o u n d s i n t o t h e e n v i r o n m e n t t h r o u g h r o o t e x u d a t i o n , l e a c h i n g b y d e w s a n d r a i n s , a n d v o l a t i l i z a t i o n o r d e c a y i n g p l a n t t i s s u e ( R i c e , 1 9 8 4 ) . I n m o s t c a s e s , t h e c o m p o u n d s i n h i b i t , g e r m i n a t i o n o r g r o w t h o f n e i g h b o r i n g p l a n t s a l t h o u g h s o m e t i m e s t h e c o m p o u n d s s t i m u l a t e t h e i r g r o w t h . A l l e l o p a t h y i n c r o p s m a y a c t a s a b i o l o g i c a l w e e d c o n t r o l i n t h e a g r o e c o s y s t e m . T h e g e n e t i c i m p r o v e m e n t o f t h e a l l e l o p a t h i c e f f e c t i n c r o p s i s a s t r a t e g y f o r b i o l o g i c a l w e e d c o n t r o l i n b r e e d i n g p r o g r a m s . I n t h e 1 9 7 0 s , g e r m p l a s m a s s e s s m e n t w a s e x t e n s i v e l y u n d e r t a k e n t o d e t e c t a l l e l o p a t h i c a c c e s s i o n s o f c r o p s . A c c e s s i o n s w i t h a n a l l e l o p a t h i c e f f e c t h a v e b e e n f o u n d i n c r o p s s u c h a s b e e t ( B e t a v u l g a r i s L . ) , l u p i n e ( L u p i n u s l u t e n s L . ) , m a i z e ( Z e a m a y s L . ) , w h e a t ( T r i t i c u m a e s t i v u m L . ) , o a t ( A v e n a s a t i v a L . ) , p e a ( P i s u m s a t i v u m L . ) , b a r l e y ( H o r d e u m v u l g a r e L . ) , r y e ( S e c a l e c e r e a l e L . ) , a n d c u c u m b e r ( C u c u m i s s a t i v u s L . ) r e v i e w e d b y R i c e ( 1 9 8 4 ) . A t o t a l o f 5 3 8 a c c e s s i o n s o f c u l t i v a t e d a n d w i l d c u c u m b e r w e r e s c r e e n e d b y t h e p o t a n d f i e l d t e s t , s e v e r a l a c c e s s i o n s i n h i b i t e d t h e g r o w t h o f w e e d s ( P u t n a m a n d D u k e , 1 9 7 4 ) . O u t o f m o r e t h a n 3 0 0 0 a s s e s s i o n s o f o a t , s e v e r a l w e r e f o u n d w i t h a f l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e t o e x u d e a l a r g e a m o u n t o f a n a l l e l o c h e m i c a l , s c o p o l e t i n ( F a y a n d D u k e , 1 9 7 7 ) . O n e o f t h e m o s t s t u d i e d a s p e c t s o f a l l e l o p a t h y i s t h e r o l e o f a l l e l o p a t h y i n a g r i c u l t u r e . C u r r e n t r e s e a r c h i s f o c u s e d o n t h e e f f e c t s o f w e e d s o n c r o p s , c r o p s o n w e e d s , a n d c r o p s o n c r o p s . T h i s r e s e a r c h f u r t h e r s t h e p o s s i b i l i t y o f u s i n g a l l e l o c h e m i c a l s a s g r o w t h r e g u l a t o r s a n d n a t u r a l h e r b i c i d e s , t o p r o m o t e s u s t a i n a b l e a g r i c u l t u r e . W e e d s a r e a l w a y s c o n s i d e r e d a s u n w a n t e d p l a n t s ( O u d h i a , 1 9 9 8 ) . A n u m b e r o f s u c h a l l e l o c h e m i c a l s a r e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e o r i n t h e p r o c e s s o f l a r g e - s c a l e m a n u f a c t u r e . F o r e x a m p l e , L e p t o s p e r m o n e i s a p u r p o r t e d a l l e l o c h e m i c a l i n l e m o n b o t t l e b r u s h ( C a l l i s t e m o n c i t r i n u s ) . A l t h o u g h i t w a s f o u n d t o b e t o o w e a k a s a c o m m e r c i a l h e r b i c i d e , a c h e m i c a l a n a l o g o f i t , m e s o t r i o n e ( t r a d e n a m e C a l l i s t o ) , w a s f o u n d t o b e e f f e c t i v e . T h e p r e s e n t s t u d y a i m s t o i n v e s t i g a t e t h e s e e d g e r m i n a t i o n a n d g r o w t h o f c o t t o n s e e d s w h i c h w e r e t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f t h e l e a f e x u d a t e s o f P a r t h e n i u m h y s t e r o p h o r u s a t 2 0 % , 4 0 % , 6 0 % , 8 0 % , a n d 1 0 0 % . T h i s i n v e s t i g a t i o n i s p r o c e e d e d f o r t h e f u t u r e p r o s p e c t o f a l l e l o p a t h y . T h i s m a y d e v e l o p t h e l e g u m e c r o p s w i t h h i g h b i o l o g i c a l N 2 f u n c t i o n p o t e n t i a l a n d l e a s t i n h i b i t o r y e f f e c t s o n c o m p o n e n t s c r o p s i n i n t e r c r o p p i n g s y s t e m s a n d o n s u c c e e d i n g c r o p s i n c r o p r e l a t i o n s . G r e e n h e r b i c i d e s c o n t a i n i n g G r e e n A l l e l o c h e m i c a l s a r e a n i n t e g r a l p a r t o f e c o o r o r g a n i c f a r m i n g . U s e o f n a t u r a l c o m p o u n d s a s h e r b i c i d e s o r a s t h e c h e m i c a l b a s i s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f n e w h e r b i c i d e s o f f e r s s e v e r a l a d v a n t a g e s . 1 . T h e w i d e a r r a y o f p h y t o t o x i c c o m p o u n d s p r o d u c e d b y p l a n t s p r o v i d e m a n y c o m p l e x c h e m i c a l s t r u c t u r e t h a t a r e u n l i k e l y t o b e d i s c o v e r e d i n t h e t r a d i t i o n a l s y n t h e t i c s t r a t e g i e s u s e d b y p e s t i c i d e s c o m p a n i e s . 2 . D e g r a d a t i o n o f n a t u r a l c o m p o u n d s i n t h e e n v i r o n m e n t p r o c e e d s f a s t e r t h a n t h a t o f s y n t h e t i c c o m p o u n d s a n d t h u s r e d u c e s t h e e n v i r o n m e n t p o l l u t i o n a n d g r o u n d w a t e r c o n t a m i n a t i o n e t c . , 3 . T h e h a l o g e n a t e d h y d r o c a r b o n w h i c h c o n s t i t u t e a b o u t 6 0 % o f t h e r e g i s t e r e d h e r b i c i d e s a r e o f e n v i r o n m e n t a l c o n c e r n , w h i l e v a s t m a j o r i t y o f n a t u r a l c o m p o u n d s f r o m p l a n t p o s e l i t t l e h a z a r d s a n d t h e r e f o r e , a r e e n v i r o n m e n t a l l y s a f e . T h e n e g a t i v e ( s t i m u l a t o r y ) a l l e l o p a t h i c e f f e c t s o f w e e d s o n a g r i c u l t u r a l c r o p s c a n b e u s e d t o d e v e l o p “ G r e e n g r o w t h p r o m o t e r s ” . M a n y s t u d i e s c o n d u c t e d a t d e p a r t m e n t o f A g r o n o m y , I n d i r a G a n d h i A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , R a i p u r , I n d i a ) h a v e c l e a r l y r e v e a l e l d t h a t s t i m u l a t o r y a l l e l o p a t h i c e f f e c t s w e e d s o n c r o p s c a n b e u t i l i z i e d s u c c e s s f u l l y f o r h i g h e r c r o p p r o d u c t i o n . W e e d s r e d u c e s h u m a n e f f i c i e n c y t h r o u g h p h y s i c a l c o m f o r t c a u s e d b y a l l e r g i e s a n d p o i s o n i n g . W e e d s s u c h a s P a r t h e n i u m a n d r a g w e e d ( A m b r o s i a s p e c i e s ) t h a t c a u s e e t c h i n g , h a y f e v e r , a n d o t h e r d e b i l i t a t i n g a l l e r g i e s c o n t r i b u t e m a r k e d l y t o c h r o n i c h u m a n i l l n e s s a n d s u f f e r i n g . S o o b j e c t i v e o f t h e p r e s e n t s t u d y i s t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f a q u e o u s l e a f e x t r a c t o f p a r t h e n i u m h y s t e r o p h o r o u s o n 5 7 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 1 : 5 6 - 6 1 G a n g a s u r e s h e t a l . , 2 0 1 1

J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y g e r m i n a t i o n , s e e d l i n g g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o f c o t t o n p l a n t ( G o s s y p i u m h i r s u t u m ) . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S M a t e r i a l s : G o s s y p i u m h i r s u t u m ( C o t t o n ) V i a b l e s e e d s o f c o t t o n w e r e s e l e c t e d . T h e s e e d s w e r e s u r f a c e s t e r i l i z e d w i t h 0 . 1 % M e r c u r i c C h l o r i d e f o r 2 m i n u t e s . I t w a s t h e n w a s h e d w i t h t a p w a t e r t h r i c e a n d d i s t i l l e d w a t e r t w i c e . P a r t h e n i u m h y s t e r o p h o r u s P o t M i x t u r e s R e d s o i l , B l a c k s o i l a n d d r y m a n u r e i n t h e r a t i o 1 : 2 : 1 . A q u e o u s l e a f e x t r a c t o f P a r t h e n i u m h y s t e r o p h o r u s . M e t h o d o l o g y : T h e s t e r i l i z e d s e e d s w e r e s o w n i n r e s p e c t i v e p o t s . T h e p l a n t s a m p l e s w e r e t a k e n a t 6 r a n g e s f r o m a l l t h e t r e a t m e n t s c o r r e s p o n d i n g t o g e r m i n a t i o n s t a g e . C o n t r o l w a s m a i n t a i n e d w i t h o u t a d d i n g t h e l e a f e x t r a c t o f p a r t h e n i u m h y s t e r o p h o r u s . F i v e T r e a t m e n t s w e r e m a d e i n r e m a i n i n g f i v e p o t s . T h e l e a f e x t r a c t w a s t r e a t e d i n t h e s e e d o f G o s s y p i u m h i r s u t u m i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f 2 0 % , 4 0 % , 6 0 % , 8 0 % a n d 1 0 0 % ( P i c t u r e 2 - 5 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n w a s m a d e b y d i l u t i n g w i t h w a t e r . P e r c e n t a g e o f G e r m i n a t i o n H e a l t h y s e e d s w e r e s o w n i n l a n d a n d t r e a t e d w i t h c o m p o s t e d m y c o s t r a w . T h e s e e d s w e r e c o n s i d e r e d t o b e g e r m i n a t e d o n l y w h e n t h e r a d i c l e e m e r g e n c e w a s m o r e t h a n 1 . 0 c m . T h i s w a s c o n s i d e r e d a s t h e f i r s t d a y o f g e r m i n a t i o n p e r c e n t a g e . T h e g e r m i n a t i o n p e r c e n t a g e w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e f o r m u l a : T o t a l N u m b e r o f s e e d s g e r m i n a t e d G e r m i n a t i n g p e r c e n t a g e = X 1 0 0 . T o t a l n u m b e r o f s e e d s s o w n T h e s e e d g e r m i n a t i o n o f G o s s y p i u m h i r s u t u m w a s d e t e r m i n e d ( P i c t u r e - 1 ) i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f ( 2 0 % , 4 0 % , 6 0 % , 8 0 % a n d 1 0 0 % ) . P a r a m e t e r s A n a l y s i s : A s s a y o f N i t r a t e R e d u c t a s e : 5 m l o f 0 . 1 M P h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) t o t h e f r e s h l y c u t l e a v e s , f o l l o w e d b y t h e a d d i t i o n o f 1 m l o f P o t a s s i u m n i t r i t e a n d 4 m l o f P r o p a n a l a n d i n c u b a t e d i n d a r k f o r 3 0 m i n u t e s . T h e c o n s t i t u e n t s o m i t t i n g p l a n t t i s s u e s w e r e k e p t a s c o n t r o l . T h e 1 m l o f s a m p l e f r o m t e s t a n d c o n t r o l s o l u t i o n w a s t a k e n w i t h d i f f e r e n t a l i q u o t s o f p o t a s s i u m n i t r i t e i n t o a s e r i e s o f t e s t t u b e s . T h e s o l u t i o n w a s m a d e u p t o 1 m l w i t h w a t e r . T h e n 1 m l o f 1 % S u l p h a n i l a m i d e a n d 1 m l o f N E D A w a s a d d e d t o a l l t h e t e s t t u b e s . A f t e r 1 0 m i n u t e s r e a d i n g w a s n o t e d a t t h e a b s o r b a n c e o f 5 4 0 n m . A s s a y o f C a t a l a s e : 1 0 0 m l o f p h o s p h a t e b u f f e r f r o m t h e c o n i c a l f l a s k w a s p i p e t t e d o u t a n d 0 . 4 m l o f s u b s t r a t e i n t o e a c h f l a s k w e r e a d d e d . T o o n e o f t h e f l a s k 0 . 5 m l o f t h e e n z y m e e x t r a c t w a s a d d e d a n d i n c u b a t e d f o r 1 5 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . A f t e r 1 5 m i n u t e s 1 0 m l o f 2 N H 2 S O 4 w a s a d d e d t o b o t h c o n t r o l a n d t e s t f l a s k s . T h e n t h e c o n t e n t s a g a i n s t 0 . 0 1 N K m n o 4 o n e b y o n e w a s t i t r a t e d . D i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e v a l u e s g i v e t h e v o l u m e o f p e r m a n g a n a t e e q u i v a l e n t t o e n z y m a t i c a c t i v i t y . A s s a y o f P e r o x i d a s e : O n e m i n u t e f i x e d t i m e a s s a y i s u s e d t o m e a s u r e p e r o x i d a s e a c t i v i t y . T w o c u v e t t e s w e r e t a k e n f o r b l a n k a n d s a m p l e . 2 . 5 m l o f a m i n o a n m t i p y r i n e - p h e n o l s o l u t i o n a n d 2 . 5 m l o f H 2 O 2 w a s a d d e d a n d a b s o r b a n c e w a s r e a d e d . T h e n 0 . 1 m l o f e n z y m e e x t r a c t i n t h e o t h e r c u v e t t e w a s t a k e n f o r t h e a b s o r b a n c e . T h e t i m e w a s n o t e d e x a c t l y f o r o n e m i n u t e t o r e a d t h e a b s o r b a n c e o f t h e s a m e c u v e t t e . T h e a c t i v i t y o f t h e p e r o x i d a s e c a n b e c a l c u l a t e d f r o m t h e a b s o r b a n c e c h a n g e . ∆ A / m i n n i t / m g = 6 . 5 8 X m g o f t h e s a m p l e . ∆ A = A 1 m i n u t e - A 0 m i n u t e W h e r e , A = O v e r a l l a b s o r b a n c e c h a n g e A 1 m i n u t e = A b s o r b a n c e a t 5 1 0 n m a f t e r 1 m i n u t e s A 0 m i n u t e = A b s o r b a n e a t 5 1 0 n m a f t e r 0 t i m e . E s t i m a t i o n o f C h l o r o p h y l l : 1 g r a m o f f i n e l y c u t a n d w e l l m i x e d r e p r e s e n t a t i v e s a m p l e o f l e a f w a s w e i g h e d a n d g r i n d e d t o a f i n e p u l p w i t h t h e a d d i t i o n o f 2 0 m l o f 8 0 % a c e t o n e . I t w a s c e n t r i f u g e d a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s t r a n s f e r r e d t o 1 0 0 m l v o l u m e t r i c f l a s k . T h e r e s i d u e w a s g r i n d e d w i t h 2 0 m l o f 8 0 % a c e t o n e . A g a i n c e n t r i f u g e d a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s t r a n s f e r r e d t o t h e s a m e v o l u m e t r i c f l a s k . T h i s p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d u n t i l t h i s r e s i d u e b e c o m e s c o l o u r l e s s . T h e a b s o r b a n c e w a s r e c o r d e d a t 6 4 5 n m a g a i n s t t h e s o l v e n t ( 8 0 % a c e t o n e ) b l a n k . V m g c h l o r o p h y l l a / g t i s s u e = 1 2 . 7 ( A 6 6 3 ) – ( A 6 4 5 ) X 1 0 0 0 X w V m g c h l o r o p h y l l b / g t i s s u e = 2 2 . 9 ( A 6 4 5 ) – 4 . 6 8 ( A 6 6 3 ) X 1 0 0 0 X w G a n g a s u r e s h e t a l . , 2 0 1 1 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 1 : 5 6 - 6 1 5 8